Name: Análisis de los trisacáridos de leche Fucosylated humanos en contexto biotecnológico mediante genéticamente codifican en biosensores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Aprende a detectar oligosacáridos de leche humana fucosilados mediante biosensores de células completas en E. coli. Este método de alto rendimiento permite cuantificar HMOs con especificidad de enlace y mejorar la producción de fórmulas infantiles.

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Este trabajo fue financiado por el estado de Iowa Universidad Inicio fondos. F.E. fue parcialmente financiado por la NSF Trinect compañerismo y Manley Hoppe Cátedra. T.J.M. fue apoyada parcialmente por la Karen y Denny Vaughn Facultad beca. Los autores agradecen a la instalación de citometría de flujo de Iowa estado Universidad y el laboratorio de investigación de Metabolómica de W.M. Keck para la asistencia con fluorescencia y LC-MS estudios.

1. célula cultura, condiciones de inducción
Nota: En los experimentos siguientes, se utilizan tres cepas: e. coli BL21 (DE3) con un vector vacío, e. coli BL21 (DE3) con plásmidos pAfcA14 y pET28:green proteínas fluorescentes (GFP) y e. coli BL21 (DE3) con los plásmidos pAfcB14 y pET28:GFP. Todas las cepas se cultivan en caldo Luria-Bertani (LB) o los medios mínimos con los antibióticos apropiados. Preparar las soluciones madre de kanamicina x 1.000 (50 mg/mL) y carbenicilina (100 mg/mL) desionizada (DI) agua.
<ol><li>
Preparación de medios de comunicación
	<ol>
<li>Preparar los medios LB añadiendo 25 g de LB caldo de polvo para 1 L de agua desionizada. Autoclave 121 ° C durante 20 minutos esterilizar la solución. Espere hasta que la temperatura media en LB esterilizada es inferior a 60 ° C antes de añadir 1 μl del stock de antibióticos por cada 1 mL de medio LB.</li>
		<li>Para preparar placas LB, añadir agar 15 g a los medios de comunicación de libras antes de la esterilización. Espere hasta que la temperatura de agar LB esterilizada es inferior a 60 ° C antes de la adición de antibiótico.</li>
		<li>1.1.3 para las células de biodetección, preparar placas con dos antibióticos y kanamicina, carbenicilina o los medios de comunicación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inductores de hidratos de carbono
	<ol>
<li>Preparar las soluciones madre de los inductores de hidratos de carbono en molares equivalentes a 20 g/L de lactosa: 29 g/L de FL 2' y 3-FL. Nota: Cada 200 μL de células requieren 20 μl de la 2'-FL o 3-FL.</li>
		<li>Inducir a 200 μL de células con concentración final de 2,0 g/L de lactosa o 2,9 g/L de concentración final de 2'-FL/3-FL. incubar a 37 ° C con agitación continua y deje las culturas crecen durante la noche.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cultivo de células
	<ol>
<li>El día antes del experimento de la semilla 5 mL de medio LB con kanamicina y carbenicilina de una fresca Colonia bacteriana, utilizando una técnica estéril.</li>
		<li>Incubar los cultivos a 37 ° C con agitación y crecen los cultivos durante la noche.</li>
		<li>Transferir 50 μl del cultivo durante la noche en 5 mL de medio de LB/M9 fresco con kanamicina y carbenicilina. Incubar a 37 ° C con agitación continua y crecer hasta que la cultura ha alcanzado la densidad óptica a 600 nm (OD600) de 0,5 a 0,7. En esta fase de registro medio, se pueden inducir las células.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. medición de la fluorescencia y límites de detección
<ol><li>
Preparación de células por citometría de flujo
	<ol>
<li>Transferencia de los cultivos durante la noche para tubos de 1.5 mL y centrifugar a 12.500 x g durante 1 minuto.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en 500 μl de salina de 1 x de tampón fosfato (PBS; 6 mM Na2HPO4, 1,8 mM NaH2PO4, 145 mM de NaCl en agua desionizada, pH 7.2) para preparar una suspensión unicelular y transferencia de la célula suspensión a tubos de citómetro de flujo de 5 mL.</li>
		<li>Mantener las células en la oscuridad a 4 ° C hasta correr las muestras en un citómetro de flujo. Para mejores resultados, analizar las células tan pronto como sea posible.</li>
		<li>Seleccione 488 nm láser para excitar GFP. Recoger niveles de fluorescencia fluoresceína isotiocianato (FITC) (20.000 – 40.000 eventos, cerradas de dispersión hacia delante y lateral evitar desechos y agregadas células) con un filtro de paso de banda de 525/50 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Calibrar el biosensor
	<ol>
<li>Para hacer una curva de calibración, hacer diluciones de 8 a 10 de la norma 2'-FL en el rango 0 – 2.500 mg/L.</li>
		<li>Las células de biodetección de 2'-FL (contiene pAfcA y pET28:GFP) de la cultura e inducirlos con las diluciones estándar, como se describe anteriormente en la sección 1.3. Realizar tres réplicas biológicas para cada dilución.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. detección y cuantificación de 2'-FL en una cepa productora
<ol><li>
Cultivo de la cepa productora
	<ol>
<li>Para hacer mínimo media, preparar soluciones separadas de 1 M K2HPO4, FeSO4·7H2O, citrato de sodio y 1 M tiamina-HCl. esterilizar las soluciones usando un filtro de 0,22 μm. Mezclar media M9 polvo de caldo con 1 L de agua desionizada. Autoclave de la solución de M9 a 121 ° C durante 15 minutos enfriar la solución hasta 50 ° C. Agregar MgSO4, CaCl2, K2HPO4, FeSO4·7H2O, citrato de sodio, tiamina a concentración final de 2 mM, 0,1 mM, 12 g/L, 11 mg/L, 75 mg/L y 7.5 μg/L, respectivamente.</li>
		<li>Iniciar una cultura de la 2'-FL produciendo tensión, por ejemplo, JM109 gwBC-F2, en 5 mL de medio LB y dejarlo crecer durante la noche a 37 ° C, como se describe en Baumgartner et al12.</li>
		<li>Subcultura en el 1% como se describe anteriormente en el paso 1.3.3 en 250 mL de los mínimos medios preparados en paso 3.1.1. Agregar glicerol a una concentración final de 10 g/L e incubar el cultivo a 37 ° C.</li>
		<li>Cuando el cultivo alcanza un OD600 de 0.5 – 0.7, añadir isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 0,5 mM y lactosa a una concentración final de 2 g/L.</li>
		<li>Incubar a 37 ° C con agitación continua y dejar que las culturas crecen durante 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Extracción de 2'-FL
	<ol>
<li>Transferencia de los cultivos durante la noche a tubos estériles de 50 mL y centrifugar a 900 x g durante 15 minutos.</li>
		<li>3.2.2 descartar sobrenadante y Resuspenda el sedimento en agua desionizada. Repetir el lavado tres veces para eliminar la lactosa residual y finalmente resuspender en 5 mL de agua desionizada.</li>
		<li>Para lisar la suspensión de células, utilice un sonicador en el 30% de energía, en pulsos de s 30. Mantener las células en hielo en todo momento.</li>
		<li>Centrifugar las células sometidas a lisis por 25 min a 2.000 x g. Eliminar el sobrenadante, pasar por un estéril (p. ej., 0.22 μm) filtrar y almacenar a 4 ° C hasta su análisis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cuantificación con biosensor
	<ol>
<li>Sembrar una cultura de células de biodetección de 2'-FL y en fase logarítmica media, inducir con equivalente lisado de célula a concentraciones aproximadamente de 2'-FL utilizado para hacer la curva de calibración como se describe en la sección 2.2. Realice la calibración en el mismo medio que la muestra a analizar (por ejemplo, lisado de célula) mediante la adición de las diluciones de 2'-FL para controlar (es decir, no productor) lisado antes de inducir células biosensor filtrado celular.</li>
		<li>Ejecutar las muestras en un citómetro de flujo. Generar una curva dosis-respuesta mediante el trazado de la salida de fluorescencia contra la concentración de oligosacáridos. Comparar la respuesta de los estándares para el lisado celular.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. selectiva eliminación de lactosa
Nota: Las células de biodetección son sensibles a la lactosa y es deseable que el biosensor detectar selectivamente las HMO en lactosa. Una estrategia incluye lavado de células como se describe en la sección 3.2. Tres otras estrategias se describen a continuación.
<ol><li>
Tratamiento con β-galactosidasa purificada comercial
	<ol>
<li>Disolver el liofilizado β-galactosidasa a 1.000 (lactasa FCC) unidades/mL, 1 mm MgCl2 o uso comercial de β-galactosidasa en solución.</li>
		<li>Para determinar la concentración óptima de enzima necesaria, crecer un inóculo de 2'-FL biosensores células e inducir con lactosa 2 g/L y 2,9 g / L 2'-FL en fase logarítmica media.</li>
		<li>A las culturas de μl 100, añadir cantidades variables de β-galactosidasa, hasta 12 unidades y dejar las culturas crecen durante la noche a 37 ° C con agitación continua.</li>
		<li>Medir la fluorescencia como se describe en la sección 2.1 y calcular las unidades óptimas de enzima necesaria en la determinación de la concentración de enzima mínima para lograr la deseada atenuación de señal.</li>
		<li>2'-FL produciendo las células cultivadas por 24 h, añadir unidades óptimas de la β-galactosidasa e incubar durante una noche a 37 ° C. Proceder con el protocolo para la determinación de la concentración de 2'-FL como se describe en la sección 3.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tratamiento previo con LacZ + cepa
	<ol>
<li>Iniciar una cultura de 25 mL de 2'-FL produciendo tensión y una vez inducida en la fase de registro medio, incubar el cultivo a 37 ° C durante 24 h.</li>
		<li>Inocular una e. coli BL21 (DE3) cultura en LB, crecer a la fase de registro medio a 37 ° C y añadir 50 mL del cultivo (2:1) a la cultura de 24 h.</li>
		<li>Incubar a 37 ° C por 3 h. proceda con el protocolo para la determinación de la concentración de 2'-FL como se describe en la sección 3.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Precipitación de lactosa con etanol Nota: Esta sección está adaptada de agudo et al12.<ol>
<li>Iniciar una cultura de 25 mL de 2'-FL produciendo tensión y una vez inducida en la fase de registro medio, incubar a 37 ° C durante 24 h.</li>
		<li>Añadir dos volúmenes de etanol al 100% a la cultura, agite bien e incubar a 37 ° C por 4 h.</li>
		<li>Centrifugar la suspensión a 900 x g durante 15 minutos recoge el sobrenadante e incubar durante una noche a 4 ° C, que se precipita la lactosa.</li>
		<li>Eliminar la lactosa precipitada pasando la solución a través de un filtro de papel (11 μm). Recoger el filtrado que es la célula que contiene el 2'-FL, que puede ser cuantificada por el siguiente artículo 3.3 lisada.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ninonuevo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+for+annotating+the+human+milk+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A strategy for annotating the human milk glycome.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (20), 7471-7480 (2006).</li>
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<li>Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+targeted+LC-ESI-MS2+analysis+of+human+milk+oligosaccharides+%28HMOs%29+and+related+human+milk+groups+with+enhanced+structural+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 231-250 (2019).</li>
<li>Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determination+of+novel+lacto-N-decaose+and+its+monofucosylated+analogue+from+human+milk+by+electrospray+tandem+mass+spectrometry+and+1H+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 434 (1), 116-127 (2005).</li>
<li>Baumgärtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+strains+with+chromosomally+integrated+expression+cassettes+for+the+synthesis+of+2%E2%80%99-fucosyllactose%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2’-fucosyllactose.</a> Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-13 (2013).</li>
<li>Matsuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+key+genetic+factor+for+fucosyllactose+utilization+affects+infant+gut+microbiota+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development.</a> Nature Communications. 7, 11939(2016).</li>
<li>Enam, F., Mansell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage-Specific+Detection+and+Metabolism+of+Human+Milk+Oligosaccharides+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli.</a> Cell Chemical Biology. 25 (10), 1292-1303 (2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Presentamos una estrategia de alto rendimiento para la detección de acoplamiento específicos de fucosylated oligosacáridos de leche humana. Esto se logró mediante la construcción de biosensores de célula entera por ingeniería genética de e. coli que en inducción con glycans específicas responden con una señal fluorescente. El protocolo también detalles sobre cómo se puede utilizar el biosensor para detectar y cuantificar las HMO en una cepa bacteriana metabólicamente ingeniería.
Nuest...

Oligosacáridos de leche humana (HMO) son oligosacáridos derivados de la lactosa, generalmente formado por monómeros de azúcar de tres a ocho. Tienen una reducción de la lactosa (Gal-β1, 4-Glc) final y son más alargadas por enlaces glicosídicos (β-1, 3 - o β-1, 6-) glucosa (Glc), galactosa (Gal) o N-acetilglucosamina (GlcNAc). Además, fucosa (Fuc, α-1, 2 - o α-1, 3-) o ácido siálico (Sia o NeuAc, 2,6 2,3 α o α-) residuos a menudo se añaden1.
Análisis actual de oligosacáridos y otros hidratos de carbono es limitado en alcance y rendimiento por la necesidad de cromatografía/masa espectrométrica (MS) tecnología2,3,4,5, 6 , 7, que puede tomar aproximadamente una hora por muestra, sin dejar de mencionar la necesidad de equipo costoso, columnas especializadas y agentes derivatizando y conocimientos sobre el funcionamiento de este equipo8. Vínculos de oligosacáridos son particularmente difíciles de determinar, requiriendo avanzado MS9,10 o técnicas de resonancia magnética nuclear (RMN)11. Optimización rápida de la síntesis de estos oligosacáridos está así limitada por el rendimiento de este lento paso analítico.
En este estudio, demostramos la detección de acoplamiento específicos de trisacárido fucosylated HMO basada en lactosa, centrándose en 2'-fucosyllactose (2'-FL) que es la HMO más abundante en la leche humana, usando un codificado genéticamente células enteras de Escherichia coli biosensor con un límite de detección en 4 mg/L. Una característica importante de este biosensor es su capacidad para distinguir entre trisacáridos isoméricos. El principio de diseño se basa en la expresión de la específica fucosidases en e. coli que liberar lactosa de HMO, la presencia de la cual es detectada por el operón lac , que a su vez genera una señal fluorescente. Logramos esto mediante la construcción de un sistema de dos plásmidos, uno que el fucosidase específicos de acoplamiento y el otro una proteína fluorescente reportera. Esta plataforma de biosensores es adecuada para el cribado de alto rendimiento por citometría de flujo o lector de micro placas. Nos demuestran también la utilización del biosensor en la cuantificación de 2'-FL producida por una cepa ingeniería12. Dentro de este estudio, también presentamos tres estrategias de eliminación selectiva de lactosa que puede dar lugar a falsa señal positiva de los biosensores, dado que se cultiva la cepa productora Ingeniería en lactosa.
Tomados en conjunto, los biosensores genéticamente codificados permiten detectar y cuantificar las HMO de una manera específica de acoplamiento, que es difícil incluso con cromatografía, MS y NMR técnicas. Debido a su alto rendimiento y facilidad de uso, este método debe tener aplicaciones generalizadas en la ingeniería metabólica y la síntesis de las HMO.

<table><tbody><tr><td>2'-Fucosil-lactosa&nbsp;</td><td>Carbosynth&nbsp;</td><td>41263-94-9</td><td></td></tr><tr><td>3-Fucosil-lactosa&nbsp;</td><td>Carbosynth&nbsp;</td><td>41312-47-4</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9744500 Cloruro</td><td></td></tr><tr><td>de calcio, dihidrato</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26481</td><td></td></tr><tr><td>dextrosa (D-glucosa), anhidra</td><td>Citómetro</td><td>de flujo Fisher Scientific D16-1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td></td><td>FACSCanto Plus RUO</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>1100 Series Sistema de HPLC</td></tr><tr><td>Columna de HPLC</td><td>Luna</td><td></td><td>C18 columna de fase reversa</td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>11815024</tr><tr><td>Caldo LB, Miller &nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-795-027</td><td></td></tr><tr><td>Lactosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>64044-51-5</td><td></td></tr><tr><td>M9, Sales mínimas, 5x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6030</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio, anhidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>Trampa selectiva de masa Detector</td></tr><tr><td>SL Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13472-35-0</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de los trisacáridos de leche fucosylated humanos en contexto biotecnológico mediante genéticamente codifican en biosensores

Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors

Oligosacáridos de leche humana (HMO) son componentes de hidratos de carbono complejos de la leche materna humana que exhiben abundantes beneficios en la salud infantil. Sin embargo, optimización de su síntesis biotecnológica está limitada por el relativamente bajo rendimiento de detección y cuantificación de monosacárido y vínculos. Las técnicas convencionales de análisis de glicanos incluyen cromatografía/masa-spectrometric métodos con capacidad de producción del orden de cientos de muestras por día sin automatización. Aquí, demostramos un biosensor bacteriano genéticamente codificado para la detección de alto rendimiento, específicos de acoplamiento y cuantificación de las estructuras de fucosylated HMO, 2'-fucosyllactose y 3-fucosyllactose, que logramos mediante heteróloga expresión de fucosidases. Como la presencia de lactosa en leche o en procesos biotecnológicos podría llevar a falsos positivos, demostramos también la reducción de la señal de lactosa utilizando diferentes estrategias. Debido al alto rendimiento de esta técnica, podrían ensayarse muchas condiciones de la reacción o parámetros de biorreactor en paralelo en cuestión de horas, lo que permite la optimización de la fabricación de HMO.

Hemos diseñado un biosensor de toda célula específico 2'-FL que pueden utilizarse en conjunción con la producción biotecnológica de los oligosacáridos. Esto se basa en la ruptura enzimática específica de modificar azúcares terminales generadoras de lactosa y de tal modo la activación de la lac operón, conduce a la expresión de una proteína fluorescente de reportero bajo un promotor inducible de la lactosa, proporcionalmente a la cantidad de 2' de FL. Para demostrar su especificid...

Describimos aquí el alto rendimiento detección y cuantificación de fucosylated oligosacáridos de leche humana (HMO) utilizando un biosensor de célula entera. También demostramos aquí, la adaptación de esta plataforma hacia análisis de cepas de producción de HMO, centrándose en mejorar la relación señal a ruido.

Análisis de los trisacáridos de leche Fucosylated humanos en contexto biotecnológico mediante genéticamente codifican en biosensores

Human milk oligosaccharides (HMOs) are complex carbohydrate components of human breast milk that exhibit plentiful benefits on infant health. However, ...

Este método puede ayudar a responder a varias preguntas clave involucradas en la producción de oligosacáridos de leche humana. En primer lugar, ¿cuánto del producto tengo? Y en segundo lugar, ¿cuál es la vinculación específica de carbohidratos?El objetivo aquí es simplificar y acelerar el proceso de cuantificación y caracterización de estos oligosacáridos de leche humana. Este método tiene dos ventajas sobre el estado actual de la técnica. En primer lugar, es susceptible de detección de alto rendimiento.Por lo tanto, usted puede imaginar probar miles de condiciones diferentes o tal vez incluso una biblioteca de enzimas de síntesis en un día utilizando esta técnica. Además, utiliza la especificidad única del sustrato que la naturaleza ha evolucionado en enzimas para darnos información sobre la vinculación de carbohidratos de esos oligosacáridos. Creemos que este método puede mejorar la producción de oligosacáridos de leche humana, lo que a su vez puede conducir a una fórmula infantil de mejor calidad que imita más estrechamente la leche materna humana y ayudar a cerrar la brecha entre los bebés alimentados con leche materna y alimentados con fórmula.Se recomienda la discreción del u

analysis-fucosylated-human-milk-trisaccharides-biotechnological

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

En este estudio, se describe un protocolo mejorado para una micromatriz anticuerpo multiplexado de alto rendimiento con el método de detección de lectina que se puede utilizar en perfiles de glicosilación de proteínas específicas. Este protocolo incluye nuevos reactivos fiables y reduce significativamente el tiempo, el coste y los requisitos de equipos de laboratorio, en comparación con el procedimiento anterior.

Anticuerpos, químicamente bloqueado Microarray de multiplexado de alto rendimiento de perfiles de glicosilación de proteínas específicas en muestras complejas

Comienza con un cultivo de biosensores bacterianos suspendido en un medio.Estas bacterias modificadas producen un factor de transcripción que, al unirse a un metabolito fecal específico, activa un promotor asociado a un gen reportero fluorescente.A este cultivo, añade una muestra hecesal humana filtrada que contenga metabolitos, como el lactato, que participan en las interacciones huésped-microbioma.Diluye esta mezcla con un medio fresco para mantener un volumen de reacción óptimo.Incuba sin...

Detección de metabolitos fecales humanos mediante un biosensor bacteriano

Se presenta una descripción de cómo calibrar Transferencia Förster Resonance Energy sensores biológicos integrados (FIBS) en el perfil metabólico situ. Los FIBS se pueden utilizar para medir los niveles intracelulares de metabolitos de forma no invasiva ayudando en el desarrollo de modelos metabólicos y cribado de alto rendimiento de las condiciones de bioprocesos.

FIBS habilitadas no invasiva perfiles metabólicos

Presentamos un método modular automatizado de alto rendimiento para la identificación y caracterización de exopolisacáridos microbianos a pequeña escala. Este método combina una preselección rápida para analizar la cantidad total de polisacáridos secretados con una huella digital detallada de carbohidratos para permitir el cribado rápido de cepas bacterianas recién aisladas o colecciones completas de cepas.

Plataforma modular de selección automatizados de alto rendimiento de exopolisacáridos Junto con el análisis de carbohidratos de la huella digital de alta sensibilidad

Este protocolo describe la cuantificación rápida y altamente sensible de Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) datos de sensor utilizando un analizador de FRET portátil a medida. El dispositivo se utilizó para detectar la maltosa dentro de un rango de temperatura crítico que maximiza la sensibilidad de detección, lo que permite la evaluación práctica y eficiente de contenido de azúcar.

Altamente sensible y rápido de detección de fluorescencia con un analizador portátil de FRET

Ácido siálico es una típica unidad de monosacárido encontrada en glicoconjugados. Participa en una gran cantidad de interacciones moleculares y celulares. Aquí presentamos un método para modificar la expresión de superficie ácido siálico celular con glycoengineering metabólico derivados de N- acetylmannosamine.

Glycoengineering metabólico del ácido siálico utilizando N-acil-modificado Mannosamines

Se ha descrito un protocolo detallado para la purificación y posterior análisis posterior de un anticuerpo monoclonal a partir del fluido de cultivo celular cosechado (HCCF) de microbiorreactores automatizados. También se presenta el uso de análisis para determinar los atributos de calidad críticos (CQA) y maximizar el volumen de muestra limitado para extraer información vital.

Purificación y análisis de un anticuerpo monoclonal de células de ovario de hámster chino utilizando un sistema automatizado de microbiorreactores

Anteriormente se desarrolló un sistema para el análisis automatizado y rápido de glicanos en proteínas. Este artículo presenta el protocolo para el "análisis glicocualitativo", optimizado para un amplio espectro de usuarios, como los que se dedican al análisis de estructuras de glicanos en biofarmacéuticos y otros materiales glicoconjugados.

Evaluación glicocualitativa rápida de proteínas recombinantes mediante un sistema totalmente automatizado

Estudios recientes ponen de relieve el papel de las enzimas de la microbiota intestinal humana en el metabolismo de los glucósidos C. Aquí, presentamos una metodología integral que integra técnicas de química analítica (LC-MS/MS y RMN) con enfoques de biología estructural para caracterizar sistemáticamente las cadenas de reacción estructurales y enzimáticas de estas enzimas metabolizadoras de glucósidos C.

Enfoques de biología estructural y química analítica para caracterizar las enzimas metabólicas de glucósidos C en la microbiota intestinal humana

Este protocolo presenta un flujo de trabajo estándar de cribado de alto rendimiento para microorganismos industriales. Consiste en construir una biblioteca mutante mediante mutagénesis ARTP, realizar cribado positivo de gotas con microfluidica automatizada y, posteriormente, verificar los resultados. La fiabilidad del flujo de trabajo se validó mediante el cribado de cepas de B. coagulans de alto rendimiento.

Cribado de alto rendimiento de mutantes de Bacillus coagulans hiperproductores de ácido L-láctico utilizando una plataforma microfluídica automatizada de gotas

Aprende a detectar oligosacáridos de leche humana fucosilados mediante biosensores de células completas en E. coli. Este método de alto rendimiento permite cuantificar HMOs con especificidad de enlace y mejorar la producción de fórmulas infantiles.

Análisis de los trisacáridos de leche Fucosylated humanos en contexto biotecnológico mediante genéticamente codifican en biosensores (Video) | JoVE Journal

Análisis de los trisacáridos de leche Fucosylated humanos en contexto biotecnológico mediante genéticamente codifican en biosensores

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