Análisis de complejos de cadena respiratoria mitocondrial en células humanas cultivadas usando electroforesis en Gel de poliacrilamida nativo azul e Immunoblotting
12 de febrero de 2019
Este protocolo muestra el análisis de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial por electroforesis en gel de poliacrilamida nativo azul. Aquí se describe el método aplicado a las células humanas cultivadas.
La electroforesis de gel de poliacrilamida nativa azul permite el análisis de complejos en el tacto del sistema de fosforilación oxidativa mitocondrial. Es una técnica conveniente y económica que se puede utilizar para superponer el montaje de complejos enteros del sistema de fosforilación oxidativa mitocondrial. Para preparar los licatos mitocondriales, primero use la solución de PBS helada para lavar suavemente las células una vez.
Raspa las células y las pelete a cuatro grados centígrados a 800 G durante 10 minutos. Luego, lave el pellet celular dos veces con el PBS helado y la centrífuga a cuatro grados centígrados a 800 G durante 10 minutos. A continuación, agregue 200 microlitros de inhibidor de la proteasa 100x a 20 mililitros de PBS.
Re-suspender las células en la mezcla inhibidora de la proteasa PBS a una concentración final de proteína de cinco miligramos por mililitro. Para preparar 3,3 digitonesiones mililitros en PBS con inhibidor de la proteasa, disolver cuatro miligramos de digitonina en un mililitro de PBS a 100 grados Celsius hasta que no sea visible ningún precipitado. Enfríe sobre hielo inmediatamente y agregue 10 microlitros de inhibidor de la proteasa 100x a un mililitro de la solución de digitonina.
A continuación, añadir la mezcla inhibidora de la proteasa de digitonina a las células a la concentración final de 1,65 milimolares. Mezcle bien e incubar sobre hielo durante cinco minutos. Luego, agregue la mezcla inhibidora de la proteasa PBS a las células al volumen final de 1,5 mililitros.
Centrifugar a cuatro grados centígrados a 10.000 G durante 10 minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo mitocondrial en el tampón mitocondrial. Preparar un mililitro de montura fresca 10%loreal en solución inhibidora de PBS.
Añadir 10%loreal mountased a las mitocondrias a la concentración final de 1%Incubar sobre hielo durante al menos 15 minutos. Centrifugar a cuatro grados centígrados a 20.000 G durante 20 minutos. Recoja el sobrenadante en un tubo nuevo y agregue el búfer de muestra.
Para preparar el gel degradado para la página azul nativo, coloque primero el fabricante de degradado en una placa de agitación y conéctelo con un tubo flexible a la bomba peristáltica. Coloque un juego de perfusión con una aguja en el tubo. Coloque un agitador magnético en la cámara proximal del fabricante de gradientes y lave el tubo con agua destilada a la velocidad máxima de la bomba durante 10 minutos.
A continuación, vacíe el tubo y el fabricante de degradados. Utilice una pipeta para eliminar cualquier agua destilada sobrante en el canal entre las cámaras del fabricante de gradientes. Cierre el canal y el tubo con la válvula.
Ensamble dos placas de vidrio en el soporte y colóquela en el soporte. Con el orificio en la parte inferior del soporte de gel, coloque la aguja conectada al tubo entre las placas de vidrio. Para hacer un gel de 8,3 por 7,3 centímetros, primero prepara soluciones de 6% y 15% de gel y mantenlas en hielo.
Mézclalos suavemente para evitar hacer burbujas de aire. A continuación, cargue el extremo proximal de la cámara de tubos del mezclador de gel degradado con 2,6 mililitros del 6% de gel y el extremo distal con 2,1 mililitros del 15%gel. A continuación, encienda el agitador magnético y abra el tubo y el canal entre las cámaras del fabricante de gradientes.
Encienda inmediatamente la bomba peristáltica a cinco mililitros por minuto. Llene las placas de vidrio y retire la aguja cuando no haya gel en el tubo. Superponga suavemente el gel con agua destilada y mantenga el gel a temperatura ambiente durante al menos una hora.
Lave el tubo inmediatamente llenando las cámaras de gradiente con agua destilada y utilizando la bomba peristáltica a la velocidad máxima. Añadir seis mililitros de agua destilada a tres mililitros del tampón de gel 3x para hacer 1x tampón de gel. Con un papel de filtro, retire suavemente el agua destilada de la superficie del gel.
Lave la superficie del gel con el tampón de gel 1x y retire suavemente el tampón con el papel de filtro. Preparar un 4% de gel de apilamiento según el manuscrito. Mezclar suavemente para evitar hacer burbujas de aire.
A continuación, coloque el peine entre las placas de vidrio y vierta el gel de apilamiento debajo del peine. Sumerja el peine completamente. Deje que el gel de apilamiento se polimerice durante al menos 30 minutos.
A continuación, retire el peine y use una pipeta para lavar los pozos con 1x tampón de gel. Para realizar la electroforesis de gel nativo azul, primero, agregue el tampón de cátodo azul al cassette de gel. Utilice una pipeta para lavar y llenar los pozos con el tampón de cátodo azul.
Luego, cargue de cinco a 30 microgramos de muestras de proteínas en los pozos. Llene suavemente el cassette de gel hasta la parte superior con el tampón de cátodo azul y el tanque con el tampón de ánodo. En primer lugar, ejecute el gel a una tensión constante de 40 voltios durante 15 minutos.
A continuación, aumente la tensión a 80 voltios. Ejecute el gel hasta que el tinte alcance 2/3 de la longitud del gel. Sustituya el tampón de cátodo azul por el tampón de cátodo y continúe la electroforesis hasta que el frente del tinte haya quedado sin el gel.
Recuperar las placas de vidrio y transferir las proteínas a la membrana PVDF por hinchazón semi-seca. Utilice un voltaje constante de 25 voltios y una corriente limitada a un amperio durante 30 minutos. El montaje de los complejos de la cadena respiratoria en las células del neuroblastoma humano se inhibió tras el tratamiento con cloramphenicol en comparación con las células de control sin tratamiento.
Por el contrario, los complejos codificados por los genes nucleares fueron regulados. Se observó degradación de los complejos de fosforilación oxidativa en múltiples ciclos de congelación y deshielo. La calidad del gel podría afectar a la detección de los complejos de fosforilación oxidativa.
Además, el desmontaje de la membrana redujo la relación señal-ruido. Al realizar el procedimiento, es importante recordar llevar a cabo una simple preparación y electroforesis de gel en condiciones frías para preservar los complejos OXPHOS en tacto. Después de la página nativa azul, se puede aplicar una segunda página SDS de dimensión para estudiar las subuncuciones de proteínas de los complejos de cadenas respiratorias.
La página nativa azul permite a los investigadores estudiar el montaje de complejos e incluso super-complejos del sistema de fosforilación oxidativa.
Descripción general
Este protocolo presenta un método para analizar los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial utilizando electroforesis en gel de poliacrilamida nativo azul (BN-PAGE). La técnica se aplica a células humanas en cultivo para evaluar el ensamblaje de los complejos de fosforilación oxidativa mitocondrial.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Biología mitocondrial
- Fosforilación oxidativa
- Técnicas de electroforesis
Antecedentes
- Los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial son cruciales para la producción de ATP.
- Comprender su ensamblaje y función es fundamental en los estudios del metabolismo celular.
- La electroforesis en gel nativo azul es una técnica útil para analizar complejos proteicos intactos.
Métodos Utilizados
- Electroforesis en gel de poliacrilamida nativa azul
- Células de neuroblastoma humano
- Técnicas de precipitación de proteínas y transferencia de membranas
Resultados principales
- El tratamiento con cloranfenicol inhibió el ensamblaje de los complejos de la cadena respiratoria.
- Se observó la sobreexpresión de complejos codificados por el núcleo en las células tratadas.
- Varios ciclos de congelación-descongelación afectaron la degradación de los complejos de fosforilación oxidativa.
Conclusiones
- Este estudio demuestra la viabilidad de la BN-PAGE para analizar los complejos mitocondriales.
- Destaca la importancia de las condiciones para preservar la integridad de los complejos OXPHOS.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Evaluar el ensamblaje y la estabilidad de los complejos de la fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS) es fundamental para la validación de dianas en la investigación de enfermedades metabólicas y neurofarmacología. La electroforesis en gel nativo azul (BN-PAGE) permite la evaluación directa de complejos proteicos intactos, proporcionando información mecanicista sobre la disfunción mitocondrial inducida por compuestos o las respuestas adaptativas. Esto apoya la reducción temprana de riesgos al vincular la interacción con la diana con la producción funcional de OXPHOS en modelos celulares humanos relevantes para la enfermedad.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas mediante la resolución de los estados de ensamblaje de los complejos OXPHOS para aclarar el mecanismo de acción.
- Valor operativo: Permite la validación funcional del blanco mediante la visualización directa de la integridad del complejo bajo perturbaciones por compuestos o genéticas.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al distinguir los efectos sobre complejos codificados por ADN mitocondrial frente a los codificados por ADN nuclear, aportando información sobre la confianza en el blanco.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: Prepara lisados mitocondriales estandarizados para la separación electroforética reproducible de los complejos OXPHOS.
- Resultado cuantitativo: Genera bandas de complejos resolubles que permiten comparaciones semicuantitativas entre diferentes condiciones de tratamiento.
- Utilidad de la plataforma: Establece un método escalable y de bajo costo para la evaluación rutinaria del ensamblaje de complejos mitocondriales en cascadas de cribado.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para enfermedades: Se aplica a células humanas cultivadas, permitiendo modelos traslacionales de trastornos mitocondriales y neurotoxicidad.
- Continuidad mecanicista: Conecta hallazgos de descubrimiento con validación preclínica al confirmar efectos mediados por el blanco en el ensamblaje de la OXPHOS.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Detecta degradación compleja derivada de artefactos en el manejo de muestras (por ejemplo, congelación-descongelación), mejorando la fiabilidad de los datos para criterios de avance/no avance.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
BN-PAGE se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación inicial del blanco hasta la optimización del fármaco líder, donde la evaluación de la responsabilidad mitocondrial orienta la progresión del compuesto.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la resolución del ensamblaje de los complejos de la OXPHOS para aclarar los efectos a nivel de vías de los moduladores.
- Tamizaje: Permite obtener preparaciones mitocondriales listas para ensayos, con integridad de los complejos conservada, para la selección de compuestos.
- Análisis: Ofrece separación electroforética y detección por inmunotransferencia de los complejos de la OXPHOS como lectura funcional para el análisis comparativo entre condiciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con trabajos preclínicos mediante el uso de células de origen humano, apoyando seguimientos mecanicistas alineados con biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma modular y reutilizable para el análisis de complejos mitocondriales en múltiples proyectos y áreas terapéuticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona confianza predictiva en la validación del blanco al reducir la ambigüedad en el mecanismo de acción mitocondrial.
- Valor operativo: Ofrece un método estandarizado, económico y reproducible para el análisis de los complejos OXPHOS.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la detección temprana de efectos adversos mitocondriales, reduciendo el riesgo de descarte en fases avanzadas.
- Impacto en la cartera: Informa la priorización ajustada al riesgo al distinguir los efectos mitocondriales específicos del blanco de la diana de las alteraciones no específicas o artifactualmente inducidas en los complejos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en aislamiento mitocondrial y técnicas electroforéticas nativas.
- Depende del acceso a equipos para geles en gradiente, centrífugas a baja temperatura e infraestructura para inmunotransferencia.
- Necesita protocolos estandarizados entre los equipos para garantizar la conservación de los complejos y la consistencia en su detección.
- Debe tener en cuenta las limitaciones en el manejo de muestras, incluida la evitación de ciclos repetidos de congelación-descongelación que degradan los complejos OXPHOS.
- Depende de mantener condiciones frías durante toda la preparación y electroforesis para preservar los ensamblajes intactos de los complejos.
