Análisis de complejos de cadena respiratoria mitocondrial en células humanas cultivadas usando electroforesis en Gel de poliacrilamida nativo azul e Immunoblotting

La electroforesis de gel de poliacrilamida nativa azul permite el análisis de complejos en el tacto del sistema de fosforilación oxidativa mitocondrial. Es una técnica conveniente y económica que se puede utilizar para superponer el montaje de complejos enteros del sistema de fosforilación oxidativa mitocondrial. Para preparar los licatos mitocondriales, primero use la solución de PBS helada para lavar suavemente las células una vez.

Raspa las células y las pelete a cuatro grados centígrados a 800 G durante 10 minutos. Luego, lave el pellet celular dos veces con el PBS helado y la centrífuga a cuatro grados centígrados a 800 G durante 10 minutos. A continuación, agregue 200 microlitros de inhibidor de la proteasa 100x a 20 mililitros de PBS.

Re-suspender las células en la mezcla inhibidora de la proteasa PBS a una concentración final de proteína de cinco miligramos por mililitro. Para preparar 3,3 digitonesiones mililitros en PBS con inhibidor de la proteasa, disolver cuatro miligramos de digitonina en un mililitro de PBS a 100 grados Celsius hasta que no sea visible ningún precipitado. Enfríe sobre hielo inmediatamente y agregue 10 microlitros de inhibidor de la proteasa 100x a un mililitro de la solución de digitonina.

A continuación, añadir la mezcla inhibidora de la proteasa de digitonina a las células a la concentración final de 1,65 milimolares. Mezcle bien e incubar sobre hielo durante cinco minutos. Luego, agregue la mezcla inhibidora de la proteasa PBS a las células al volumen final de 1,5 mililitros.

Centrifugar a cuatro grados centígrados a 10.000 G durante 10 minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo mitocondrial en el tampón mitocondrial. Preparar un mililitro de montura fresca 10%loreal en solución inhibidora de PBS.

Añadir 10%loreal mountased a las mitocondrias a la concentración final de 1%Incubar sobre hielo durante al menos 15 minutos. Centrifugar a cuatro grados centígrados a 20.000 G durante 20 minutos. Recoja el sobrenadante en un tubo nuevo y agregue el búfer de muestra.

Para preparar el gel degradado para la página azul nativo, coloque primero el fabricante de degradado en una placa de agitación y conéctelo con un tubo flexible a la bomba peristáltica. Coloque un juego de perfusión con una aguja en el tubo. Coloque un agitador magnético en la cámara proximal del fabricante de gradientes y lave el tubo con agua destilada a la velocidad máxima de la bomba durante 10 minutos.

A continuación, vacíe el tubo y el fabricante de degradados. Utilice una pipeta para eliminar cualquier agua destilada sobrante en el canal entre las cámaras del fabricante de gradientes. Cierre el canal y el tubo con la válvula.

Ensamble dos placas de vidrio en el soporte y colóquela en el soporte. Con el orificio en la parte inferior del soporte de gel, coloque la aguja conectada al tubo entre las placas de vidrio. Para hacer un gel de 8,3 por 7,3 centímetros, primero prepara soluciones de 6% y 15% de gel y mantenlas en hielo.

Mézclalos suavemente para evitar hacer burbujas de aire. A continuación, cargue el extremo proximal de la cámara de tubos del mezclador de gel degradado con 2,6 mililitros del 6% de gel y el extremo distal con 2,1 mililitros del 15%gel. A continuación, encienda el agitador magnético y abra el tubo y el canal entre las cámaras del fabricante de gradientes.

Encienda inmediatamente la bomba peristáltica a cinco mililitros por minuto. Llene las placas de vidrio y retire la aguja cuando no haya gel en el tubo. Superponga suavemente el gel con agua destilada y mantenga el gel a temperatura ambiente durante al menos una hora.

Lave el tubo inmediatamente llenando las cámaras de gradiente con agua destilada y utilizando la bomba peristáltica a la velocidad máxima. Añadir seis mililitros de agua destilada a tres mililitros del tampón de gel 3x para hacer 1x tampón de gel. Con un papel de filtro, retire suavemente el agua destilada de la superficie del gel.

Lave la superficie del gel con el tampón de gel 1x y retire suavemente el tampón con el papel de filtro. Preparar un 4% de gel de apilamiento según el manuscrito. Mezclar suavemente para evitar hacer burbujas de aire.

A continuación, coloque el peine entre las placas de vidrio y vierta el gel de apilamiento debajo del peine. Sumerja el peine completamente. Deje que el gel de apilamiento se polimerice durante al menos 30 minutos.

A continuación, retire el peine y use una pipeta para lavar los pozos con 1x tampón de gel. Para realizar la electroforesis de gel nativo azul, primero, agregue el tampón de cátodo azul al cassette de gel. Utilice una pipeta para lavar y llenar los pozos con el tampón de cátodo azul.

Luego, cargue de cinco a 30 microgramos de muestras de proteínas en los pozos. Llene suavemente el cassette de gel hasta la parte superior con el tampón de cátodo azul y el tanque con el tampón de ánodo. En primer lugar, ejecute el gel a una tensión constante de 40 voltios durante 15 minutos.

A continuación, aumente la tensión a 80 voltios. Ejecute el gel hasta que el tinte alcance 2/3 de la longitud del gel. Sustituya el tampón de cátodo azul por el tampón de cátodo y continúe la electroforesis hasta que el frente del tinte haya quedado sin el gel.

Recuperar las placas de vidrio y transferir las proteínas a la membrana PVDF por hinchazón semi-seca. Utilice un voltaje constante de 25 voltios y una corriente limitada a un amperio durante 30 minutos. El montaje de los complejos de la cadena respiratoria en las células del neuroblastoma humano se inhibió tras el tratamiento con cloramphenicol en comparación con las células de control sin tratamiento.

Por el contrario, los complejos codificados por los genes nucleares fueron regulados. Se observó degradación de los complejos de fosforilación oxidativa en múltiples ciclos de congelación y deshielo. La calidad del gel podría afectar a la detección de los complejos de fosforilación oxidativa.

Además, el desmontaje de la membrana redujo la relación señal-ruido. Al realizar el procedimiento, es importante recordar llevar a cabo una simple preparación y electroforesis de gel en condiciones frías para preservar los complejos OXPHOS en tacto. Después de la página nativa azul, se puede aplicar una segunda página SDS de dimensión para estudiar las subuncuciones de proteínas de los complejos de cadenas respiratorias.

La página nativa azul permite a los investigadores estudiar el montaje de complejos e incluso super-complejos del sistema de fosforilación oxidativa.