Name: Secuenciación de semiconductores para pruebas genéticas preimplantaciones para la aneuploidía (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 s
Description: Aprende secuenciación de semiconductores para pruebas genéticas preimplantacionales de aneuploidía. Este método rápido y de bajo costo permite alta reproducibilidad y resultados en cinco días, mejorando la eficiencia clínica en salud reproductiva.

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Este estudio fue apoyado por el Fondo General de Investigación (Ref No 14162417) de Hong Kong, la National Natural Science Foundation of China (Ref No 81860272), el Plan de Investigación Principal de la Fundación Provincial de Ciencia y Tecnología de Guangxi (Ref No. AB16380219), y la Beca de la Fundación de Ciencia Postdoctoral de China (Ref No. 2018M630993) de China.

<ol><li>Balaban, B., Urman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+oocyte+morphology+on+embryo+development+and+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+BioMedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Effect of oocyte morphology on embryo development and implantation.</a> Reproductive BioMedicine Online. 12 (5), 608-615 (2006).</li>
<li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+standard+blastocyst+morphology%2C+euploidy+and+implantation%3A+An+observational+study+in+two+centers+involving+956+screened+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: An observational study in two centers involving 956 screened blastocysts.</a> Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).</li>
<li>Magli, M. C., Gianaroli, L., Ferraretti, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+abnormalities+in+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Chromosomal abnormalities in embryos.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 183, 29-34 (2001).</li>
<li>Trussler, J. L., Pickering, S. J., Ogilvie, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+chromosomal+imbalance+in+human+embryos+using+comparative+genomic+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+BioMedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Investigation of chromosomal imbalance in human embryos using comparative genomic hybridization.</a> Reproductive BioMedicine Online. 8 (6), 701-711 (2004).</li>
<li>Fragouli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+analysis+of+human+blastocysts+with+the+use+of+FISH%2C+CGH+and+aCGH%3A+Scientific+data+and+technical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic analysis of human blastocysts with the use of FISH, CGH and aCGH: Scientific data and technical evaluation.</a> Human Reproduction. 26 (2), 480-490 (2011).</li>
<li>Calhaz-Jorge, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assisted+reproductive+technology+in+Europe%2C+2013%3A+Results+generated+from+European+registers+by+ESHRE%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Assisted reproductive technology in Europe, 2013: Results generated from European registers by ESHRE.</a> Human Reproduction. 32 (10), 1957-1973 (2017).</li>
<li>Dyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+committee+for+monitoring+assisted+reproductive+technologies+world+report%3A+Assisted+reproductive+technology+2008%2C+2009+and+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">International committee for monitoring assisted reproductive technologies world report: Assisted reproductive technology 2008, 2009 and 2010.</a> Human Reproduction. 31 (7), 1588-1609 (2008).</li>
<li>Dahdouh, E. M., Balayla, J., García-Velasco, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+chromosome+screening+improves+embryo+selection%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: A meta-analysis.</a> Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).</li>
<li>Chen, M., Wei, S., Hu, J., Quan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+Comprehensive+Chromosome+Screening+Technology+Improve+IVF%2FICSI+Outcomes%3F+A+Meta-Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Can Comprehensive Chromosome Screening Technology Improve IVF/ICSI Outcomes? A Meta-Analysis.</a> PloS One. 10 (10), e0140779(2015).</li>
<li>Northrop, L. E., Treff, N. R., Levy, B., Scott, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+microarray-based+24+chromosome+aneuploidy+screening+demonstrates+that+cleavage-stage+FISH+poorly+predicts+aneuploidy+in+embryos+that+develop+to+morphologically+normal+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">SNP microarray-based 24 chromosome aneuploidy screening demonstrates that cleavage-stage FISH poorly predicts aneuploidy in embryos that develop to morphologically normal blastocysts.</a> Molecular Human Reproduction. 16 (8), 590-600 (2010).</li>
<li>Barbash-Hazan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preimplantation+aneuploid+embryos+undergo+self-correction+in+correlation+with+their+developmental+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Preimplantation aneuploid embryos undergo self-correction in correlation with their developmental potential.</a> Fertility and Sterility. 92 (3), 890-896 (2009).</li>
<li>Fragouli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+cytogenetic+analysis+of+the+human+blastocyst+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Comprehensive cytogenetic analysis of the human blastocyst stage.</a> Fertility and Sterility. 90 (11), S36(2008).</li>
<li>Fiorentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+next-generation+sequencing-based+protocol+for+24-chromosome+aneuploidy+screening+of+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a next-generation sequencing-based protocol for 24-chromosome aneuploidy screening of embryos.</a> Fertility and Sterility. 101 (5), 1375-1382 (2014).</li>
<li>Fiorentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+next-generation+sequencing+technology+for+comprehensive+aneuploidy+screening+of+blastocysts+in+clinical+preimplantation+genetic+screening+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical preimplantation genetic screening cycles.</a> Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).</li>
<li>Wells, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+utilisation+of+a+rapid+low-pass+whole+genome+sequencing+technique+for+the+diagnosis+of+aneuploidy+in+human+embryos+prior+to+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation.</a> Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).</li>
<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tale+of+three+next+generation+sequencingplatforms%3A+comparison+of+Ion+Torrent%2C+PacificBiosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A tale of three next generation sequencingplatforms: comparison of Ion Torrent, PacificBiosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13 (1), 1-13 (2012).</li>
<li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+of+age%3A+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).</li>
<li>Bono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+semiconductor+next-generation+sequencing-based+protocol+for+preimplantation+genetic+diagnosis+of+reciprocal+translocations%5BTitle%5D)+AND+%22Prenatal+Diagnosis%22%5BJournal%5D)">Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for preimplantation genetic diagnosis of reciprocal translocations.</a> Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).</li>
<li>Harton, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESHRE+PGD+Consortium%2FEmbryology+Special+Interest+Groupbest+practice+guidelines+for+polar+body+and+embryo+biopsy+for+preimplantation+genetic+diagnosis%2Fscreening+%28PGD%2FPGS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">ESHRE PGD Consortium/Embryology Special Interest Groupbest practice guidelines for polar body and embryo biopsy for preimplantation genetic diagnosis/screening (PGD/PGS).</a> Human Reproduction. 26 (1), 41-46 (2011).</li>
<li>Liu, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+performance+of+MALBAC+and+MDA+methods+in+the+identification+of+concurrent+mutations+and+aneuploidy+screening+to+diagnose+beta-thalassaemia+disorders+at+the+single-+and+multiple-cell+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Laboratory+Analysis%22%5BJournal%5D)">The performance of MALBAC and MDA methods in the identification of concurrent mutations and aneuploidy screening to diagnose beta-thalassaemia disorders at the single- and multiple-cell levels.</a> Journal of Clinical Laboratory Analysis. 32 (2), 1-8 (2018).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comparison+of+the+performance+of+four+whole+genome+amplification+kits+on+ion+proton+platform+in+copy+number+variation+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">The comparison of the performance of four whole genome amplification kits on ion proton platform in copy number variation detection.</a> Bioscience Reports. 37 (4), BSR20170252(2017).</li>
<li>Munné, S., Grifo, J., Wells, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaicism%3A+%E2%80%9Csurvival+of+the+fittest%E2%80%9D+versus+%E2%80%9Cno+embryo+left+behind%E2%80%9D%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Mosaicism: “survival of the fittest” versus “no embryo left behind”.</a> Fertility and Sterility. 105 (5), 1146-1149 (2016).</li>
<li>Del Carmen Nogales, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+of+chromosome+abnormality+affects+embryo+morphology+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Type of chromosome abnormality affects embryo morphology dynamics.</a> Fertility and Sterility. 107 (1), 229-235 (2017).</li>
<li>Harton, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESHRE+PGD+consortium+best+practice+guidelines+for+amplification-based+PGD%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">ESHRE PGD consortium best practice guidelines for amplification-based PGD.</a> Human Reproduction. 26 (1), 33-40 (2011).</li>
<li>Deleye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shallow+whole+genome+sequencing+is+well+suited+for+the+detection+of+chromosomal+aberrations+in+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Shallow whole genome sequencing is well suited for the detection of chromosomal aberrations in human blastocysts.</a> Fertility and Sterility. 104 (5), 1276-1285 (2015).</li>
<li>Bielanska, M., Tan, S. L., Ao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+mosaicism+throughout+human+preimplantation+development+in+vitro%3A+incidence%2C+type%2C+and+relevance+to+embryo+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Chromosomal mosaicism throughout human preimplantation development in vitro: incidence, type, and relevance to embryo outcome.</a> Human Reproduction. 17 (2), Oxford, England. 413-419 (2002).</li>
<li>Treff, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+targeted+next-generation+sequencing-based+preimplantation+genetic+diagnosis+of+monogenic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Evaluation of targeted next-generation sequencing-based preimplantation genetic diagnosis of monogenic disease.</a> Fertility and Sterility. 99 (5), 1377-1384 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

A diferencia de otras químicas de secuenciación, el secuenciador descrito aquí utiliza semiconductores para la detección de nucleótidos. El chip en sí es un dispositivo electrónico que detecta iones de hidrógeno por la incorporación de base impulsada por la polimerasa17,lo que permite un tiempo de secuenciación de 2 x 4 horas del programa Proton. Además, el chip es un chip de micropozo que permite la localización de una molécula de destino, que es diferente de la química de secuenciación de célula...

La elección de embriones viables de buena calidad con números normales de copia cromosómica (euploide) para la transferencia en reproducción asistida ayuda a mejorar los resultados del embarazo. Tradicionalmente, el sistema de clasificación morfológica bien establecido es ampliamente utilizado para la evaluación de embriones debido a su fácil disponibilidad y naturaleza no invasiva. Sin embargo, se ha demostrado que la evaluación morfológica sólo puede proporcionar información limitada sobre la calidad del embrión1 y el potencial de implantación2. Una razón fundamental es su incapacidad para evaluar la composición cromosómica de los embriones.
La aneuploidía cromosómica (número anormal de cromosomas) es una de las principales causas que conducen a la detención del desarrollo embrionario, el fallo de implantación o la pérdida del embarazo. La aparición de aneuploidía ha sido bien documentada en embriones humanos, representando entre el 60% y el 70% en embriones en etapa de escisión3,4 y 50%-60% en blastocistos5. Esto, en cierta medida, ha contribuido al cuello de botella en la mejora de la tasa de embarazo del tratamiento de fertilización in vitro (FIV), que se ha mantenido en torno al 35%-40%6,7. Por lo tanto, se cree que la selección de embriones euploides para la transferencia es beneficioso para mejorar los resultados del embarazo. Con este fin, se han desarrollado más a fondo pruebas genéticas preimplantacionales para la aneuploidía (PGT-A) para investigar la viabilidad de los embriones mediante enfoques genéticos. Cada vez hay más ensayos controlados aleatorios y estudios de cohortes que apoyan el papel crucial de la PGT-A. Se ha demostrado que la aplicación de PGT-A disminuye la tasa de abortoespontáneo y aumenta la tasa de embarazo clínico y la tasa de implantación 8, la tasa de embarazo en curso y la tasa de nacimientos vivos9.
Históricamente, se han aplicado diferentes métodos en PGT-A, como la hibridación in situ por fluorescencia (FISH), la hibridación genómica comparativa (CGH), la matriz-CGH y el polimorfismo nucleótido único (SNP)-microarray. Estudios anteriores han indicado que PGT-A para embriones en etapa de escisión por FISH produce resultados que son poco consistentes con los obtenidos por cribado cromosómico integral (CCS) de los blastocistos correspondientes utilizando 59273array-CGH o SNP-microarray5927310. Estas discrepancias pueden atribuirse al mosaico cromosómico, a los artefactos técnicos FISH o a la autocorrección embrionaria de los errores de segregación cromosómica durante el desarrollo11. Se ha reconocido ampliamente que el uso de biopsias de tropoctodem (TE) de blastoctodermo (TE) para PGT-A basado en matrices, como la matriz-CGH o el microarray SNP, es eficaz para identificar el desequilibrio cromosómico en embriones10,12. Recientemente, la secuenciación de próxima generación de una sola célula (NGS) proporciona un enfoque de alto rendimiento y rentable para el análisis genético y ha demostrado aplicabilidad clínica en PGT-A13,14,15, lo que la convierte en un alternativa prometedora a los métodos actualmente disponibles.
Aquí, presentamos un método NGS basado en secuenciación de semiconductores rápido, robusto y de bajo costo para el cribado de la aneuploidía en embriones humanos. El primer paso del flujo de trabajo es la amplificación del genoma completo (WGA) de la muestra de embrión biopsiado, utilizando un kit WGA de una sola célula, seguido de la construcción de la biblioteca de secuenciación, y la secuenciación posterior en el sistema de secuenciación de semiconductores.
Mediante la detección de los iones H+ que se liberan de cada incorporación de trifosfato de desoxirribonucleósido durante la síntesis de la cadena de ADN, el sistema transfiere las señales químicas (cambio de pH) capturadas por los elementos semiconductores a datos digitales directos , que se interpretan más detalladamente en la información de la secuencia de ADN. Eliminando el requisito de detección óptica costosa y reacciones de secuenciación complejas, esta química de secuenciación simple reduce el costo total del reactivo y acorta el tiempo de funcionamiento de la secuenciación en 2 x 4 horas16. Más importante aún, sobre la base de las especificaciones de rendimiento del fabricante, la plataforma de secuenciación de semiconductores puede generar hasta 15 GB de datos de secuenciación (depende de la calidad de la biblioteca) por carrera, que es significativamente mayor que algunos de los otros secuenciadores produciendo sólo alrededor de 3 x 4 GB de datos (con 2 x 75 bp de longitud de lectura)17. En las aplicaciones clínicas de PGT-A, esta plataforma puede lograr 24 muestras por chip generando hasta 80 millones de lecturas17 y al menos un millón de lecturas únicas de cada muestra. La profundidad de lectura puede garantizar que cada muestra tenga al menos una cobertura completa del genoma de 0,05 x. Las ventajas anteriores de esta plataforma la convierten en un método de cribado ideal y, por lo tanto, facilitan sus amplias aplicaciones en PGT-A18.

<table><tbody><tr><td>Tubos de PCR, 0,2 mL</td><td>Axygen</td><td>PCR-02D-C</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0</td><td>ThermoFisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4, Ca2+ y Mg2+</td> sin <td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>solución de NaOH (1,0N)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S2567</td><td>para solución Melt-off. </td></tr><tr><td>Tubos LoBind Eppendorf de grado molecular, 1,5 mL</td> Kit de biblioteca de fragmentos <td>Fisher Scientific</td><td>13-698-791</td><td></td></tr><tr><td>Ion Plus</td> Sistema de purificación de agua <td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>ELGA PURELAB Flex 3 o equivalente a 18 M&Omega; sistema de agua</td><td>ThermoFisher</td><td>4474524</td><td></td></tr><tr><td>Ion Plus Kit de biblioteca</td><td>ThermoFisher 4471252</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampón de amplificación PicoPLEX WGA</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Esto puede ser reemplazado por el sistema de amplificación de ADN SurePlex, número de catálogo: PR-40-415101-03.</td></tr><tr><td>Enzima de amplificación PicoPLEX WGA</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Esto puede ser reemplazado por el sistema de amplificación de ADN SurePlex, número de catálogo: PR-40-415101-03.</td></tr><tr>Placa <td></td><td></td><td>de amplificación Ion OneTouch</td><td>En el kit: Suministros Ion OneTouch 2 (n.º de pieza A26367). Componente del kit ampliado en la hoja 5</td></tr><tr>Tampón <td></td><td></td><td></td><td>de recocido Ion PI</td></tr><tr><td>MyOne Beads Capture Solution Agilent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Instrumento de bioanalizador</td><td>Agilent</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Ion OneTouch Breaking Solution (tapa negra)</td>En el kit: <td></td><td></td><td>Ion PI Hi? Q OT2 Solutions 200 (Nº de pieza A26429). Componente del kit extendido en la hoja 5</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>ThermoFisher</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA Cell extraction</td> buffer <td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Esto puede ser reemplazado por el sistema de amplificación de ADN SurePlex, número de catálogo: PR-40-415101-00.</td></tr><tr><td>PicoPLEX Enzima de extracción celular WGA</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Esto puede ser reemplazado por el sistema de amplificación de ADN SurePlex, número de catálogo: PR-40-415101-03.</td></tr><tr><td>Ion PI Chip Kit v3</td><td>ThermoFisher</td><td>A26771</td><td></td></tr><tr><td>Chip de iones Minifuge, 230 V</td><td>ThermoFisher</td><td>4479673</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI dATP</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI dCTP</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI dGTP</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment Library Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>Kit de biblioteca de fragmentos Ion Plus</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>ThermoQ&ndash; Temperatura Baño seco</td><td>TAMAR</td><td>HB-T2-A</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext dsDNA Fragmentase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0348L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext dsDNA Fragmentase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0348L</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI dTTP</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion OneTouch 2 Instrument</td><td>ThermoFisher</td><td>INS1005527</td><td>ThermoFisher Número de catálogo: 4474778.</td></tr><tr><td>Ion Plus Kit de biblioteca de fragmentos</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>Ion One Touch ES</td><td>ThermoFisher</td><td>8441-22</td><td>ThermoFisher Número de catálogo: 4469495. Componente del kit extendido en la hoja 5</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>51976</td><td>Esto puede ser reemplazado por etanol absoluto de grado molecular de cualquier marca.</td></tr><tr><td>Tampón de dilución de enzimas de extracción PicoPLEX WGA</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Esto puede ser reemplazado por el sistema de amplificación de ADN SurePlex, número de catálogo: PR-40-415101-01.</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA Tampón de dilución de enzimas de extracción</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Esto puede ser reemplazado por el sistema de amplificación de ADN SurePlex, número de catálogo: PR-40-415101-02.</td></tr><tr><td>Fluorímetro Qubit 3.0</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33216</td><td>Este modelo ha sido reemplazado por el Fluorímetro Qubit 4, Número de catálogo: Q33226.</td></tr><tr><td>Qubit ds DNA HS Kit de ensayo</td><td>ThermoFisher</td><td>M2002-02</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ensayo Qubit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI Foaming Solution</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Índice para códigos de barras de bibliotecas</td><td>BaseCare</td><td></td><td>este es un índice preparado internamente. Los usuarios pueden comprar productos comerciales de los kits de adaptadores de códigos de barras ThermoFisher Ion Xpress (Cat. N.º 4474517)</td></tr><tr><td>Tampón de carga Ion PI</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Kit de tampón sólido(TM) 1X Tampón de TE bajo</td><td>ThermoFisher</td><td>4389764</td><td></td></tr><tr><td>Agencour AMPure XP Kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Imán DynaMag-2 (bastidor magnético)</td><td>Tampón</td><td></td> PCR ThermoFisher 12321D <td></td></tr><tr><td>Ion PI Master Mix</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 17 Microcentrífuga</td><td>Micro 17</td><td>75002430</td><td></td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment Library Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>Agua sin nucleasas</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9922</td><td>Esta puede ser sustituida por otra marca.</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA Agua sin nucleasas</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Esto puede ser reemplazado por el sistema de amplificación de ADN SurePlex, número de catálogo: PR-40-415101-03.</td></tr><tr><td>Botella de aceite</td><td></td><td></td> Ion OneTouch <td>Ion PI Hi? Q OT2 Solutions 200 (Nº de pieza A26429). Componente de kit extendido en la Hoja 5</td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment Library Kit</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>4471252 Componente de kit extendido en la Hoja 3</td></tr><tr><td>Estándar</td><td></td><td></td> de ADN de doble cadena <td>Este es un estándar de ADN preparado internamente para la calibración de Qubit antes de la cuantificación de la biblioteca.</td></tr><tr><td>Tampón de preamplificación PicoPLEX WGA</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Este puede ser reemplazado por el sistema de amplificación de ADN SurePlex, número de catálogo: PR-40-415101-03.</td></tr><tr><td>Enzima de preamplificación PicoPLEX WGA</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Esto puede ser reemplazado por el sistema de amplificación de ADN SurePlex, número de catálogo: PR-40-415101-03.</td></tr><tr><td>Mezcla de cebador de amplificación de bibliotecas</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td>Componente de kit extendido en la hoja 3</td></tr><tr>Filtro <td></td><td></td> de<td>reacción Ion OneTouch</td><td>Componente del kit extendido en la hoja 5</td></tr><tr><td>Enrutador</td><td></td><td></td> de recuperación <td>Componente del kit extendido en la hoja 5</td></tr><tr><td>Tubos de recuperación Componente</td><td></td><td></td><td>del kit extendido en la hoja 5</td></tr><tr><td>Solución</td><td></td><td></td> <td>de resuspensión ISP</td></tr><tr><td>Ion Proton</td><td>ThermoFisher</td><td>DA8600</td><td>Este modelo es importado por Da An Gene Co., LTD. de la Universidad Sun Yat-Sen de ThermoFisher y ha sido certificado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de China para aplicación clínica. El número de catálogo de ThermoFisher es 4476610.</td></tr><tr><td>Ion PI ¿Hola? Q Secuenciación de polimerasa</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI Secuenciación Servidor de cebadores</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>para secuenciador</td><td>Lenovo</td><td>T260</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI Sphere Particles Platinum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR SuperMix Alta Fidelidad</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 25mm Filtros de jeringa</td><td>ThermoFisher</td><td>724-2045</td><td>Tamaño de poro: 0,45 m. Específico para fluidos acuosos.</td></tr><tr><td>Ion PI ¿Hola? Q Solución W2</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI 1X W3 Solución</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion OneTouch Solución de lavado C1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>El Ion PGM Hi? Q Ver kit de secuenciación</td><td>ThermoFisher</td><td>A30044</td><td>Componente de kit extendido en la hoja 2</td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment Library Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td>Componente de kit extendido en la hoja 3</td></tr><tr><td>Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit (1 ciclo de secuenciación por inicialización)</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td>Componente de kit extendido en la hoja 4</td></tr><tr><td>Ion PI Hi? Q OT2 200 Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>A26434</td><td>Componente de kit extendido en la hoja 5</td></tr></tbody></table>

secuenciación de semiconductores para pruebas genéticas preimplantaciones para la aneuploidía

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

El aneuploidía cromosómico, una de las principales causas que conducen a la detención del desarrollo embrionario, el fracaso de la implantación o la pérdida del embarazo, ha sido bien documentado en embriones humanos. Las pruebas genéticas preimplantacionales para la aneuploidía (PGT-A) son una prueba genética que mejora significativamente los resultados reproductivos mediante la detección de anomalías cromosómicas de embriones. La secuenciación de próxima generación (NGS) proporciona un enfoque de alto rendimiento y rentable para el análisis genético y ha demostrado aplicabilidad clínica en PGT-A. Aquí, presentamos un método NGS basado en secuenciación de semiconductores rápido y de bajo costo para el cribado de la aneuploidía en embriones. El primer paso del flujo de trabajo es la amplificación completa del genoma (WGA) del espécimen embrionario biopsiado, seguido de la construcción de la biblioteca de secuenciación, y la secuenciación posterior en el sistema de secuenciación de semiconductores. Generalmente, para una aplicación PGT-A, se pueden cargar y secuenciar 24 muestras en cada chip generando 60 a 80 millones de lecturas con una longitud de lectura promedio de 150 pares base. El método proporciona un protocolo refinado para realizar la amplificación de plantillas y el enriquecimiento de la biblioteca de secuenciación, haciendo que la detección PGT-A sea reproducible, de alto rendimiento, rentable y de ahorro de tiempo. El tiempo de funcionamiento de este secuenciador de semiconductores es de sólo 2 a 4 horas, lo que acorta el tiempo de respuesta desde la recepción de muestras hasta la emisión de informes en 5 días. Todas estas ventajas hacen de este ensayo un método ideal para detectar aneuploidias cromosómicas de embriones y así, facilitar su amplia aplicación en PGT-A.

Sobre la base de este protocolo modificado, la plataforma de secuenciación de semiconductores fue por primera vez, aplicada para PGT-A. Probamos las biopsias de los blastómeros en etapa de escote y los embriones en etapa de blastocisto. Se sugiere que las células biopsiadas se sometan a WGA tan pronto como sea posible para prevenir cualquier degradación del ADN. Un estudio anterior comparó el rendimiento de diferentes métodos WGA e indicó que el método que describimos aquí tenía la mejor ...

Aquí, introducimos un método de secuenciación de semiconductores para pruebas genéticas preimplantacionales para la aneuploidía (PGT-A) con las ventajas de un tiempo de respuesta corto, bajo costo y alto rendimiento.

Secuenciación de semiconductores para pruebas genéticas preimplantaciones para la aneuploidía

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

El protocolo que presentamos aquí es un semiconductor rápido y de bajo costo, métodos basados en la secuenciación para el cribado de la aneuploidía en embriones. El protocolo refinado para realizar la amplificación de plantillas y los arreglos de la biblioteca de secuenciación hacen que la detección de PGTA sea reproducible, de alto rendimiento, rentable y ahorro de tiempo. El tiempo de ejecución de este secuenciador de semiconductores es de sólo dos a cuatro horas.Acortar el tiempo de respuesta desde la recepción de muestras hasta la emisión de informes en cinco días. Este método proporciona secuenciación del genoma para el cribado de aneuploidía, la variación del número de copia y las llamadas de polimorfismo de nucleótido único. Debido a la química de secuenciación diferente, la biblioteca preparada por este protocolo no se puede secuenciar directamente en otros sistemas de secuenciación.Pero el mismo secuenciador, pero diferente preparación de la biblioteca, es capaz de hacer cribado prenatal no invasivo. Demostrando el procedimiento estará Xiangchun Guo, un técnico de nuestro laboratorio. Para comenzar la secuenciación, el vórtice cada biblioteca diluida y girar brevemente cuatro veces en la mini centrífuga durante tres segundos cada vez.Luego, tome cinco microlitros de cada biblioteca, para agrupar en el tubo sin núcleo, un punto cinco mililitros. Vórtice la biblioteca mixta y gire brevemente en una mini centrífuga durante tres segundos. Añadir 150 microlitros de la solución de rotura, a dos nuevos tubos de recuperación.Instale los nuevos tubos de recuperación, el router de recuperación y la placa de amplificación. Mezclar invirtiendo la botella de aceite tres veces. Asegúrese de que tanto el aceite como la solución de recuperación estén al menos dos tercios llenos.Vortex el búfer PCR de mezcla maestra durante 30 segundos y gire brevemente en una mini centrífuga durante tres segundos. Vórtice las partículas de la esfera y la biblioteca mixta durante un minuto y girar brevemente en una mini centrífuga durante tres segundos. A continuación, prepare una mezcla de ligadura de 2400 microlitros, añadiendo 172 microlitros de agua libre de nucleasas, ocho microlitros de la biblioteca mixta, 120 microlitros de la mezcla enzimática y 100 microlitros de las partículas de la esfera, al tubo que contiene 2000 microlitros del búfer PCR de mezcla maestra.Establezca una pipeta en 800 microlitros y cargue la mezcla de ligadura en el filtro de reacción a través del puerto de muestra. Invierta la botella de aceite tres veces y utilice una pipeta P1000 para añadir 200 microlitros del aceite de reacción al filtro de reacción. Seleccione el programa Protón y, a continuación, seleccione el botón asistido, para asegurarse de que el dispositivo se ha configurado correctamente, siguiendo las instrucciones del monitor.A continuación, haga clic en Siguiente para iniciar el programa. Cargue 100 microlitros de la muestra del producto PCR de emulsión, 130 microlitros de las perlas lavadas, 300 microlitros de la solución de lavado ES y 300 microlitros de la solución de fusión en la tira de ocho tubos. Coloque la tira de ocho tubos en el sistema de enriquecimiento.Instale una punta de pipeta y un nuevo tubo de dos mililitros de punto cero e inicie el programa. Centrifugar el tubo de dos mililitros de punto cero a 15, 500 veces G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y mantenga diez microlitros del producto de enriquecimiento.Añadir 200 microlitros de agua sin nucleasas al tubo y mezclar por vórtice. Centrifugar el tubo de dos mililitros de punto cero de nuevo. Deseche el sobrenadante y mantenga 10 microlitros del producto de enriquecimiento.Añadir 90 microlitros de agua sin nucleasas al tubo y mezclar por vórtice. Para preparar la plantilla, vórtice el control positivo y gire brevemente. Añadir cinco microlitros del control positivo a 100 microlitros del producto de enriquecimiento.Vórtice y centrífuga a 15,500 veces G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y mantenga 10 microlitros de la plantilla. A continuación, agregue 20 microlitros de la imprimación de secuenciación y 15 microlitros del tampón de recocido al tubo de la plantilla.Vórtice el tubo y gire brevemente en una mini centrífuga durante tres segundos. Incubar el tubo en un ciclor térmico con una tapa calentada. A continuación, añada 10 microlitros del búfer de carga al tubo.Mezclar en pipeteando arriba y abajo. Mezcle las 55 microlitros de la muestra pipeteando hacia arriba y hacia abajo y cargue la muestra en el pozo de carga del chip. Mantenga la punta de pipeta usada y el tubo PCR de dos mililitros de punto cero.Coloque el chip en la mini centrífuga de chip cuando entre alguna muestra en el chip. Compruebe la posición y centrifugar el chip durante 10 minutos. Prepare el tampón de 50% de recocido añadiendo 500 microlitros de tampón de recocido y 500 microlitros de agua sin nucleasas en un tubo de un punto de cinco mililitros.Preparar la solución de lavado, añadiendo 500 microlitros de tampón de recocido y 500 microlitros de 100%2-propanol en un tubo de cinco mililitros de un punto. A continuación, preparar la mezcla de espuma, añadiendo 49 microlitros del tampón de recocido 50% y un microlitros de la solución de espuma a dos nuevos tubos de un punto y cinco mililitros. Pipetear el aire en una de las mezclas de espuma, y cargar 120 microlitros de las burbujas en el pozo de carga.Transfiera el líquido expulsado excesivo del pozo de salida al pozo de carga, y centrifugar el chip durante 30 segundos en la mini centrífuga de la viruta. Repita el proceso para la segunda mezcla de espuma. Agregue 55 microlitros del tampón de recocido del 50% al tubo de cuatro mililitros mantenido.Utilice la punta de pipeta mantenida para pipetear hacia arriba y hacia abajo. Cargue los 55 microlitros del tampón de recocido en el pozo de carga. Centrifugar el chip durante 30 segundos en la mini centrífuga de chip designada.Cargue 100 microlitros de la solución de lavado en el pozo de carga de la viruta y deseche el líquido expulsado del pozo de salida. Repita este paso de carga una vez. Cargue 100 microlitros del búfer de recocido del 50%, en el pozo de carga de la viruta.Repita este paso de carga para un total de tres veces. Agregue 60 microlitros del tampón de recocido al 50% y seis microlitros de la enzima de secuenciación en un nuevo tubo de un punto de cinco mililitros. Mezclar en pipeteando arriba y abajo.Pipeta lentamente 65 microlitros de esta solución mixta en el pozo de carga de la viruta, evitando las burbujas. Mantenga el chip alejado de la luz e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Finalmente, después de la incubación, cargue inmediatamente el chip en el secuenciador y haga clic en Iniciar la secuenciación en la pantalla para iniciar la secuenciación.Un análisis estadístico retrospectivo en 186 embriones en estadio de escisión y 1135 embriones en estadio de blastocisto dio como resultado más del 95% de las tasas de éxito de WGA en ambos tipos de muestras. Las tasas de fallo de control de calidad de secuenciación fueron del 3,4% en el grupo de etapa de escisión y solo del 1,9% en el grupo de etapas del blastocisto. Además de la aneuploidía, los datos de secuenciación se pueden utilizar para otros análisis.Por ejemplo, copie las variaciones de números con un tamaño inferior a cinco megabase, o análisis de ADN micondrial, dependiendo de la profundidad y calidad de secuenciación. Con la mejora en las llamadas de número de copias, los investigadores pueden investigar más a fondo el futuro del mosaico cromosómico en embriones humanos en etapa temprana.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

En este artículo se describe la selección de sondas adecuadas para una sola célula FISH, las técnicas de difusión de los núcleos de blastómeros, y la hibridación in situ y la puntuación de la señal, aplicadas al diagnóstico genético preimplantacional (DGP) en un entorno clínico.

FISH para el diagnóstico genético preimplantacional

Bisulfito de mutagénesis es el estándar de oro para el análisis de la metilación del ADN. Nuestro protocolo modificado permite el análisis de metilación del ADN en el ámbito de una sola célula y fue diseñado específicamente para los ovocitos individuales. También se puede utilizar para los embriones etapa de escisión.

Único ovocito Mutagénesis bisulfito

Heterotopia nodular periventricular (PNH) es la forma más común de malformación del desarrollo cortical (MCD) en la edad adulta, pero su base genética sigue siendo desconocido en los casos más esporádicos. Recientemente hemos desarrollado una estrategia para identificar genes candidatos novela de MCDs y confirmar directamente su papel causativo en vivo.

Una nueva estrategia Array-CGH, secuenciación del exoma todo y electroporación en el útero en roedores para identificar los Genes causales de las malformaciones del cerebro

Secuenciación de próxima generación (NGS) es una poderosa herramienta para la caracterización genómica que está limitada por la tasa alta de error de la plataforma (~0.5–2.0%). Describimos nuestros métodos de corrección de error de la secuencia que nos permiten obviar la tasa de error NGS y detectar mutaciones en fracciones de alelo variante tan raros como 0.0001.

Detección de eventos raros usando ADN Error corregido y secuenciación de ARN

El objetivo de este protocolo es genotipo la anémona de mar Nematostella vectensis durante la gastrulación sin sacrificar el embrión.

Genotipado de anémona sin mar durante el desarrollo temprano

El presente estudio reporta un protocolo para el tamizaje cromosómico de embriones humanos que utiliza medio de cultivo gastado, lo que evita la biopsia embrionaria y permite la identificación de ploidía cromosómica mediante NGS. El presente artículo presenta el procedimiento detallado, que incluye la preparación del medio de cultivo, la amplificación del genoma completo (WGA), la preparación de la biblioteca de secuenciación de nueva generación (NGS) y el análisis de datos.

Cribado cromosómico de embriones humanos preimplantacionales mediante el uso de medios de cultivo gastados: recogida de muestras y análisis de ploidía cromosómica

El protocolo presenta los procedimientos generales en el laboratorio requeridos en las pruebas genéticas preimplantacionales para la aneuploidía en una plataforma de secuenciación de próxima generación basada en semiconductores. Aquí presentamos los pasos detallados de la amplificación del genoma completo, la selección de fragmentos de ADN, la construcción de bibliotecas, la preparación de plantillas y el flujo de trabajo de secuenciación con resultados representativos.

Pruebas genéticas preimplantacionales para aneuploidías en una plataforma de secuenciación de próxima generación basada en semiconductores

Este protocolo propone procedimientos holísticos de laboratorio necesarios para detectar polimorfismos de un solo nucleótido en muestras de cáncer gástrico basados en una plataforma de secuenciación de semiconductores iónicos. También se describen en detalle las secuencias objetivo, los adaptadores de ligadura, la amplificación y purificación de bibliotecas y los criterios de control de calidad.

Detección de polimorfismo de nucleótido único multigénico en cáncer gástrico basada en una plataforma de secuenciación de semiconductores iónicos

Aquí se presenta un protocolo para investigar la metilación del ADN del genoma de ancho en estudios de cribado de pacientes clínicos a gran escala utilizando la secuenciación Metil-unión de captura de ADN (SEC-MBDCap o MBD-ss) la tecnología y el análisis de tuberías bioinformática posteriores.

Secuenciación de captura de ADN de unión a metil-para tejidos del paciente

En este trabajo informamos sobre métodos sobre la manipulación genética molecular de la cepa Po1g de Yarrowia lipolytica para mejorar la eficiencia de la deleción de genes. Las cepas de Y. lipolytica modificadas resultantes tienen aplicaciones potenciales en la producción de biocombustibles y bioquímicos.

Ingeniería genética de un levaduras no convencionales para biocombustible renovable y producción bioquímica

Aprende secuenciación de semiconductores para pruebas genéticas preimplantacionales de aneuploidía. Este método rápido y de bajo costo permite alta reproducibilidad y resultados en cinco días, mejorando la eficiencia clínica en salud reproductiva.

Secuenciación de semiconductores para pruebas genéticas preimplantaciones para la aneuploidía

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