Name: Medición de las tasas de consumo de oxígeno en intacto Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Aprende a medir tasas de consumo de oxígeno en Caenorhabditis elegans intactos usando un respirometro comercial. Este protocolo permite evaluar la función mitocondrial en organismos vivos sin necesidad de aislar mitocondrias.

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Los autores desean reconocer el Dr. Kevin Bittman para su orientación en el establecimiento de la XFp de Caballito de mar en el laboratorio. Institutos nacionales de salud otorgar que gm088213 apoya esta labor.

Nota: La figura 2 proporciona un Resumen esquemático del protocolo completo.
1. crecimiento y sincronización de población del nematodo9,10
<ol><li>Transferencia de larvas L4 de fondos genéticos deseados (por ejemplo, N2 [tipo] y sel-12 animales) sobre nematodos media (NGM) placas de crecimiento (ver tabla 1 para receta) recién sembradas con césped de Escherichia coli (OP50)11. Uso de m m 100 por lo menos dos o tres placas de 60 mm para cada cepa. Incubar los gusanos a la temperatura de crecimiento adecuada (entre 15 y 25 ° C) durante 3 – 4 días o hasta que las placas se concentran con gran número de huevos y gusanos grávidos.</li>
	<li>Lavar los huevos y gusanos de las planchas con aproximadamente 6 mL de buffer M9 (ver tabla 1 para receta) por placa de 100 mm de nematodos y transferencia con vidrio Pipetas Pasteur en tubos de centrífuga de 15 mL individuales para cada cepa. Girar los tubos por 3 min a 6.180 x g y aspire hacia fuera el buffer M9, conservando sólo la pelotilla de animales y huevos.</li>
	<li>Agregar 3 – 4 mL de solución de lejía (ver tabla 1 para la receta) a cada tubo e intermitentemente vortex de 6 minutos añadir M9 buffer llenar cada tubo y girar a 6.180 x g durante 1 min y aspirar el sobrenadante. Repetir este lavado con M9 tres veces y pasar el sedimento de huevo a un nuevo tubo 15 mL aproximadamente de 9 ml de tampón de M9.</li>
	<li>Sincronizar los gusanos recién eclosionados por oscilante a 20 ° C para 16 – 48 h. vuelta estos tubos abajo a 6.180 x g durante 1,5 min y dejar que los animales sincronizados de L1 en platos individuales de NGM recién sembrados con césped de OP50 (aproximadamente 6.000 – 10.000 animales por placa de 100 mm) y mantener a 20 ° C.</li>
	<li>Estos animales llegará a la etapa larval L4 después de ~ 42 h. En este momento, mover las larvas L4 usando una selección platino a OP50 sembrado NGM placas que contienen 0,5 mg / mL 5-fluoro-2'-desoxiuridina (FUdR) para evitar de producir progenie. Nota: Asegúrese de que dentro de un experimento todas las cepas son sincronizadas por una cantidad similar de tiempo. Tratamiento de FUdR esteriliza a los animales y evita la producción de huevos colocación y progenie, lo que podría influir en OCR. Al día siguiente (día 1 animales en h ~ 66) para el ensayo se analizarán estos animales esterilizados. FUdR se ha divulgado para afectar la fisiología y la vida útil de ciertos gusanos mutantes. Por lo tanto, esto debe tomarse en consideración cuando el fármaco se utiliza para esterilización12,13,14. Lombrices también pueden esterilizarse por medio de feminizante mutaciones como fem-1(hc17) o fem-3(e2006). Sin embargo, estas mutaciones pueden afectar la función mitocondrial.</li>
</ol>2. preparación de compuestos que se inyecta y la hidratación de las puntas de prueba
Nota: Durante la serie, se miden dos tipos de respiración basal y máxima de los nematodos. Máxima respiración se dispara en los animales con la adición de carbonilo cianuro-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazone (FCCP), un ionóforo desacoplar que perturba el potencial de membrana mitocondrial y síntesis de ATP al transporte de protones a través de la membrana mitocondrial, permitiendo el bombeo de protones, transporte de electrones y el consumo de oxígeno a4,15 desacoplado de la síntesis de ATP (figura 1). El paso final en el ensayo consiste en la adición de azida sódica (NaN3), un fármaco que inhibe los complejos IV y V en el etc., que le permitirán determinar la respiración no mitocondrial16 (figura 1). Los siguientes pasos se pueden realizar el día antes de la carrera de análisis real.
<ol><li>Preparar 1 mL de las soluciones madre de la FCCP (10 mM en dimetilsulfóxido [DMSO]: 1000 x la concentración de ensayo final) y NaN3 (400 mM en dH2O: 10 x concentración final del ensayo) y almacenar a-20 ° C. Nota: Una curva de concentración para optimizar la concentración de FCCP necesaria para obtener la respuesta máxima de OCR para cada instrumento y el entorno de laboratorio.</li>
	<li>Hidratar el cartucho de sensor mediante la adición de 200 μL de dH2O para cada bien (y el pantano circundante) en la placa, procurando que el sensor de las sondas se introducen en el dH2O y almacenar durante la noche a temperatura ambiente. Nota: El cartucho pueden dejarse sondas sumergidas hasta 72 h pero en el caso de una hidratación prolongada, las placas envuelto en película de parafina y almacenadas a 4 ° C. Si la hidratación no es posible, el cartucho de sensor debe estar hidratado durante al menos 4 h antes del ensayo.</li>
	<li>Apague el calefactor dentro de la interfaz del respirómetro y almacenar el instrumento dentro de una incubadora de 15 ° C durante la noche a baja temperatura en el instrumento para evitar que los animales se sobrecaliente durante la serie. Nota: El respirómetro está equipado con un elemento de calefacción pero no puede refrigerarse. Dentro de una incubadora de 15 ° C, el respirómetro tendrá una temperatura estable entre 18 y 22 ° C, que es una temperatura saludable para el mantenimiento de C. elegans .</li>
</ol>3. droga carga y cartucho de conseguir el equilibrio
<ol><li>Pipetee hacia fuera y deseche el dH2O utilizado para hidratar el sensor sondas y reemplazarlo con 200 μL de la solución calibrant (pH 7.4) en cada pocillo. Diluir la solución madre de FCCP y 100 μm FCCP dH2O y añadir 20 μl de la solución diluida a la inyección Puerto A en el cartucho de sensor. Añadir 22 μL de azida de sodio 400 mM al puerto B del cartucho del senor.</li>
	<li>Activar el respirómetro en la Seleccione pantalla de inicio de Inicio; aparecerá la página de plantillas. En la página de plantillas, seleccione en blanco o una plantilla previamente diseñada; aparecerá la página de grupos. En la página de los grupos, seleccionar los pozos A y H como los pozos de fondo y asignar los restantes 6 pozos en grupos apropiados de acuerdo con el plan experimental.</li>
	<li>Presione la flecha en la esquina inferior derecha para ir a la página del protocolo. En la página del Protocolo, garantizar que se seleccionan los botones equilibrar, basales y las inyecciones de 1 y 2 . En esta página, ajustar el número de lecturas de OCR basal, así como OCR máxima (después de la inyección 1 con FCCP) y no mitocondrial OCR (después de la inyección 2 con azida de sodio). Nota: Cada medición está precedida de una mezcla y paso de espera y los plazos para estos parámetros se muestran en la tabla 2.</li>
	<li>Seleccione la flecha en la esquina inferior derecha y aparecerá un indicador de carga de la placa de la cápsula de sensor. Asegúrese de que la placa de la cápsula de sensor es cargada en la orientación correcta, siguiendo las instrucciones en la pantalla de recordatorio pronto. El respirómetro equilibre ahora el cartucho. Nota: Este equilibrado proporciona tiempo suficiente para poner los animales a ensayarse en los pocillos adecuados de la placa celular.</li>
</ol>4. preparación de la placa de gusano y serie
<ol><li>Añadir 200 μL de buffer M9 en cada uno de los 8 pocillos de la placa de la célula y en los depósitos alrededor de los pozos.</li>
	<li>Recoger ~ 100 gusanos de cada cepa sobre placas NGM no sembradas y dejar reposar 2-3 min mojado al final de la selección platino con buffer M9 y recoger 20 animales de edad-que sincronizados en pozos B-G, vaciar los pozos de fondo A y H. Nota: Después de cargar cada uno bien, espere aproximadamente 2 minutos para que los animales en el fondo de los pocillos. También es recomendable ejecutar una curva número de gusano para optimizar el número de gusano por pozo para cada instrumento y el entorno de laboratorio.</li>
	<li>Por ahora, debe calibrarse el respirómetro y haciendo clic en OK en la pantalla, la placa que contiene tampón de calibración es expulsada y puede extraerse el respirómetro, mientras que el cartucho de sensor permanece dentro del instrumento. Vuelva a colocar la placa calibrant con la placa que contiene animales. Placa de carga y cierre la puerta pulsando continuar y permitir el ensayo de funcionamiento.</li>
</ol>5. Análisis de los datos del experimento después de
<ol><li>Una vez finalizado el plazo de prueba, siga las instrucciones en la pantalla y retire la placa de la célula y el cartucho de sensor e insertar una unidad flash en el puerto USB para guardar los datos de funcionamiento en formato .war. Retire el cartucho de sensor y permite colocar hasta el fondo de los pozos de aproximadamente 2 minutos Coloque las placas de células debajo de un estéreo microscopio de disección y cuente el número de animales por el bien de los animales.</li>
	<li>Abra el software de análisis en el equipo y abra la ficha de normalización para normalizar OCR al número de animales. Aplicar etiquetas adecuadas para los distintos grupos en la ficha modificar y exportar el archivo como un archivo de prisma para su posterior análisis. Nota: El promedio de las mediciones de cinco primeros, antes de la adición de FCCP es el OCR basal, mientras que la media de las cinco mediciones después de FCCP es el OCR máxima y la media de las últimas cinco mediciones (mínimo de dos mediciones debe hacerse) después de adición de azida de sodio es la velocidad de la respiración no mitocondrial. El ensayo debe repetirse tres veces para asegurar la reproducibilidad.</li>
</ol>

<ol><li>Nelson, D. L., Cox, M. M. Ch. 19. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNelson%2C+DL+%22Lehninger+Principles+of+Biochemistry%22">Lehninger Principles of Biochemistry</a>. Ahr, K. , W. H. Freeman and Company. 707-772 (2008).</li>
<li>Marchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+and+endoplasmic+reticulum+calcium+homeostasis+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death.</a> Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).</li>
<li>Sarasija, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin+mutations+deregulate+mitochondrial+Ca%282%2B%29+homeostasis+and+metabolic+activity+causing+neurodegeneration+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Luz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Morphology+and+Fundamental+Parameters+of+the+Mitochondrial+Respiratory+Chain+Are+Altered+in+Caenorhabditis+elegans+Strains+Deficient+in+Mitochondrial+Dynamics+and+Homeostasis+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes.</a> PLoS One. 10, e0130940(2015).</li>
<li>Ryu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urolithin+A+induces+mitophagy+and+prolongs+lifespan+in+C.+elegans+and+increases+muscle+function+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents.</a> Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).</li>
<li>Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+assessing+mitochondrial+function+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Methods for assessing mitochondrial function in diabetes.</a> Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).</li>
<li>Schulz, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+restriction+extends+Caenorhabditis+elegans+life+span+by+inducing+mitochondrial+respiration+and+increasing+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress.</a> Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).</li>
<li>Koopman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+screening-based+platform+for+the+assessment+of+cellular+respiration+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).</li>
<li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Mitochondrial+Structure+in+the+Body+Wall+Muscle+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li>
<li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+ROS+in+Caenorhabditis+elegans+Using+a+Reduced+Form+of+Fluorescein%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+worm+lab%3A+from+culturing+worms+to+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).</li>
<li>Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+FUdR+can+cause+prolonged+longevity+in+mutant+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).</li>
<li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+5%27-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans.</a> Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).</li>
<li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).</li>
<li>Heytler, P. G., Prichard, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+class+of+uncoupling+agents--carbonyl+cyanide+phenylhydrazones%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).</li>
<li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).</li>
<li>Levitan, D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+lin-12-mediated+signalling+by+sel-12%2C+a+Caenorhabditis+elegans+S182+Alzheimer%27s+disease+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer's disease gene.</a> Nature. 377, 351-354 (1995).</li>
<li>Sherrington, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+a+gene+bearing+missense+mutations+in+early-onset+familial+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease.</a> Nature. 375, 754-760 (1995).</li>
<li>Glancy, B., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mitochondrial+Ca2%2B+in+the+regulation+of+cellular+energetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics.</a> Biochemistry. 51, 2959-2973 (2012).</li>
<li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gamma-Secretase+Independent+Role+for+Presenilin+in+Calcium+Homeostasis+Impacts+Mitochondrial+Function+and+Morphology+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201, 1453-1466 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La respiración mitocondrial es un perspicaz indicador de la función mitocondrial; por lo tanto, ser capaz de medir las tasas de consumo de oxígeno en un sistema biológico, ya sea in vitro o en vivo es muy valiosa. Respirometers detectar niveles de oxígeno usando fósforos de porfirina que haz apagados por oxígeno o por medio de sensores de oxígeno amperométrico que dependen de la generación de una eléctrica actual proporcional a la presión de oxígeno. Electrodo de Clark cae en esta última categoría y se ha utilizado ampli...

Trifosfato de adenosina (ATP), la principal fuente de energía celular, se produce en las mitocondrias por enzimas de la cadena de transporte de electrones (ETC) situadas en la membrana mitocondrial interna. Piruvato, un metabolito clave utilizado para la producción de ATP mitocondrial, se importa a la matriz mitocondrial donde es descarboxilada para producir acetil coenzima A (CoA). Posteriormente, el acetil CoA entra en el ciclo del ácido cítrico resultando en la generación de nicotinamida adenina dinucleótido (NADH), una molécula de portador de la clave electrónica. Como pasan electrones del NADH al oxígeno vía lo etc., los protones se acumulan en el espacio de intermembrane mitocondrial, que se traduce en la generación de un gradiente electroquímico a través de la membrana. Estos protones entonces fluirá desde el espacio del intermembrane a través de este gradiente electroquímico hacia la matriz mitocondrial a través del poro de protones de la ATP Sintetasa, conduciendo la rotación y la síntesis de ATP1 (figura 1).
La función mitocondrial no se limita a la producción de energía pero también es fundamental para la homeostasis del calcio, especies reactivas del oxígeno (ROS) barrido y apoptosis, posicionamiento críticamente su función en la salud2. La función mitocondrial puede ser evaluada usando una variedad de ensayos, incluyendo pero no limitado a los análisis que miden el potencial de membrana mitocondrial, ATP y ROS y las concentraciones de calcio mitocondrial. Sin embargo, estos ensayos ofrecen una sola instantánea de la función mitocondrial y por lo tanto no pueden proporcionar una visión integral de la salud mitocondrial. Puesto que el consumo de oxígeno durante la generación del ATP depende de un sinnúmero de reacciones secuenciales, sirve como un indicador superior de la función mitocondrial. Curiosamente, se han observado variaciones en las tasas de consumo de oxígeno como consecuencia de la disfunción mitocondrial3,4,5.
Tasas de consumo de oxígeno (OCR) de muestras de la vida pueden ser medidas usando técnicas que se pueden dividir ampliamente en dos grupos: amperométrico Sensores de oxígeno y los fósforos basados en porfirina que pueden ser saciadas por oxígeno6. Los sensores de oxígeno amperométrico se han utilizado extensivamente para medida OCR en cultivos de células, tejidos y en sistemas modelo, como C. elegans. Sin embargo, los fósforos basados en porfirina que contiene respirometers poseen las siguientes ventajas: (1) permiten una comparación lado a lado de dos muestras por triplicado, (2) requieren de más pequeño tamaño de la muestra (por ejemplo, 20 gusanos por pozo versus ~ 2, 000−5, 000 lombrices en el cámara)7y (3) el respirómetro se puede programar para hacer cuatro inyecciones compuestas diferentes a deseado a veces a lo largo de la carrera experimental, eliminando la necesidad de aplicación manual.
En este protocolo, pasos en el uso de un sensor de oxígeno de base de porfirina respirómetro a medida OCR en vivo, intacto C. elegans son descritos. Aunque no existe un protocolo escrito para el uso de gran formato, alto rendimiento respirómetro8, este protocolo ha sido adaptado para su uso con el instrumento más presupuesto amigable, accesible y menor escala. Este protocolo es útil para evaluar la diferencia de OCR entre dos cepas, donde no es necesaria la proyección de alto rendimiento y su uso sería excesivo.

<table><tbody><tr><td>Placas de Petri de 100 mm, 60 mm</td><td>Productos de material de laboratorio Kord-Valmark</td><td>2900, 2901</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 1,5 mL</td><td>Globe Scientific</td><td>6285</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 15 mL</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>22 &times; cubreobjetos de 22 mm</td><td>Globe Scientific</td><td>1404-10</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 50 mL</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-2</td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptona</td><td>BD, Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Bacto triptona</td><td>BD, Bacto</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Bacto extracto de levadura</td><td>BD, Bacto</td><td>212705</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Genérico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2&middot; 2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona (FCCP)</td><td>Abcam</td><td>ab120081</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Fisher Scientific</td><td>C314-500</td><td></td></tr><tr><td>Agua desionizada (dH2O)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Thomas Scientific</td><td>C987Y85</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de vidrio Pasteur</td><td>Krackeler Scientific</td><td>6-72050-900</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4&middot; 7H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio dibásico (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico anhidro (Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-1</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFp Analyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFp FluxPak</td><td>Agilent</td><td>103022-100</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr></tbody></table>

medición de las tasas de consumo de oxígeno en intacto caenorhabditis elegans

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Función mitocondrial óptima es fundamental para la actividad celular saludable, particularmente en las células que tienen demandas de alta energía como los del sistema nervioso y muscular. Consistente con esto, la disfunción mitocondrial se ha asociado con una miríada de enfermedades neurodegenerativas y envejecimiento en general. Elegans de Caenorhabditis han sido un sistema potente para elucidar las muchas complejidades de la función mitocondrial. La respiración mitocondrial es un fuerte indicador de la función mitocondrial y respirometers recientemente desarrollados ofrecen una plataforma de avanzada para medir la respiración en las células. En este protocolo, ofrecemos una técnica para analizar vivo, intacto C. elegans. Este protocolo abarca un período de ~ 7 días e incluye pasos para el crecimiento y la sincronización de C. elegans, (2) preparación de compuestos que se inyecta y la hidratación de las puntas de prueba, equilibrado de carga y el cartucho (3) drogas (4) preparación de análisis de gusano (1) placa y serie y análisis de datos post-experimento (5).

Utilizando el protocolo aquí descrito, OCR de animales de tipo salvaje y mutante de diferentes sel-12 tres cepas fueron determinadas. SEL-12 codifica el ortólogo de C. elegans de presenilina17. Las mutaciones en humano presenilin son la aberración genética más común asociada con el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer familiar18. Nuestros estudios han demostrado niveles elevados de calcio mitocondrial en se...

La respiración mitocondrial es crítica para la supervivencia; por lo tanto, la tasa de consumo de oxígeno es un excelente indicador de la salud mitocondrial. En este protocolo, describimos el uso de un respirómetro comercialmente disponible a medida basal y las tasas de consumo de oxígeno máximo en vivo, intacto y libremente móviles elegans de Caenorhabditis.

Medición de las tasas de consumo de oxígeno en intacto Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

La función mitocondrial es fundamental para la homeostasis celular y la tasa de consumo de oxígeno es un indicador decisivo de la salud mitocondrial. Este protocolo proporciona instrucciones detalladas para analizar la tasa de consumo de oxígeno en C.elegans. Este protocolo hace uso de C.elegans móviles en vivo que proporcionan una medición legal de la función mitocondrial.Elevar la necesidad de aislar las mitocondrias, un paso que potencialmente podría afectar su integridad. Para empezar, transfiera larvas L4 de fondos genéticos deseados a un césped recién sembrado de Escherichia coli en medios de crecimiento de nematodos o placas NGM. Utilice al menos dos placas de 100 mm o tres de 60 mm para cada cepa.Incubar los gusanos a la temperatura de crecimiento adecuada durante tres a cuatro días, o hasta que las placas se concentren con un gran número de huevos y gusanos gravídicos. Lave los huevos y gusanos de las placas con aproximadamente 6 mililitros de tampón M9 por cada placa de 100 milímetros de nematodos. Usando pipetas de pasto de vidrio, transfiera los huevos y gusanos a tubos individuales de centrífuga de 15 mililitros para cada cepa.Gire estos tubos hacia abajo durante tres minutos a 6, 180 g. Después de la centrifugación, aspirar el tampón M9 conservando sólo el animal y el pellet de huevo. Agregue de tres a cuatro mililitros de solución de lejía a cada tubo y vórtice intermitentemente durante seis minutos.Luego, agregue el tampón M9 para llenar cada tubo y gire a 6, 180 g durante un minuto. Aspirar el sobrenadante y repetir este lavado con el M9, tres veces. Después del lavado, mueva el pellet de huevo a un tubo fresco de 15 mililitros que contenga aproximadamente nueve mililitros de tampón M9.Sincronice los gusanos recién eclosionados mediante la nuez a 20 grados centígrados durante 16 a 48 horas. Después de girar estos tubos a 6, 180 g durante 1,5 minutos, coloque los animales sincronizados L-1 en un césped recién sembrado de OP50 en placas NGM individuales. Mantenga las placas a 20 grados centígrados hasta que los animales lleguen a la etapa larval L-4 después de aproximadamente 42 horas.En este momento, utilice una selección de platino para mover las larvas L4 a placas NGM de semillas OP50 que contienen 0,5 miligramos por mililitro de FUdR para evitar que produzca progenie. Hidratar el cartucho del sensor añadiendo 200 microlitros de agua destilada a cada pozo de la placa, asegurando que las sondas del sensor estén sumergidas. Guarde los platos durante la noche a temperatura ambiente.Apague el elemento calefactor dentro de la interfaz del respirómetro. Almacenar la máquina dentro de una incubadora celsius de 15 grados reduce la temperatura del núcleo dentro de la máquina y evita que los animales se sobrecalienten durante el ensayo. Después de la incubación durante la noche, pipetear y desechar el agua destilada utilizada para hidratar las sondas del sensor, y reemplazarla con 200 microlitros de la solución calibradora en cada pozo.Diluir la solución de material FCCP a 100 micromolarES FCCP en agua destilada. A continuación, añada 20 microlitros de la solución diluida al puerto de inyección A en el cartucho del sensor. Agregue 22 microlitros de 400 azidas de sodio milimolar al puerto de inyección B del cartucho del sensor.Ahora, encienda el respirómetro. En la pantalla de inicio, seleccione inicio y aparecerán las páginas de plantilla. En la página de plantillas, seleccione blank"o una plantilla diseñada previamente.Aparecerá la página de grupos. En la página de grupos, seleccione los pozos A y H como los pozos de fondo y asigne los seis pozos restantes en grupos apropiados de acuerdo con el plan experimental. Acceda a la página del protocolo haciendo clic en la flecha de la parte inferior derecha y asegúrese de que el botón equilibrado, basal y las inyecciones uno y dos están seleccionados.Ajuste el número de lecturas de OCR basal, así como el OCR máximo y el OCR no mitocondrial. Seleccione la flecha en la esquina inferior derecha. Aparecerá un mensaje para cargar la placa del cartucho del sensor.Asegúrese de que la placa del cartucho del sensor esté cargada en la orientación correcta, siguiendo las instrucciones de la pantalla del indicador de recordatorio. El respiraómetro ahora equilibrará el cartucho. Agregue 200 microlitros de tampón M9 en cada uno de los ocho pozos y depósitos circundantes de la placa celular.Escoja aproximadamente 100 gusanos de cada cepa en placas NGM no sesedadas, y deje reposar durante dos a tres minutos. Luego, moja el extremo de la selección de platino con tampón M9 y elige animales sincronizados de 20 años en pozos B a G, dejando los pozos de fondo A y H vacíos. Ahora, haga clic en Aceptar en el software del respterómetro para expulsar la placa que contiene el búfer de calibración.Retire la placa del respirómetro dejando el cartucho del sensor dentro del instrumento. Sustituya la placa calibrante por la placa que contiene los animales. Cargue las placas y cierre la puerta golpeando continuar y permitir que el ensayo funcione.Una vez completada la ejecución del ensayo, siga las indicaciones de la pantalla para extraer la placa de celda y el cartucho del sensor. Inserte una unidad flash en el puerto USB para guardar el formato de guerra de datos de ejecución. Retire el cartucho del sensor y deje que los animales se asienten en el fondo de los pozos durante aproximadamente dos minutos.Coloque las placas celulares bajo un microscopio de disección estéreo y cuente el número de animales por pozo. Abra el software de análisis, seguido de la pestaña de normalización, para normalizar las tasas de consumo de oxígeno al número de animal. Aplique los niveles adecuados para los distintos grupos en la pestaña modify", y exporte el archivo como un archivo prisma para su posterior análisis.El promedio de las primeras cinco mediciones es el OCR basal. El promedio de las cinco mediciones después de la adición de FCCP es el OCR máximo. Por último, el promedio de las últimas cinco mediciones después de la adición de azida sódica es la tasa de respiración no mitocondrial.Dado que la desregulación del calcio puede dar lugar a alteraciones en la función mitocondrial, se midieron ocr tanto en los mutantes sel-12 como en los animales de tipo salvaje para examinar el efecto de las mutaciones de sel-12 en la función y la salud mitocondriales. Los animales de tipo salvaje mostraron constantemente tasas basales de OCR por debajo de cinco picomoles por minuto, por gusano. Mientras que las tres cepas de mutantes sel-12 mostraron OCR significativamente elevado, de aproximadamente siete picomoles por minuto, por gusano.Tras la adición de FCCP, hubo un aumento en el OCR de tipo salvaje, así como mutantes sel-12, como se esperaba. Los animales de tipo salvaje mostraron un OCR máximo de aproximadamente siete picomoles por minuto, por gusano. Mientras que los mutantes sel-12 tenían OCR de aproximadamente 10 picomoles por minuto, por gusano.Utilice animales vivos, bien alimentados y asinzronizados en este ensayo, y evite la transferencia de huevos o cadáveres a pozos de ensayo. Además, la temperatura interna del instrumento no debe exceder los 25 grados centígrados. La lejía, el FCCP, el FUdR y el azida sódica son tóxicos.Por lo tanto, se debe tener cuidado de usar guantes de protección durante la preparación de soluciones de stock y la carga de medicamentos.

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