Name: Imagen intravital longitudinal del comportamiento de las células tumorales cerebrales en respuesta a una biopsia quirúrgica invasiva (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Aprende a realizar imagen intravital longitudinal de células tumorales cerebrales en ratones anestesiados para estudiar migración, invasión y proliferación tras biopsia quirúrgica. Este método revela cambios dinámicos en el comportamiento celular.

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Los autores agradecen a Anko de Graaff y al Hubrecht Imaging Center por su apoyo a las imágenes y a Ellen Wehrens y Hannah Johnson por la corrección y edición del manuscrito.

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité de Bienestar Animal de la Real Academia neerlandesa de las Artes y las Ciencias, Países Bajos. Los protocolos experimentales utilizados en este manuscrito fueron aprobados por la Centrale Commissie Dierproeven (CCD) y el Instantie voor Dierenwelzijn (IvD).
1. Implantación de células tumorales y preparación de ventanas de imágenes craneales
<ol><li>Preparación quirúrgica
	<ol>
<li>Use ratones adultos (>6 semanas de edad) de cualquier cepa o género. Sedar un ratón inyectando (fluanisona [neuroléptica] + fentanilo [opioide]) (0,4 ml/kg) + sedante de benzodiazepina (2 mg/kg) a una dosis de 1:1:2 en agua estéril. Evalúe el estado de sedación del animal con pellizco de dedo del dedo del dedo del tiempo. NOTA: En este protocolo, tanto los ratones hembra como los machos C57BL/6 se utilizaron debido al mismo trasfondo genético de la línea celular tumoral utilizada en estos experimentos (GL261). El ratón permanecerá completamente sedado durante 1,5 h. Alternativamente, utilice anestesia por inhalación como isoflurano (1.5%–2% mezcla de isoflurano/O2).</li>
		<li>Monte el ratón sobre un marco estereotáctico y fije la cabeza con una abrazadera de nariz y dos barras de oído.</li>
		<li>Utilice una lámpara de calefacción para preservar la temperatura corporal. La lámpara de calefacción debe utilizarse con precaución, alternativamente se pueden utilizar almohadillas de calefacción de recirculación de agua.</li>
		<li>Aplique un unpomén de ojos para proteger las córneas del ratón del secado.</li>
		<li>Utilice tijeras afiladas para afeitar el pelaje en el cráneo (área dorsal desde los ojos del ratón hasta la base de su cráneo) y desinfecte la piel expuesta con 70% de etanol.</li>
		<li>Corta la piel de forma circular con tijeras afiladas y raspa el periosteum debajo con un hisopo de algodón. Aplicar una gota de lidocaína 1% + epinefrina 1:100,000 durante 5 min, y eliminar el exceso con un hisopo de algodón.</li>
		<li>Pega los bordes de la piel al cráneo con pegamento de cianoacrilato.</li>
		<li>Coloque el marco estereotáctico bajo un microscopio estéreo de disección con aumento 4x.</li>
		<li>Visualice el cráneo a través del microscopio de disección y taladre una ranura circular de 5 mm de diámetro sobre el hueso parietal derecho. Realice este paso con cuidado y sólo superficialmente, evitando cualquier presión sobre el cráneo.</li>
		<li>Aplique una gota de tampón de corteza (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM de glucosa, búfer HEPES de 10 mM, 2 mM MgSO4y 2 mM CaCl2 [pH 7.4]) y levante la solapa ósea con fórceps delgados.</li>
		<li>Para los siguientes pasos, mantenga la superficie cerebral cubierta con tampón de corteza a menos que se indique lo contrario.</li>
		<li>Bajo el microscopio de disección, visualice la superficie cerebral y retire la dura mater usando pinzas curvas, cónicas y de punto muy fino. Si se produce sangrado en esta etapa, utilice una esponja de gelatina absorbible para detenerlo.</li>
	</ol></li>
	<li>Inyección de células tumorales
	<ol>
<li>Resuspenda la cantidad deseada de células tumorales fluorescentes en 3 l de PBS (por ejemplo, para los experimentos mostrados en este protocolo, se inyectaron 1 x 105 células GL261). NOTA: Si bien se puede utilizar cualquier marcador fluorescente, se recomienda encarecidamente un marcador nuclear para rastrear células tumorales individuales durante el análisis. Además, un marcador fluorescente ligado a la histona, como H2B, se puede utilizar para visualizar la condensación cromosómica y, por lo tanto, para monitorear la división celular. El uso de un marcador foto-conmutable, como Dendra2, permite el marcadofotográfico y el seguimiento de las células tumorales durante varios días 4,13.</li>
		<li>Cargue las células tumorales en una jeringa estanca con 10 ml con una aguja de punto 2 y fíjelas en el brazo del manipulador estereotaxico.</li>
		<li>Retire el búfer de corteza. Coloque la punta de la jeringa en el centro de la craneotomía e insértela a una profundidad de 0,5 mm de la superficie del cráneo. Opcionalmente, cree un pequeño espacio en el cerebro para acomodar la suspensión de la célula tumoral. Para ello, inserte la jeringa hasta una profundidad de 1 mm y, a continuación, recupere hasta 0,5 mm antes de la inyección.</li>
		<li>Aplique una gota de búfer de corteza.</li>
		<li>Inyecte lentamente la suspensión celular con un inyector de bomba de microjeringa (250–400 nL/min). Retire la jeringa y utilice una esponja de gelatina absorbible para detener cualquier sangrado, si es necesario.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de la ventana de imágenes craneales
	<ol>
<li>Retire el búfer de corteza y coloque una gota de aceite de silicona en el sitio de craneotomía para evitar burbujas de aire debajo de la ventana.</li>
		<li>Selle el cerebro expuesto con un cubreobjetos de 6 mm. Aplique pegamento de cianoacrilato entre el cubreobjetos y el cráneo. Presione suavemente el cubreobjetos contra el cráneo con la ayuda de pinzas finas para asegurar una distancia mínima entre el cerebro y la pinza.</li>
		<li>Aplique cemento acrílico dental en la superficie del cráneo, cubriendo el borde de la cubierta. Coloque un anillo delgado de acero inoxidable (1,5 mm de diámetro exterior, 1 mm de diámetro interior) alrededor de la craneotomía y deje que el cemento dental se seque. Opcionalmente, agregue un poco de pegamento en el borde para asegurar el anillo en la parte superior de la cabeza. NOTA: Este sistema de fijación de la cabeza es óptimo para la toma de imágenes en un microscopio invertido: los pequeños imanes incrustados en la caja de imágenes facilitan la fijación de la ventana de imagen craneal (CIW). En los experimentos mostrados en este protocolo, se utilizó un microscopio invertido. Para microscopios verticales, la fijación se puede lograr mediante una barra o un anillo con ranuras que se pueden conectar al microscopio con la ayuda de tornillos o una placa que se ajuste al anillo.</li>
		<li>Para el manejo del dolor, inyectar una dosis única de 100 g/kg de buprenorfina por vía subcutánea y permitir que el animal se recupere en una almohadilla de calentamiento.</li>
		<li>Coloque el ratón en una jaula individual con papel triturado para su enriquecimiento. Supervise de cerca el ratón diariamente durante los primeros días y 2 veces por semana, a partir de entonces, para el comportamiento normal, la reactividad y la apariencia.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Imágenes intravitales
NOTA: El intervalo de tiempo entre la inyección de células tumorales y la primera sesión de diagnóstico por imágenes intravital depende del tipo de línea celular tumoral utilizada. Para los experimentos mostrados en este protocolo, 1x 105 células GL261 fueron inyectadas e imágenes 10 días más tarde.
<ol><li>Preparación de imágenes
	<ol>
<li>Sedar el ratón usando anestesia por inhalación de isoflurano a través de una mascarilla facial (1,5%–2% mezcla de isoflurano/O 2).</li>
		<li>Inyectar el ratón por vía subcutánea con 100 ml de tampón salino para evitar la deshidratación. NOTA: Para obtener imágenes a largo plazo, el ratón se puede hidratar a través de una bomba de perfusión subcutánea.</li>
		<li>Coloque el ratón boca arriba en una caja de imágenes. Utilice una placa metálica con un orificio de 1 mm de diámetro y pequeños imanes incrustados alrededor de la abertura para proporcionar la fijación del CIW a la caja de imágenes. Introducir isoflurano a través de una mascarilla facial y ventilar por una salida en el otro lado de la caja (0.8%–1.5% mezcla de isoflurano/O 2). Opcionalmente, utilice cinta adhesiva para fijar el cuerpo del ratón. NOTA: El deextran etiquetado fluorescentemente para la visualización de los vasos sanguíneos u otros colorantes se pueden inyectar por vía intravenosa en este punto.</li>
		<li>Opcionalmente, utilice un oxímetro de pulso y una sonda de calentamiento para monitorear los signos vitales del ratón. NOTA: En este experimento, no fue necesario utilizar un oxímetro de pulso y una sonda de calentamiento ya que el ratón estaba estable durante todo el período de tiempo de imagen (2-3 h). Sin embargo, para tiempos de diagnóstico por imágenes más largos, es posible que se necesite un control más exhaustivo.</li>
		<li>Establezca el objetivo de agua 25x (por ejemplo, HCX IRAPO NA0.95 WD 2.5 mm) en la posición zmás baja y agregue una gran gota de agua. NOTA: El uso de un microdispensador de inmersión en agua es muy recomendable para experimentos a largo plazo, ya que permite a los científicos agregar agua durante el experimento. Alternativamente, se puede utilizar un objetivo seco.</li>
		<li>Transfiera la caja de imágenes al microscopio equipada con una cámara de clima oscuro mantenida a 37 oC. Lleve el objetivo al cubreobjetos CIW hasta que la gota de agua lo toque.</li>
		<li>Usando el modo de epifluorescencia, observe el tumor a través del ocular y ponga las células en el foco.</li>
	</ol></li>
	<li>Adquisición de imágenes de lapso de tiempo
	<ol>
<li>Seleccione varias posiciones de interés para la imagen y registre sus coordenadas en el software. Asegúrese de que las posiciones seleccionadas sean posiciones representativas de diferentes sitios del tumor (cada tumor puede ser diferente, pero para garantizar la consistencia, seleccione la misma cantidad de posiciones que son centrales para el núcleo del tumor y en los bordes de todos los ratones). NOTA: Se puede realizar una exploración de azulejos de una parte del tumor o de todo el tumor visible; sin embargo, si el tumor es grande, este método aumentará el lapso de tiempo entre las imágenes. Además, si las células tumorales se mueven rápidamente, puede ser difícil rastrear las mismas células con el tiempo.</li>
		<li>Cambie al modo multifotón y ajuste el láser a la longitud de onda correcta. Tenga en cuenta que, para evitar el fotodaño, se desean longitudes de onda más altas. NOTA: Para la toma de imágenes Dendra2, se utilizó una longitud de onda de 960 nm. Con el objetivo utilizado en estos experimentos, un zoom de 1.3 fue suficiente para obtener una buena resolución de los núcleos tumorales y escanear un área representativa del tumor.</li>
		<li>Vaya al modo en vivo y defina una z-stack para cada posición con el fin de adquirir el volumen máximo de células tumorales sin comprometer la resolución de la célula tumoral. Defina el tamaño del paso entre las imágenes como 3 m.</li>
		<li>Utilice el modo bidireccional para aumentar la velocidad de escaneo. La resolución de la imagen debe ser de al menos 512 x 512 píxeles.</li>
		<li>Adquirir imágenes del volumen del tumor en diferentes posiciones cada 20 minutos durante 2 h. Añadir agua al objetivo antes de cada adquisición de imagen. NOTA: Las imágenes de lapso de tiempo se pueden adquirir automáticamente estableciendo el lapso de tiempo correcto en el software. Sin embargo, el ratón puede moverse y la posición o z-stack puede cambiar con el tiempo, lo que provoca la pérdida de datos. Por lo tanto, se recomienda realizar el lapso de tiempo manualmente y comprobar y ajustar los cambios xyz entre adquisiciones.</li>
		<li>En este paso, opcionalmente, cambie el marcador fluorescente Dendra2. NOTA: A diferencia de las imágenes de lapso de tiempo (que permite estudiar las propiedades de las células tumorales individuales y cómo cambian con el tiempo), esto permitirá estudiar el área de la infiltración de células tumorales en el cerebro durante varios días4. Gligorijevic et al.13describe nal.</li>
		<li>Después de que se adquiera la última imagen, retire el ratón del escenario y permita que se recupere en una almohadilla de calentamiento. Para prevenir la deshidratación, se pueden administrar por vía subcutánea 100 l de salina. Coloque el ratón en su jaula hasta que se realice una lesión similar a la biopsia.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Lesión similar a la biopsia y reemplazo de CIW
<ol><li>Cree una lesión similar a una biopsia en el sitio del tumor 1 día después de la primera sesión de diagnóstico por imágenes. NOTA: Alternativamente, se puede realizar otro procedimiento, como la extirpación parcial del tumor.<ol>
<li>Sedar el ratón utilizando anestesia por inhalación de isoflurano como se describió anteriormente en el paso 2.1.1. NOTA: Si bien se puede utilizar anestesia inyectable, este procedimiento es más corto que la implantación de CIW, y la anestesia por inhalación permite controlar y reducir con precisión el tiempo que el ratón permanece sedado.</li>
		<li>Coloque el ratón sobre un marco estereotaxico y fije su cabeza con dos barras para los oídos y una abrazadera nasal. Compruebe la profundidad de la anestesia por la falta de reflejos del pedal. Use una mascarilla de anestesia para la cirugía estereotaxia para mantener el ratón sedado durante el procedimiento.</li>
		<li>Remoje un hisopo de algodón en acetona y extiéndalo alrededor del borde de la cubierta para suavizar el pegamento que sostiene el cubreobjetos contra el cerebro.</li>
		<li>Deslice los fórceps de punto fino debajo de la cubierta para levantarlo. Si el cubreobjetos se rompe en este punto, utilice los fórceps para retirar los trozos de vidrio.</li>
		<li>Aplica un tampón de corteza para mantener el cerebro húmedo.</li>
		<li>Sumerja una aguja de 25 G en el tumor a una profundidad de 1 mm. Retire la aguja y detenga el sangrado, si es necesario, aplicando una esponja estéril de gelatina. NOTA: Este paso se puede realizar bajo un estereomicroscopio fluorescente para identificar con mayor precisión la zona del tumor (si el tumor es demasiado pequeño). Además, se puede inyectar una solución de 1 l de poliestireno fluorescente de 1 m de perlas durante la punción para identificar el área biopsiada.</li>
		<li>Selle la superficie del cerebro con aceite de silicona y pegue un cubreobjetos de 6 mm en la parte superior.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Imágenes repetidas
<ol><li>Un día después de infligir la lesión similar a la biopsia (y en días consecutivos si es necesario), repita las imágenes intravitales como se describe en el paso 2 anterior para evaluar cómo cambia el comportamiento de las células tumorales con el tiempo. Seleccione varias posiciones del tumor que serían representativas de toda la zona del tumor. NOTA: Si se utilizaron perlas fluorescentes para identificar el área biopsiada, localícelas para crear una imagen del comportamiento de las células tumorales en las regiones biopsiadas en comparación con las regiones no biopsiadas.</li>
</ol>5. Análisis de imágenes
<ol><li>Si las imágenes de lapso de tiempo se adquirieron manualmente, combínelas en una carpeta.<ol>
<li>Abra el archivo LIF de lapso de tiempo en el software comercial asociado con el microscopio (por ejemplo, LasX o LAS AF). Seleccione la pestaña Proceso > Herramientas de proceso > Combinar. Seleccione la primera imagen de la secuencia de tiempo y haga clic en Primero. Seleccione la segunda imagen de la secuencia de tiempo y haga clic en Segundo. En Fusionar cotas, seleccione t para el tiempo. Haga clic en Aplicar. Se generará un nuevo archivo con dos puntos de tiempo. Repita este proceso para todos los puntos de tiempo, utilizando el archivo recién generado como la primera imagen de la secuencia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Corrija las z-stacks adquiridas para cualquier desplazamiento xyz. NOTA: Para los experimentos descritos en este protocolo, se utilizó un programa de software de Visual Basic diseñado a medida para la corrección. Alternativamente, se puede utilizar otro software disponible, como ImageJ o Imaris.<ol>
<li>Exporte los archivos TIFF desde el software haciendo clic con el botón derecho en el archivo de lapso de tiempo combinado. Seleccione Guardar datos RAW. Los archivos exportados se exportarán a una carpeta nombrada según el canal, la hora y la posición z.</li>
		<li>Abra los archivos TIFF en el programa de software de Visual Basic diseñado a medida.</li>
		<li>Defina el número de puntos de tiempo, pilas zy canales.</li>
		<li>Asigne un color a cada canal por el orden de aparición.</li>
		<li>En el panel Mostrar formulario, para cada punto de tiempo, corrija el desplazamiento en la z haciendo clic en los botones arriba (U) o abajo (D).</li>
		<li>En el panel de creación de imágenes Intravital, seleccione el canal que se utilizará para corregir el desplazamiento xy. Seleccione el canal verde que desea corregir, en función de la señal de las células tumorales. Haga clic en Automático para la corrección xy.</li>
		<li>Exporte las imágenes corregidas como una proyección máxima de tres pilas zconsecutivas. En el panel Selección, introduzca los números del primero (Inicio) y el último (Fin) z-slices que se exportarán. Seleccione Máx. Seleccione Carpetas separadas para Z. Haga clic en Hacer. Para cada uno de ellos, tres z-pilas, imágenes de lapso de tiempo se exportarán a una carpeta independiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Opcionalmente, corrija la deformación elástica del tejido. NOTA: Para los experimentos de deformación elástica de tejido, se utilizó un programa de software de compensación de movimiento de coincidencia para corregir la deformación de tejido rígido y elástico14.</li>
	<li>Realice un seguimiento de las celdas individuales en la pila zcompleta en la película de lapso de tiempo. NOTA: Las celdas tumorales se pueden rastrear manualmente utilizando, por ejemplo, un plugin ImageJ (MTrackJ). Aunque es preciso, esto se limita al plano xy y consume mucho tiempo. Alternativamente, las células tumorales se pueden rastrear automáticamente a lo largo del volumen zcompleto, utilizando la segmentación de células tumorales (por ejemplo, el software Imaris). Sin embargo, en tumores muy densos, el seguimiento automatizado es menos preciso y puede dar lugar a más errores de seguimiento.<ol>
<li>Abra y realice un seguimiento de cada serie de lapso de tiempo (durante tres pilas zconsecutivas) por separado. Arrastre la carpeta que contiene las imágenes de lapso de tiempo a ImageJ.</li>
		<li>Seleccione la pestaña Plugins > Tracking > MtrackJ. Realice un seguimiento de cada celda individual seleccionando Agregar y haciendo clic en cada celda en cada punto de tiempo.</li>
		<li>Extraiga la medida de las pistas haciendo clic en Medir y guardando el archivo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí describimos un método para estudiar los cambios en el comportamiento de las células tumorales a nivel de células únicas en respuesta a procedimientos quirúrgicos invasivos, como una biopsia, en el cerebro de un animal vivo. La combinación de imágenes multifotonas longitudinales con la implantación quirúrgica de un CIW crónicopermite cuantificar la migración, invasión y proliferación de células tumorales antes y después de la biopsia en el mismo animal 4. En comparación con otros enfoques utilizados para la monitorización de varios días tumorales, como la imagen bioluminiscente12,la RMN10o el PET/CT11,este método visualiza de forma única los tumores a nivel de una sola célula y, por lo tanto, proporciona información sobre el comportamiento celular progresión del tumor subyacente.
Para realizar correctamente este método, se deben dominar varios procedimientos. Los pasos más críticos de este protocolo son la implantación y el reemplazo de CIW. La complejidad técnica de estos pasos requiere precisión y habilidades quirúrgicas que se pueden adquirir con un entrenamiento constante. Las complicaciones durante la cirugía de CIW, como el sangrado que puede cubrir la superficie cerebral, pueden resultar difíciles para las imágenes posteriores. La falta de herramientas o ambienteestériles, así como la falta de sellado completo de la superficie cerebral, puede causar una infección en la superficie del cerebro (líquido blanco bajo el cubreobjetos), lo que hará que las imágenes sean problemáticas y comprometan fuertemente el resultado Interpretación. Otro problema común de este protocolo es el movimiento animal durante la toma de imágenes de lapso de tiempo. Mientras que cualquier desplazamiento xyz se puede corregir después del experimento, se recomienda corregir la coordenada de cada posición antes de cada punto de tiempo para evitar cualquier pérdida de información. La deformación del tejido es un problema adicional que se encuentra al tomar imágenes en un microscopio invertido. El tejido cerebral sufre de compresión cuando el ratón se coloca en posición supina. Dependiendo del grado de deformación del tejido, el seguimiento de las células tumorales puede conducir a una cuantificación errónea del desplazamiento celular. Para evitar esto, se puede utilizar un software para la deformación rígida y elástica14.
Si bien este procedimiento ofrece una amplia aplicación para estudiar los cambios en el comportamiento tumoral, se deben considerar ciertas limitaciones. Este método permite a los científicos realizar imágenes hasta una profundidad de 1,6 mm (con el uso de un oscilador óptico paramétrico); sin embargo, esto significa que la imagen está restringida a las áreas superficiales de la corteza cerebral15. Por lo tanto, algunos tumores cerebrales ubicados en estructuras cerebrales profundas, incluyendo gliomas pontinos intrínsecos difusos ubicados en la región del tronco encefálico, no pueden ser estudiados en su entorno cerebral original con este protocolo. Otra limitación de este protocolo es el volumen del tumor que se puede crear en la imagen. Aunque se desea la exploración del volumen total del tumor para obtener la máxima información, a menudo, el tamaño del tumor y la velocidad de las células migratorias pueden ser factores limitantes. Para cada tipo de tumor, debe considerarse un lapso de tiempo óptimo para las imágenes. Si el período de tiempo entre las imágenes es demasiado largo, puede ser difícil rastrear las células tumorales. El uso de un escáner resonante puede disminuir en gran medida el tiempo de escaneo, permitiendo la toma de imágenes de un tumor más grande16. Por último, el análisis manual de imágenes de este protocolo puede llevar mucho tiempo, por lo que en su lugar, se pueden utilizar programas para el seguimiento 3D automatizado. Sin embargo, el resultado del seguimiento siempre debe ser supervisado visualmente ya que los algoritmos para el seguimiento automatizado de celdas rara vez están diseñados para recapitular exactamente la migración de las celdas de interés.
Las ligeras adaptaciones del protocolo descrito aquí pueden permitir una gama aún más amplia de aplicaciones. En lugar de realizar biopsias, se pueden implementar otras intervenciones (quirúrgicas), como la resección parcial del tumor o la administración de obleas de quimioterapia. La adición de compuestos a través de un microtubo implantado quirúrgicamente puede combinarse con este protocolo para apuntar farmacológicamente moléculas específicas de interés. Esperamos que este modelo sea útil en estudios destinados a analizar el impacto de una determinada intervención en el comportamiento de las células tumorales. La posibilidad de realizar medidas repetidas en el mismo animal no sólo proporciona datos más precisos sobre los cambios que se producen en el tumor, sino que también reduce en gran medida el número de animales experimentales necesarios para el estudio.

El estándar de atención para la mayoría de los tumores sólidos incluyebiopsia de tejido para diagnóstico, pronóstico y determinación de tratamiento personalizado 1,2. En general, estos procedimientos dan beneficios clínicos, pero la evidencia reciente indica que la biopsia y otros procedimientos más invasivos, como la resección tumoral, también pueden influir negativamente en la progresión tumoral3,4,5 , 6. Si bien estos procedimientos siguen siendo indispensables en la atención hospitalaria y sus beneficios superan sus efectos negativos, es necesario comprender plenamente los mecanismos detrás de estos efectos negativos para maximizar la seguridad de los pacientes y la influencias positivas de estos procedimientos y los hacen aún más beneficiosos desde el punto de valor clínico.
Los efectos no deseados mediados por biopsia en la progresión tumoral se desencadenan por alteraciones sistémicas y cambios en el microambiente tumoral en respuesta a la interrupción del tejido4,5. Por lo tanto, es necesario estudiar este proceso en animales vivos. Sin embargo, las consecuencias sutiles de estos procedimientos mínimamente invasivos a menudo pueden ser disfrazadas por grandes variaciones entre individuos. Los métodos convencionales basados en inmunohistoquímica o análisis de expresiones transcripcionales pueden pasar por alto estos efectos o requerir un gran número de animales para identificarlos. Además, estos enfoques estáticos carecen de la capacidad de identificar cambios en el comportamiento de las células tumorales, como la migración y la invasión, procesos dinámicos que se correlacionan con la neoplasia maligna tumoral. Estas características de las células tumorales son de particular importancia para los tumores cerebrales altamente agresivos, como el glioblastoma multiforme (GBM), donde la propagación local de las células tumorales limita la resección quirúrgica y disminuye la supervivencia del paciente7. Para entender completamente cómo las biopsias afectan el comportamiento de las células GBM, se necesita un enfoque longitudinal que permita la visualización de estas células en el contexto fisiológico de los organismos vivos.
El reciente desarrollo de imágenes intravitales de alta resolución en combinación con ventanas de imágenes crónicas implantadas quirúrgicamente permite a los científicos estudiar el comportamiento dinámico de las células tumorales en ratones vivos durante varios días8,9. Con este enfoque poderoso, podemos estudiar cómo el comportamiento proliferativo, migratorio e infiltrado de las células tumorales cambia durante varios días en respuesta a una biopsia en el mismo ratón. En comparación con otras técnicas que permiten el monitoreo de tumores de varios días en ratones vivos, como la resonancia magnética (RM)10,la tomografía por emisión de positrones/tomografía computarizada (PET/CT)11,o la imagen bioluminiscente12, enfoque único ofrece la posibilidad de estudiar el comportamiento de las células tumorales a nivel de una sola célula y desentrañar los cambios sutiles que ocurren dentro del tumor.
Aquí, describimos un método detallado para realizar lesiones similares a biopsias e imágenes intravitales longitudinales pre y postbiopsia en el cerebro de ratones portadores de tumores. Este método se puede aplicar potencialmente para estudiar otras intervenciones quirúrgicas, como la resección parcial del tumor o la implantación de obleas de quimioterapia.

<table><tbody><tr><td>Agujas hipodérmicas de 25g x 16 mm</td><td>BD Microlance</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>701 RN 10uL SYR C/O NEEDLE</td><td>Hamilton</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>Esponja de gelatina absorbible</td><td>Pfizer</td><td>Gelfoam</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos redondos 6 mm</td><td>VWR international</td><td>631-0168</td><td></td></tr><tr><td>Pegamento de cianoacrilato</td><td>Pattex</td><td>Pattex Ultra gel</td><td></td></tr><tr><td>Dental cemento</td><td>Vertex Dental</td> Vertex Taladro <td>autopolimerizable</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dremel Dremel</td><td>3000 (el taladro dental puede ser más conveniente) + 105 Cortador</td><td></td>de grabado</tr><tr><td>Pinzas curvas finas</td><td>Dumont</td><td>AGT508</td><td></td></tr><tr><td>Hypnorm</td><td>VetaPharma Ltd</td><td>Hypnorm (Citrato de fentanilo 0,315 mg/ml + Fluanisona 10 mg/ml)</td><td></td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>Actavis</td><td>Midazolam Actavis 5mg/ml</td><td></td></tr><tr><td>Pomada oftálmica</td><td>Kela Veterinaria</td><td>Duodrops veter kela 10 m</td><td></td></tr><tr><td>Inyector estereotáxico por excelencia (QSI)</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>Aceite de silicona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>181838</td><td></td></tr><tr><td>Marco estereotáxico</td><td>Stoelting</td><td>Lab estereotáxico estándar, rata y ratón</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico quirúrgico</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temgesic (0,3 mg/ml)</td><td>BD Pharmaceuticals</td><td>283732</td><td></td></tr><tr><td>Vannas T&uuml; Tijeras de resorte Bingen</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8508</td><td></td></tr><tr><td>Xilocaína (Lidocaína 1% + Epinefrina 1:100.000) Anestésico local</td><td>Astrazeneca</td><td>Xilocaína (Lidocaína 1% + Epinefrina 1:100.000)</td><td></td></tr></tbody></table>

imagen intravital longitudinal del comportamiento de las células tumorales cerebrales en respuesta a una biopsia quirúrgica invasiva

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Las biopsias son estándar de atención para el tratamiento oncológico y son clínicamente beneficiosas, ya que permiten el diagnóstico de tumores sólidos, pronóstico y determinación de tratamiento personalizado. Sin embargo, la perturbación de la arquitectura tumoral por biopsia y otros procedimientos invasivos se ha asociado con efectos no deseados en la progresión tumoral, que deben estudiarse en profundidad para mejorar aún más el beneficio clínico de estos procedimientos. Los enfoques estáticos convencionales, que solo proporcionan una instantánea del tumor, son limitados en su capacidad para revelar el impacto de la biopsia en el comportamiento de las células tumorales, como la migración, un proceso estrechamente relacionado con la neoplasia maligna del tumor. En particular, la migración de células tumorales es la clave en los tumores cerebrales altamente agresivos, donde la diseminación del tumor local hace que la resección total del tumor sea prácticamente imposible. El desarrollo de imágenes multifotonas y ventanas de imágenes crónicas permite a los científicos estudiar este proceso dinámico en animales vivos a lo largo del tiempo. Aquí, describimos un método para la toma de imágenes longitudinales de alta resolución de las células tumorales cerebrales antes y después de una biopsia en el mismo animal vivo. Este enfoque permite estudiar el impacto de este procedimiento en el comportamiento de las células tumorales (migración, invasión y proliferación). Además, discutimos las ventajas y limitaciones de esta técnica, así como la capacidad de esta metodología para estudiar los cambios en el comportamiento de las células cancerosas para otras intervenciones quirúrgicas, incluyendo la resección tumoral o la implantación de quimioterapia Obleas.

Para evaluar el impacto de la biopsia en el comportamiento de las células tumorales cerebrales, realizamos el procedimiento descrito en este protocolo. Glioma—células GL261— que expresaban una proteína fluorescente nuclear (H2B-Dendra2) se inyectaron en el cerebro de ratones C57BL/6, y se implantó un CIW crónico. Se realizaron imágenes intravitales de lapso de tiempo en la mismalesión animal anterior y posterior a la biopsia en el tumor (Figura 1A,B). La migración de células tumorales individuales se determinó mediante el seguimiento de la ruta de migración a lo largo del tiempo en diferentes planos xy de la pila z(Figura1C)y se traza como un porcentaje de células migratorias pre- y postbiopsia (Figura 1F). La tasa de proliferación de células tumorales se cuantificó sobre la base de la condensación de Dendra2 con etiqueta H2B sobre la mitosis (Figura1D)y se traza como un porcentaje de células divisorias antes y despuesde la biopsia (Figura1E). Comparamos la distribución de la velocidad de migración antes y después de la biopsia en el mismo tumor y encontramos que el número de células migratorias (velocidad &gt; 4 m/h) aumentó después de la intervención, con una disminución asociada en el número de células lentas/no migratorias ( velocidad &lt; 4 m/h) (Figura2A). En promedio por tumor, observamos un aumento de 1,75 veces (SD a 0,16) en el porcentaje de células migratorias cuando se realizó una lesión similar a una biopsia, en comparación con los ratones de control que no fueron biopsiados (Figura2B). Monitorizamos el comportamiento de las células tumorales durante otra semana y descubrimos que, aunque el porcentaje de células tumorales migratorias finalmente disminuyó tanto en el control como en los ratones biopsiados, los ratones biopsiados todavía mostraban una mayor capacidad migratoria que los ratones de control ( Figura 2C). El análisis del comportamiento proliferativo de las células tumorales a lo largo del tiempo mostró un aumento de 1,52 (SD a 0,26) en el número de eventos mitoticos tras la biopsia, en relación con los ratones de control no biopsiados (Figura2D).
Para probar si los efectos observados de la biopsia en el comportamiento proliferativo y migratorio de las células tumorales fue un artefacto debido a la cirugía de reemplazo de CIW (necesaria para realizar una lesión similar a una biopsia), monitoreamos el comportamiento de las células tumorales en un grupo de ratones que se sometieron a CIW reemplazo sin biopsia. En este grupo, no observamos ninguna inducción de migración o proliferación de células tumorales, lo que indica que el aumento en las tasas de proliferación y migración de células tumorales se desencadenó específicamente por una lesión similar a una biopsia (Figura3A,B).
La fotoconvertibilidad estable de la proteína fluorescente Dendra2 permite estudiar la infiltración de células tumorales durante varios días. Tras la exposición a la luz ultravioleta/azul, Dendra2 cambia irreversiblemente de verde a rojo. Usando esta propiedad, se iluminó una región cuadrada del tumor y se fotomarcaron 200 células tumorales de Dendra2 antes de la biopsia (Figura4). Un día después de la biopsia, relocalizamos la región foto-cambiada y medimos el volumen de células tumorales que se habían infiltrado en el tejido tumoral circundante. Encontramos que el área de infiltración era 1,72 (SD a 0,41) veces más grande en los tumores después de una lesión similar a una biopsia en comparación con los tumores de control no biopsiapsiados (Figura4). Aunque este enfoque solo proporciona información sobre el comportamiento infiltrativo a granel de células tumorales y no en un nivel de célula única, es menos lento que el enfoque de imágenes de lapso de tiempo y puede ser el método de elección para las preguntas de investigación centradas exclusivamente en estudiar el comportamiento infiltrado.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59278/59278fig1.jpg"> Figura 1: Configuración experimental para la toma de imágenes intravitales longitudinales del efecto de la biopsia en el comportamiento de las células tumorales. (A) Diagrama que muestra el diseño del anillo y el soporte magnético. (B) Representación esquemática del flujo de trabajo experimental. Las células tumorales se inyectan en el cerebro de los ratones y se establece un CIW. Tras el desarrollo del tumor, se realiza una primera sesión de imágenes de lapso de tiempo (prebiopsia). Al día siguiente, se implementan la biopsia y el reemplazo de CIW. El día después de la toma de imágenes (postbiopsia), se realiza una segunda sesión de diagnóstico por imágenes de lapso de tiempo. Para efectos a largo plazo, se pueden realizar sesiones de diagnóstico por imágenes posteriores. (C) Las imágenes muestran instantáneas representativas de una película de lapso de tiempo en la que se rastreó las células tumorales GL261 H2B-Dendra2. Las líneas rojas representan las huellas de células tumorales individuales. La barra de escala a 50 m. (D) Imágenes representativas de lapso de tiempo in vivo que muestran células divisorias en tumores GL261 H2B-Dendra2. Se indican diferentes etapas de la mitosis: profase (P), prometafase (Pm), metafase (M), anafase (A) y telofase (T). La barra de la escala es de 50 m. Los gráficos indican el porcentaje de (E) migratorio y (F) células divisorias pre- y postbiopsia. Cada punto indica el porcentaje de células migratorias en todas las posiciones medidas en un animal individual. Los datos se muestran como medias de seis ratones (**P &lt; 0.01, t-test emparejado). Esta cifra ha sido modificada de Alieva et al.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59278/59278fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59278/59278fig2.jpg"> Figura 2: Resultados representativos que muestran el impacto de la biopsia en las tasas de migración y proliferación de células tumorales. (A) Gráficas de cascada que muestran el cambio en la distribución de la velocidad celular en relación con la migración basal en ratones individuales. Los datos se muestran como medias de cinco ratones. (B) El número de células migratorias en animales de control (azul) y biopsiados (rojos) normalizados al número de células migratorias preintervención (n 6 ratones, ***P &lt; 0.0001, Prueba tdel estudiante). (C) Se rastreó el comportamiento de las células tumorales durante varios días. Se muestra el número normalizado (en relación con la preintervención) de células migratorias en ratones individuales a lo largo del tiempo(n &gt; 4 ratones por condición, ***P &lt; 0.0001, ANOVA bidireccional). (D) El número normalizado de células divisorias en animales de control (azul) y biopsiados (rojos). Por animal individual, los valores posteriores a la intervención se normalizaron a los valores de preintervención (n 5 ratones, **P &lt; 0,01, prueba tdel estudiante). Esta cifra ha sido modificada de Alieva et al.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59278/59278fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59278/59278fig3.jpg"> Figura 3: El reemplazo de CIW no tiene ningún efecto sobre el comportamiento de las células tumorales. Las imágenes intravitales longitudinales muestran que el reemplazo del CIW sin biopsia no tiene ningún efecto sobre las tasas de migración y proliferación. (A) El aumento en el número de células migratorias para las condiciones indicadas. Cada símbolo representa la media de un ratón individual, y n4 ratones. (B) El aumento en el número de células proliferantes para las condiciones indicadas. Cada símbolo representa la media deun ratón individual (n x 4 ratones, **P &lt; 0,01,***P &lt; 0.001, ns á aNOVA unidireccional no significativo con la prueba post hoc de Newman-Keuls). Esta cifra ha sido modificada de Alieva et al.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59278/59278fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59278/59278fig4.jpg"> Figura 4: Diagrama que muestra la configuración experimental y los resultados representativos obtenidos con la fotoconmutación Dendra2. Para monitorear la infiltración de células tumorales tras la biopsia, las células tumorales que expresan Dendra2 se cambian en una región cuadrada por iluminación UV/luz azul e imágenes, 1 día antes de la biopsia. Un día después de la biopsia, la región foto-cambiada es relocalizada y reimaged. Se muestran imágenes representativas de Dendra2 de infiltración de células tumorales, corregidas mediante la resta de canal. La línea de puntos blanca representa el área de infiltración. La barra de la báscula es de 50 m. El gráfico muestra el aumento del área fotocambiada trazada para ratones biopsiados (rojo) y de control (azul). Cada punto representa el valor mediode un ratón individual (n 5 ratones, *P &lt; 0,05, prueba tdel estudiante). Esta cifra ha sido modificada de Alieva et al.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59278/59278fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí describimos un método para la toma de imágenes multifotonas de lapso de tiempo de alta resolución de células tumorales cerebrales antes y después de una intervención quirúrgica invasiva (por ejemplo, biopsia) dentro del mismo animal vivo. Este método permite estudiar el impacto de estos procedimientos quirúrgicos invasivos en el comportamiento migratorio, invasivo y proliferativo de las células tumorales a un nivel de células únicas.

Imagen intravital longitudinal del comportamiento de las células tumorales cerebrales en respuesta a una biopsia quirúrgica invasiva

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Este protocolo permite al usuario estudiar el impacto de los procedimientos quirúrgicos invasivos utilizados en la clínica en los comportamientos de las células tumorales, como la migración, la invasión y la proliferación. Este método permite visualizar de forma exclusiva el mismo tumor antes y después de un procedimiento invasivo, proporcionando una visión que podría perderse en un enfoque no longitudinal. Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del de la parte del de la de la parte del de los pies en un ratón adulto anestesiado, monte el ratón en un marco estereotáctico y asegure la cabeza con una abrazadera nasal y dos barras para los oídos.Utilice una lámpara de calentamiento para preservar la temperatura corporal y aplique un ung ón en los ojos del animal. Usando tijeras afiladas, afeita el pelaje en el cráneo desde los ojos hasta la base del cráneo, y usa 70%etanol para esterilizar la piel expuesta. Cortar la piel de una manera circular, y utilizar un hisopo de algodón para raspar el periosteo expuesto.Tratar el área quirúrgica con una gota de 1%lidocaína, y una concentración de 1:100 000 de epinefrina durante cinco minutos antes de eliminar el exceso de solución con un hisopo de algodón. Utilice pegamento de cianoacrilato para adherir los bordes de la piel al cráneo, y coloque el marco estereotáctico bajo un microscopio estéreo de disección con un aumento de 4x. A continuación, taladre cuidadosamente una ranura circular superficial, de cinco milímetros de diámetro, sobre el hueso parietal derecho.Y aplique una gota de búfer de corteza a la ranura. Utilice fórceps delgados para levantar la solapa ósea para visualizar la superficie del cerebro, y utilice fórceps de punto curvos, cónicos y muy finos para eliminar la duramadre. Si se produce sangrado, utilice una esponja de gelatina absorbible para lograr la hemostasia.Para la inyección de células tumorales, cargue alrededor de tres microlitros de las células en una jeringa hermética al gas de cinco microlitros equipada con una aguja de estilo de punto dos. Fije la aguja en el brazo manipulador estereotaxico y retire el tampón de la corteza del tejido expuesto. Coloque la punta de la jeringa en el centro de la craneotomía e inserte la aguja a una profundidad de 0,5 milímetros de la superficie del cráneo.Luego, agregue una gota de tampón de corteza a la craneotomía y use un inyector de bomba de microsingor para entregar las células a una velocidad de 250 a 400 nanolitros por minuto. Para preparar la ventana de imágenes craneales, reemplace el tampón de la corteza con una gota de aceite de silicona en el sitio de craneotomía para evitar burbujas de aire debajo de la ventana. Selle el cerebro expuesto con un cubreobjetos de seis milímetros y aplique pegamento de cianoacrilato entre el cubreobjetos y el cráneo.Luego usa pinzas finas para presionar suavemente el cubreobjetos contra el cráneo. En el punto de tiempo experimental adecuado, coloque el ratón boca arriba en un cuadro de imágenes y establezca el objetivo de agua 25x en la posición z más baja. Agregue una gran gota de agua al objetivo y transfiera la caja de imágenes a la cámara de clima oscuro de 37 grados Celsius del microscopio.Lleve el objetivo a la cubierta de la ventana de imágenes craneales hasta que la gota de agua toque el cubreobjetos. Y usando el modo de epifluorescencia, observe el tumor a través del ocular para enfocar las células. Ajuste el láser a la longitud de onda correcta y seleccione el modo en vivo.Después de seleccionar varias posiciones de interés para la creación de imágenes, registre sus coordenadas en el software. Defina una pila z para cada posición para adquirir el volumen máximo de células tumorales sin comprometer la resolución de las células tumorales, con el tamaño de paso entre las imágenes establecido en tres micrómetros. A continuación, adquirir imágenes del volumen tumoral en diferentes posiciones cada 20 minutos durante dos horas, añadiendo agua al objetivo antes de cada adquisición de imagen.Después de adquirir la última imagen, transfiera el ratón a una almohadilla de calefacción con monitoreo hasta la recuperación completa. Un día después de la primera sesión de imágenes, asegure el ratón anestesiado en el marco estereotaxico como se ha demostrado, y use un hisopo de algodón empapado en acetona para limpiar los bordes del cubreobjetos hasta que el pegamento se ablande. Deslice una aguja de calibre 25 debajo del cubreobjetos y use fórceps de punto delgado para levantarlo e hidrate la craneotomía con tampón de corteza fresca.Perfore el tumor a una profundidad de un milímetro con una aguja de calibre 25, deteniendo cualquier sangrado con una esponja de gelatina estéril, y sellar la superficie del cerebro con aceite de silicona fresco. A continuación, pegue un nuevo cubreobjetos de seis milímetros sobre la herida. Para el análisis de imágenes, abra el archivo LIF de lapso de tiempo en el programa de software del microscopio y seleccione la pestaña Procesar, Herramientas de proceso y Combinar.Seleccione la primera imagen de la secuencia de tiempo y haga clic primero. Seleccione la segunda imagen de la secuencia de tiempo y haga clic en segundo lugar. En Combinar cotas, seleccione t para el tiempo y, a continuación, haga clic en Aplicar.Se generará un nuevo archivo con dos puntos de tiempo. Después de realizar un seguimiento de cada serie de lapso de tiempo para tres pilas z consecutivas por separado, arrastre la carpeta que contiene las imágenes de lapso de tiempo a ImageJ. Seleccione la pestaña Plugins, Tracking y MtrackJ.Para realizar un seguimiento de cada celda individual, seleccione Agregar y haga clic en cada celda en cada punto de tiempo. A continuación, haga clic en medir y guarde el archivo para extraer la medida de las pistas. La migración de células tumorales individuales se puede determinar mediante el seguimiento de la ruta de migración a lo largo del tiempo en diferentes planos xy de la pila z y se traza como un porcentaje de las células migratorias antes y después de la biopsia.La tasa de proliferación de células tumorales se puede cuantificar en función de la condensación de Dendra2 con etiqueta H2B tras mitosis y trazarse como un porcentaje de las células divisorias antes y después de la biopsia. La comparación de la distribución de la velocidad de migración antes y después de la biopsia en el mismo tumor, revela que el número de células migratorias aumenta después de la intervención, con una disminución asociada en el número de células lentas a no migratorias. En promedio por tumor, se observa un aumento de 1,75 veces el porcentaje de células migratorias cuando se realiza una lesión similar a una biopsia, en comparación con los ratones no biopsiados de control.Aunque el porcentaje de células tumorales migratorias eventualmente disminuye tanto en ratones con control como en biopsia, los ratones biopsiados todavía presentan una mayor capacidad migratoria que los ratones de control en general. El comportamiento proliferativo de células tumorales también demuestra un aumento de 1,52 veces en el número de eventos mitóticos tras la biopsia a lo largo del tiempo, en relación con ratones de control nobiados. Cabe destacar que no se observa ninguna inducción de la migración o proliferación de células tumorales después del reemplazo de ventanas de imágenes craneales sin biopsia, lo que indica que el aumento en la proliferación de células tumorales y las tasas de migración se desencadena específicamente por la lesión similar a la biopsia.Es importante trabajar con alta precisión y habilidad quirúrgica durante los pasos de imagen craneal, implantación y reemplazo. Puede ser necesaria una práctica extensa.

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Imagen intravital longitudinal del comportamiento de las células tumorales cerebrales en respuesta a una biopsia quirúrgica invasiva (Video) | JoVE Journal

Imagen intravital longitudinal del comportamiento de las células tumorales cerebrales en respuesta a una biopsia quirúrgica invasiva

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