Name: Colorimétrico análisis de alcalina fosfatasa actividad biofilm de S. aureus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 59 s
Description: Aprende a cuantificar la actividad de fosfatasa alcalina en biofilms de S. aureus mediante un ensayo colorimétrico de alto rendimiento en placas de 96 pocillos. Este método sensible facilita el estudio de la formación de biofilms bacterianos.

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Agradecemos a Guillermo Rainey Harper College y la Universidad de Illinois en Chicago para la facilidad de llevar a cabo estos experimentos. También agradecemos a McGraw Hill Foundation por su generoso apoyo.

1. medio preparación
<ol><li>Preparar 1 L de caldo de soja tríptica (TSB): en 1 L de agua destilada, agregar 15 g de digerido pancreático de caseína, 5 g de papaic recopilación de harina de soja, 3 g de cloruro sódico, 2,5 g de dextrosa y 2.5 g de fosfato dipotásico. Esterilizar antes de uso.</li>
	<li>Para Agar peptona de soja (TSA), añadir 15 g de agar en 1 L de TSB, autoclave. Luego déjelo enfriar a temperatura ambiente. A continuación, vierta en una proporción de 20 mL por placa de Petri (100 x 15 mm).</li>
	<li>Medio de cultivo de biofilm: Añadir 10 g de glucosa a 1 L de esterilizado TSB. Esterilizar por filtración usando un filtro de 0.2 μm.</li>
</ol>2. formación del Biofilm de S. aureus en placa de cultivo de tejidos bien 96
Nota: El biofilm de S. aureus se cultiva como se describió anteriormente6,21.
<ol><li>Inocular una colonia individual de S. aureus de TSA en 10 mL de TSB y crecer durante la noche a 37 ° C.</li>
	<li>Diluir la cultura durante la noche en 10 mL de TSB/glucosa (10 g/L) en una proporción de 1: 100 (v/v). Vórtice suavemente a la mezcla para una concentración constante.</li>
	<li>Transferir 200 mL de cultura diluida en un total de 18 pozos (más para los grupos experimentales, tal control de biofilm no para sugerir una relación con la actividad ALP6) de una 96 placa bien. Uso de tríos para cada momento: 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min y 75 min. Consulte el paso 3.2.</li>
	<li>Incube la placa bien 96 a 37 ° C durante 24 h para la formación de biofilm6,21.</li>
	<li>Decantar el sobrenadante por aspiración.</li>
	<li>Lave cada uno con 1 x solución de tampón fosfato (PBS, pH 7,4), centrifugar durante 5 min a 15.000 x g y decantar el sobrenadante por aspiración.</li>
</ol>3. medición de la actividad ALP en Biofilm de S. aureus
Nota: Actividad de la ALP se midió como descrito6,18.
<ol><li>Añadir 75 mL de tampón substrato ALP consisten pNFF disponible en el mercado para cada bien del paso 2.6 y comenzar el tiempo de grabación. Registrar cada momento por triplicado.</li>
	<li>Después de la incubación durante un tiempo variado: min 0 (control), 15 min, 30 min, 45 min, 60 min y 75 min respectivamente, añaden 75 μl de NaOH 5 de M para detener la reacción.</li>
	<li>Centrifugar la placa por 5 min a 15.000 x g.</li>
	<li>Transferir 100 μl de sobrenadante a un nuevo plato bien 96 para medición colorimétrica.</li>
	<li>Medir la absorbancia de cada bien a 405 nm usando un 96 bien placa de lector. Utilizar el tiempo de 0 min punto de pozos para control de ruido de fondo de 405 nm.</li>
	<li>Repetir todo el experimento en tres platos bien 96 individuales.</li>
</ol>

<ol><li>Coleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+alkaline+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of alkaline phosphatase.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).</li>
<li>Sharma, U., Pal, D., Prasad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+Phosphatase%3A+An+Overview%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Alkaline Phosphatase: An Overview.</a> Indian Journal of Clinical Biochemistry. 29 (3), July-Sept 269-278 (2014).</li>
<li>Mitchell, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequencies+of+elevated+alkaline+phosphatase+activity+and+rickets+exist+in+extremely+low+birth+weight+infants+despite+current+nutritional+support%5BTitle%5D)+AND+%22Boston+Medical+Center+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">High frequencies of elevated alkaline phosphatase activity and rickets exist in extremely low birth weight infants despite current nutritional support.</a> Boston Medical Center Pediatrics. 9, 47(2009).</li>
<li>Fawley, J., Gourlay, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+alkaline+phosphatase%3A+A+summary+of+its+role+in+clinical+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Intestinal alkaline phosphatase: A summary of its role in clinical disease.</a> Journal of Surgical Research. 202 (1), 225-234 (2016).</li>
<li>Derman, A. I., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+Alkaline+Phosphatase+Localized+to+the+Cytoplasm+Slowly+Acquires+Enzymatic+Activity+in+Cells+Whose+Growth+Has+Been+Suspended%3A+a+Caution+for+Gene+Fusion+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli Alkaline Phosphatase Localized to the Cytoplasm Slowly Acquires Enzymatic Activity in Cells Whose Growth Has Been Suspended: a Caution for Gene Fusion Studies.</a> Journal of Bacteriology. 177 (13), 3764-3770 (1995).</li>
<li>Danikowski, K. M., Cheng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+Phosphatase+Activity+of+Staphylococcus+aureus+grown+in+Biofilm+and+Suspension+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Alkaline Phosphatase Activity of Staphylococcus aureus grown in Biofilm and Suspension Cultures.</a> Current Microbiology. 75, 1226-1230 (2018).</li>
<li>Okabayashi, K., Futai, M., Mizuno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+Acid+and+Alkaline+Phosphatases+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Localization of Acid and Alkaline Phosphatases in Staphylococcus aureus.</a> Japanese Journal of Microbiology. 18 (4), 287-294 (1974).</li>
<li>Cheng, K. J., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+Phosphatase+Activity+of+Rumen+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Alkaline Phosphatase Activity of Rumen Bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. , 586-590 (1997).</li>
<li>Berezhetskyy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatase+conductometric+biosensor+for+heavy-metal+ions+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Innovation+and+Research+in+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Phosphatase conductometric biosensor for heavy-metal ions determination.</a> Innovation and Research in Biomedical Engineering. 29 (2-3), 136-140 (2008).</li>
<li>Park, E. J., Kang, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+bacterial+alkaline+phosphatase+assay+for+rapid+monitoring+of+bacterial+counts+on+spinach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">The use of bacterial alkaline phosphatase assay for rapid monitoring of bacterial counts on spinach.</a> Journal of Food Science. 73 (5), M236-M238 (2008).</li>
<li>Barber, M., Kuper, S. W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Staphylococcus+pyogenes+by+the+phosphatase+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology+and+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Identification of Staphylococcus pyogenes by the phosphatase reaction.</a> The Journal of Pathology and Bacteriology. 63, 65-68 (1951).</li>
<li>Wolf, P. L., Von der Muehll, E., Ludwick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+test+to+differentiate+Serratia+from+Enterobacter%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">A new test to differentiate Serratia from Enterobacter.</a> American Journal of Clinical Pathology. 56, 241-243 (1972).</li>
<li>Rangam, C. M., Katdare, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatase+activity+of+Staphylococci+as+an+indication+of+their+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Phosphatase activity of Staphylococci as an indication of their pathogenicity.</a> Indian Journal of Medical Science. 8, 610-613 (1954).</li>
<li>Flemming, H. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+an+emergent+form+of+bacterial+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).</li>
<li>Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Antimicrobial+Agents%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 35, 322-332 (2010).</li>
<li>Ito, A., Taniuchi, A., May, T., Kawata, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+antibiotic+resistance+of+Escherichia+coli+in+mature+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Increased antibiotic resistance of Escherichia coli in mature biofilms.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 4093-4100 (2009).</li>
<li>Witherow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Ten-Week+Biochemistry+Lab+Project+Studying+Wild-Type+and+Mutant+Bacterial+Alkaline+Phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">A Ten-Week Biochemistry Lab Project Studying Wild-Type and Mutant Bacterial Alkaline Phosphatase.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (6), Nov/Dec (2016).</li>
<li>Henthorn, P., Zervos, P., Raducha, M., Harris, H., Kadesch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+human+placental+alkaline+phosphatase+gene+in+transfected+cells%3A+Use+as+a+reporter+for+studies+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: Use as a reporter for studies of gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 85, 6324-6346 (1988).</li>
<li>Horney, B. S., Farmer, A. J., Honor, D. J., MacKenzie, A., Burton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+of+alkaline+phosphatase+isoenzymes+in+the+serum+of+hyperthyroid+cats%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis of alkaline phosphatase isoenzymes in the serum of hyperthyroid cats.</a> Veterinary Clinical Pathology. 23 (3), 98-102 (1994).</li>
<li>Farley, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Skeletal+Alkaline+Phosphatase+in+Osteoporotic+Serum+by+Wheat+Germ+Agglutinin+Precipitation%2C+Heat+Inactivation%2C+and+a+Two-Site+Immunoradiometric+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantification of Skeletal Alkaline Phosphatase in Osteoporotic Serum by Wheat Germ Agglutinin Precipitation, Heat Inactivation, and a Two-Site Immunoradiometric Assay.</a> Clinical Chemistry. 40 (9), 1749-1756 (1994).</li>
<li>O’Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experience%22%5BJournal%5D)">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> Journal of Visualized Experience. , (2011).</li>
<li>Nomoto, M., Ohsawa, M., Wang, H. L., Chen, C. C., Yeh, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+Characterization+of+Extracellular+Alkaline+Phosphatase+from+an+Alkalophilic+Bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Agricultural+and+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and Characterization of Extracellular Alkaline Phosphatase from an Alkalophilic Bacterium.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 52 (7), 1643-1647 (1988).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En nuestro análisis, hemos utilizado pNFF como el sustrato de la fosfatasa alcalina. Se trata de una solución de trabajo diseñada para ELISA y dilución no es necesario. Después de la hidrólisis por ALP, un producto amarillo se desarrolla y puede ser medido a 405 nm. Al final de la reacción enzimática, brevemente se centrifugó la placa bien 96 y transfirió el sobrenadante a un plato bien 96 fresco para medir absorbancia con el lector. Se encontró que este paso de centrifugado extra es crítica, puesto que aumenta la consis...

Fosfatasa alcalina (ALP) ubicuo se expresa en tanto de células procariotas y eucariotas1. Puede catalizar la hidrólisis de monofosfato de diferentes moléculas como nucleótidos, proteínas, alcaloides, ésteres de fosfato y anhídridos del ácido fosfórico. En los seres humanos, ALP eucariota está presente en muchos tejidos incluyendo el hígado, hueso, intestino y placenta2. Juega un papel importante en la fosforilación de proteínas, crecimiento de la célula, apoptosis, la célula de vástago procesos así como mineralización esquelética normal. ALP eucariota es también un indicador clave del suero para la presencia de enfermedades en huesos, hígado y otros tejidos/órganos cuando elevada3,4.
ALP procariota se ha detectado en una variedad de células bacterianas, incluyendo5de e. coli, S. aureus6,7 y algunas bacterias de rumen común en los suelos8. Actividad de fosfatasa alcalina bacteriana ha sido utilizado como un biosensor en la detección de pesticidas, metales pesados9 y10de contaminación bacteriana. La expresión constitutiva de ALP se ha utilizado para identificar estafilococos11 y diferenciar Serratia de Enterobacter12. Se sugirió que la producción constitutiva de ALP está correlacionado con patogenicidad en estafilococos13. Aunque ALP ha sido estudiado en diferentes configuraciones3,4, sin embargo, poco se divulga para su actividad y función en las culturas de los biofilms.
El biofilm se ha documentado para tener una diferente funcionamiento vida bacteriana en comparación con su contraparte de célula bacteriana libre-que viven14. En S. aureus, la formación de biofilm se ha identificado en una variedad de condiciones clínicas y representa la resistencia a los antibióticos y la inflamación crónica15,16. Muchas moléculas habían sido divulgadas en una matriz de la biopelícula como polisacáridos, proteínas, ácidos nucleicos y lípidos, pero el mecanismo de formación de biofilm no es completamente entendido14. Para entender el papel de ALP en la formación de biopelículas, cultivadas de biopelículas de S. aureus en placas de cultivo de tejidos bien 96 y mide la actividad de fosfatasa alcalina usando para-nitrophenylphosphate (pNFF).
La molécula pNFF está lista para usar sustrato para fosfatasa alcalina y ha sido ampliamente utilizado para medir la actividad ALP6,17,18. Este ensayo colorimétrico se basa en la conversión para-nitrofenil fosfato (pNFF) de para-nitrofenol resultando en un producto coloreado a 405 nm. En comparación con otros análisis de fosfatasa alcalina convencional, tales como gel de agarosa electroforesis19, precipitación de (WGA) de la aglutinina de germen de trigo, y WGA-HPLC20, este análisis es altamente específico, sensible, fácil de reproducir y más importante, permite la alta rendimiento de procesamiento.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>VWR</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Eppendorf</td><td>Thomas Scientific</td><td>5810</td><td></td></tr><tr><td>Gluosa</td><td>VWR</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Pellets de NaOH</td><td>VWR</td><td>SS0550-500GR</td><td></td></tr><tr><td>Para-nitrofenilfosfato (pNPP)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P7998-100ML</td><td>Las concentraciones típicas de sustratos líquidos de pNPP, a menudo utilizados en ensayos de inmunoadsorción enzimática (ELISA), oscilan entre 10 y 50 mM. Al igual que la mayoría de los sustratos líquidos de pNPP listos para usar, como el que se usa aquí, la concentración exacta de pNPP no se revela debido a su naturaleza patentada.</td></tr><tr><td>10x PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P3288-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Lector de placas</td><td>Biotek</td><td>ELx808</td><td></td></tr><tr><td>S. aureus</td><td>ATCC</td><td>ATCC25923</td><td></td></tr><tr><td>Agar de soja tríptico&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 15 g/L TSB</td><td>VWR</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de soja tríptico:&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; g/L Digestión pancreática de caseína............ 15.0 Compendio Papático de Harina de Soja......... 5.00 Cloruro de sodio.............................. 3.00 Dextrosa........................................ &nbsp; 2.50 Fosfato dipotásico.................. 2.50</td><td>VWR</td><td>90006-098</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos</td><td>BD</td><td>6902D09</td><td>Fondo en forma de U</td></tr></tbody></table>

colorimétrico análisis de alcalina fosfatasa actividad biofilm de s. aureus

Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm

Fosfatasa alcalina (ALP) es una enzima común expresada en las células procariotas y eucariotas. Cataliza la hidrólisis de Monoésteres de fosfato de muchas moléculas en pH básico y juega un papel indispensable en el metabolismo del fosfato. En los seres humanos, ALP eucariota es una de las señales enzimáticas más frecuente en el diagnóstico de varias enfermedades, tales como colestasis y raquitismo. En S. aureus, ALP se detecta exclusivamente en la membrana de la célula; también se expresa como forma secretora. Sin embargo, poco se sabe sobre su función en la formación de biopelículas.
El objetivo de este manuscrito es desarrollar un análisis rápido y fiable para medir la actividad ALP en biofilm de S. aureus que no requiere aislamiento de proteínas. Utilizando p-nitrofenil fosfato (pNFF) como sustrato, se evaluó la actividad ALP en biofilm de S. aureus en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Actividad se basa en la formación del producto de la reacción soluble midiendo absorbancia nm 405. La naturaleza de alto rendimiento del método de placa de 96 bien cultura de tejido proporciona un método sensible y reproducible para ensayos de actividad de la ALP. La misma experimental establecido puede ampliarse también para medir otros marcadores moleculares extracelulares relacionadas con la formación de biopelículas.

La figura 1 muestra un resultado representativo de la actividad de la ALP de culturas de biofilm de S. aureus en placas de cultivo de tejidos bien 96. 75 μL de solución de pNFF comercialmente disponibles se añadió a cada pozo y se incubó a temperatura ambiente. Después de la incubación para diferentes tiempos (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min y 75 min, respectivamente) 75 μL de NaOH M 5 fue agregado para detener la reacción. El producto entonces...

En este manuscrito, hemos establecido un método de alto rendimiento para cuantificar la actividad de la fosfatasa alcalina en la cultura de biofilm de S. aureus de placa de 96 pocillos cultivo de tejido

Colorimétrico análisis de alcalina fosfatasa actividad biofilm de S. aureus

Alkaline phosphatase (ALP) is a common enzyme expressed in both prokaryotic and eukaryotic cells. It catalyzes the hydrolysis of phosphate monoesters from ...

Este protocolo presentaba un método fácil y fiable para medir la actividad de fosfatasa alcalinizada en el cultivo de biopelícula S.aureus. Nos ayudará a entender la función de LA ALP en la formación de biopelículas. La principal ventaja de esta técnica es el alto rendimiento.Es muy sensible y fácil de realizar. Demostrando el procedimiento estará Kevin Danikowski, un ex estudiante del Harper College. Para preparar TSB, agregue el digerido pancreático de caseína, el digerido papaico de la harina de soja, el cloruro de sodio, la dextrosa y el fosfato de dipotassio en agua destilada.Cubra el matraz con papel de aluminio y colótelo en un autoclave para esterilizarlo antes de usarlo. Para preparar una TSA, agregue el agar a TSB y colótelo en el autoclave para su esterilización. Luego déjelo enfriar a temperatura ambiente.A continuación, vierta en el plato de Petri en una proporción de 20 mililitros por plato. Para preparar un medio de cultivo de biopelícula, añadir glucosa a TSB autoclavado para lograr la concentración de 10 gramos por litro. Con un kit de filtración al vacío, filtre la solución con un filtro de 0,2 micrómetros de tamaño de poro.Para inocular, utilice un bucle de inoculación esterilizado para recoger una colonia individual de Staph aureus de la placa Petri y colóquela en el tubo de cultivo lleno de 10 mililitros de TSB. Ponga el tubo en la incubadora para crecer durante la noche a 37 grados centígrados. Con una micropipeta, extraiga 100 microlitros de cultivo nocturno y transfiéralo a un tubo de cultivo lleno de 10 mililitros de TSB con glucosa para una dilución de la relación de volumen de 1:100.Vórtice suavemente para mezclar para una concentración constante. Utilice una micropipeta para transferir 200 microlitros de cultivo diluido a un total de 18 pozos de una placa de 96 pozos. Incubar la placa de 96 pozos a 37 grados Centígrados durante 24 horas para la formación de biopelículas.Para la mejor formación de biopelícula de S.aureus, es mejor elegir una placa plana o redonda inferior de 96 pozos. Después de eso, incline ligeramente la placa para decantar el sobrenadante por aspiración desde el borde de cada pozo. Lave cada pozo con 1X PBS.Ponga el plato en la centrífuga para girar durante cinco minutos a 8.000 revoluciones por minuto y decantar el sobrenadante por aspiración. Añadir 75 microlitros de sustrato ALP tamponado que consiste en PNPP disponible comercialmente a cada pozo y utilizar un temporizador para registrar cada punto de tiempo en triplicado. Después de cada punto de tiempo de incubación, agregue 75 microlitros de cinco molares de hidróxido de sodio a cada uno de los tres pozos para detener la reacción.Centrifugar la placa durante cinco minutos a 800 revoluciones por minuto. Utilice una pipeta para transferir 100 microlitros de sobrenadante a una nueva placa de 96 pozos para la medición calorimétrica. Utilice un lector de placas de 96 pozos para medir la absorbancia de cada pozo a 405 nanómetros.Utilice los pozos de punto de tiempo de 30 minutos para controlar el ruido de fondo. Repita todo el experimento en tres placas de 96 pozos. Este protocolo desarrolla un ensayo rápido y fiable para medir la actividad de ALP en biopelícula S.aureus que no requiere aislamiento proteico.El resultado representativo de la actividad de ALP muestra una tendencia creciente de hasta 75 minutos. Después de 75 minutos, no se observó ningún aumento de la actividad de ALP. Es muy importante establecer un buen cultivo de biopelícula y puede tomar bastantes ensayos para dominar.Puede confirmar la formación de biopelículas realizando ensayos de cristal violeta como ya informamos nosotros y otros o puede pretratar la placa con plasma humano para facilitar la formación de biopelículas. Después de su desarrollo, puede detectar posibles inhibidores de la ALP que podrían interferir en la formación de biopelículas. El resultado proporcionará información importante para el manejo de biopelículas en el campo médico.Cinco molares de hidróxido de sodio pueden ser peligrosos en caso de contacto. Asegúrese de usar equipo de protección personal al manipular.

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Fuente: Vidilaseris, K., et al. Detección de inhibidores de la pirofosfatasa unidos a la membrana de Thermotoga maritima . J. Vis. Exp. (2019)Este video muestra un ensayo colorimétrico para detectar inhibidores de la pirofosfatasa bacteriana unida a la membrana (mPPasa) mediante la cuantificación de la liberación de ortofosfato. El método permite la identificación de compuestos que inhiben la mPPasa de Thermotoga maritima, un posible objetivo farmacológico antimicrobiano.

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Cuantificación de la supresión de biopelículas inducida por enzimas en bacterias patógenas

Este video muestra un ensayo in vitro para estudiar la interacción entre neutrófilos y biopelícula. Las bacterias patógenas incrustadas en la biopelícula y los neutrófilos aislados se marcaron mediante marcadores fluorescentes, y la respuesta inmunitaria de los neutrófilos y la evasión de la respuesta inmunitaria de las bacterias se evaluaron mediante un microscopio de fluorescencia.

Un ensayo in vitro para estudiar la interacción entre los neutrófilos y el biofilm

A diferencia de la observada para eucariotas, hay una escasez de estudios que despolarización detalle de la membrana y la concentración de iones cambios en las bacterias, principalmente como su pequeño tamaño hace que los métodos convencionales de medición de difícil. En este sentido, los protocolos de detalle para el seguimiento de estos eventos en el Gram-positivas patógeno significativo Streptococcus pneumoniae utilizando técnicas de fluorescencia.

Vigilar los cambios en la polaridad de la membrana, membrana Integridad, e intracelular de iones concentraciones en<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Uso de tintes fluorescentes

Aquí, presentamos protocolos para cribar y caracterizar rápidamente la actividad antimicrobiana de las enzimas. El ensayo de difusión de microportaobjetos y el ensayo de liberación de colorante utilizan sustratos bacterianos objetivo para la evaluación cualitativa y cuantitativa de la actividad enzimática.

Los ensayos cualitativos y cuantitativos para la detección y caracterización de proteínas de antimicrobianos

La mayoría de las infecciones bacterianas producen una biopelícula. En virtud de su entorno, las bacterias asociadas a la biopelícula suelen ser fenotípicamente resistentes a los fármacos. Por lo tanto, las nuevas moléculas antibacterianas que matan las bacterias en las biopelículas son una alta prioridad. Establecemos un ensayo para detectar rápidamente compuestos antimicrobianos que sean eficaces para erradicar las biopelículas.

Orientación de Biofilm Asociadas<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Uso de Ensayo de susceptibilidad a fármacos Basado resazurina

Este manuscrito describe un protocolo para estudiar el efecto antimicrobiano de terapia fotodinámica mediada por el ácido de 5-aminolevulínico (ALA-PDT) en el biofilm de Staphylococcus aureus . Este protocolo puede utilizarse para desarrollar un modelo de vitro para estudiar el tratamiento de los biofilms bacterianos con TFD en el futuro.

Un modelo In Vitro para estudiar el efecto de la terapia fotodinámica mediada por el ácido aminolevulínico 5 de Biofilm de Staphylococcus aureus

El protocolo describe el cultivo de biopelículas entre reinos consistentes en Candida albicans y Streptococcus mutans y presenta un método basado en microscopía confocal para el monitoreo del pH extracelular dentro de estas biopelículas.

Monitoreo del pH extracelular en biopelículas entre reinos mediante microscopía confocal

Este artículo proporciona una metodología detallada para la medición de isolevuglandinas en tejidos por inmunofluorescencia utilizando el anticuerpo ScFv D11 conjugado con fosfatasa alcalina. Los modelos de hipertensión tanto en ratones como en humanos se utilizan para explicar los procedimientos paso a paso y los principios fundamentales asociados con la medición de isolevuglandina en muestras de tejido.

Detección directa de isolevuglandinas en tejidos utilizando una proteína de fusión de fosfatasa alcalina scFv D11 e inmunofluorescencia

El presente protocolo describe el estudio de las interacciones neutrófilos-biofilm. Las biopelículas de Staphylococcus aureus se establecen in vitro y se incuban con neutrófilos humanos derivados de sangre periférica. La respuesta de explosión oxidativa de los neutrófilos se cuantifica, y la localización de neutrófilos dentro de la biopelícula se determina mediante microscopía.

Ensayos in vitro estandarizados para visualizar y cuantificar las interacciones entre neutrófilos humanos y biopelículas de Staphylococcus aureus

Aprende a cuantificar la actividad de fosfatasa alcalina en biofilms de S. aureus mediante un ensayo colorimétrico de alto rendimiento en placas de 96 pocillos. Este método sensible facilita el estudio de la formación de biofilms bacterianos.

Colorimétrico análisis de alcalina fosfatasa actividad biofilm de S. aureus

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