Colorimétrico análisis de alcalina fosfatasa actividad biofilm de S. aureus
12 de abril de 2019
En este manuscrito, hemos establecido un método de alto rendimiento para cuantificar la actividad de la fosfatasa alcalina en la cultura de biofilm de S. aureus de placa de 96 pocillos cultivo de tejido
Este protocolo presentaba un método fácil y fiable para medir la actividad de fosfatasa alcalinizada en el cultivo de biopelícula S.aureus. Nos ayudará a entender la función de LA ALP en la formación de biopelículas. La principal ventaja de esta técnica es el alto rendimiento.
Es muy sensible y fácil de realizar. Demostrando el procedimiento estará Kevin Danikowski, un ex estudiante del Harper College. Para preparar TSB, agregue el digerido pancreático de caseína, el digerido papaico de la harina de soja, el cloruro de sodio, la dextrosa y el fosfato de dipotassio en agua destilada.
Cubra el matraz con papel de aluminio y colótelo en un autoclave para esterilizarlo antes de usarlo. Para preparar una TSA, agregue el agar a TSB y colótelo en el autoclave para su esterilización. Luego déjelo enfriar a temperatura ambiente.
A continuación, vierta en el plato de Petri en una proporción de 20 mililitros por plato. Para preparar un medio de cultivo de biopelícula, añadir glucosa a TSB autoclavado para lograr la concentración de 10 gramos por litro. Con un kit de filtración al vacío, filtre la solución con un filtro de 0,2 micrómetros de tamaño de poro.
Para inocular, utilice un bucle de inoculación esterilizado para recoger una colonia individual de Staph aureus de la placa Petri y colóquela en el tubo de cultivo lleno de 10 mililitros de TSB. Ponga el tubo en la incubadora para crecer durante la noche a 37 grados centígrados. Con una micropipeta, extraiga 100 microlitros de cultivo nocturno y transfiéralo a un tubo de cultivo lleno de 10 mililitros de TSB con glucosa para una dilución de la relación de volumen de 1:100.
Vórtice suavemente para mezclar para una concentración constante. Utilice una micropipeta para transferir 200 microlitros de cultivo diluido a un total de 18 pozos de una placa de 96 pozos. Incubar la placa de 96 pozos a 37 grados Centígrados durante 24 horas para la formación de biopelículas.
Para la mejor formación de biopelícula de S.aureus, es mejor elegir una placa plana o redonda inferior de 96 pozos. Después de eso, incline ligeramente la placa para decantar el sobrenadante por aspiración desde el borde de cada pozo. Lave cada pozo con 1X PBS.
Ponga el plato en la centrífuga para girar durante cinco minutos a 8.000 revoluciones por minuto y decantar el sobrenadante por aspiración. Añadir 75 microlitros de sustrato ALP tamponado que consiste en PNPP disponible comercialmente a cada pozo y utilizar un temporizador para registrar cada punto de tiempo en triplicado. Después de cada punto de tiempo de incubación, agregue 75 microlitros de cinco molares de hidróxido de sodio a cada uno de los tres pozos para detener la reacción.
Centrifugar la placa durante cinco minutos a 800 revoluciones por minuto. Utilice una pipeta para transferir 100 microlitros de sobrenadante a una nueva placa de 96 pozos para la medición calorimétrica. Utilice un lector de placas de 96 pozos para medir la absorbancia de cada pozo a 405 nanómetros.
Utilice los pozos de punto de tiempo de 30 minutos para controlar el ruido de fondo. Repita todo el experimento en tres placas de 96 pozos. Este protocolo desarrolla un ensayo rápido y fiable para medir la actividad de ALP en biopelícula S.aureus que no requiere aislamiento proteico.
El resultado representativo de la actividad de ALP muestra una tendencia creciente de hasta 75 minutos. Después de 75 minutos, no se observó ningún aumento de la actividad de ALP. Es muy importante establecer un buen cultivo de biopelícula y puede tomar bastantes ensayos para dominar.
Puede confirmar la formación de biopelículas realizando ensayos de cristal violeta como ya informamos nosotros y otros o puede pretratar la placa con plasma humano para facilitar la formación de biopelículas. Después de su desarrollo, puede detectar posibles inhibidores de la ALP que podrían interferir en la formación de biopelículas. El resultado proporcionará información importante para el manejo de biopelículas en el campo médico.
Cinco molares de hidróxido de sodio pueden ser peligrosos en caso de contacto. Asegúrese de usar equipo de protección personal al manipular.
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Descripción general
Este manuscrito presenta un método de alto rendimiento para cuantificar la actividad de la fosfatasa alcalina en cultivos de biopelículas de S. aureus utilizando una placa de cultivo celular de 96 pocillos. El método está diseñado para ser sensible y fácil de realizar, facilitando la investigación sobre el papel de la fosfatasa alcalina en la formación de biopelículas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Investigación de biopelículas
- Enzimología
Antecedentes
- La fosfatasa alcalina (ALP) es una enzima implicada en diversos procesos biológicos.
- Comprender el papel de la ALP en la formación de biopelículas es fundamental para los estudios microbiológicos.
- Los métodos de alto rendimiento son esenciales para la recolección eficiente de datos en la investigación.
- Las biopelículas son comunidades complejas de microorganismos que pueden afectar la salud y la industria.
Objetivo del estudio
- Establecer un método confiable para medir la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) en biopelículas.
- Mejorar la comprensión de la función de la ALP en la formación de biopelículas.
- Proporcionar un protocolo que pueda ser fácilmente adoptado por investigadores.
Métodos Utilizados
- Preparación de TSB utilizando digestión pancreática de caseína, digestión papáica de harina de soja, cloruro de sodio, dextrosa y fosfato dipotásico.
- Uso de una placa de cultivo celular de 96 pocillos para análisis de alto rendimiento.
- Medición de la actividad de fosfatasa alcalina en cultivos de biopelícula de S. aureus.
- Presentación del procedimiento por Kevin Danikowski, un exalumno del Harper College.
Resultados principales
- El método cuantifica con éxito la actividad de la fosfatasa alcalina en cultivos de biopelículas.
- La alta sensibilidad de la técnica permite mediciones precisas.
- El protocolo es sencillo y puede implementarse fácilmente en diversos laboratorios.
- Los conocimientos obtenidos en este estudio pueden orientar investigaciones futuras sobre biopelículas.
Conclusiones
- El método establecido es efectivo para estudiar la ALP en biopelículas.
- Esta investigación contribuye a la comprensión de la dinámica de las biopelículas.
- Estudios futuros pueden basarse en este protocolo para explorar otros aspectos de la biología de las biopelículas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite una cuantificación rápida y de alto rendimiento de la actividad de la fosfatasa alcalina en biopelículas de S. aureus sin aislamiento proteico, lo que apoya la validación temprana de dianas en el descubrimiento de agentes antimicrobianos. Al proporcionar una lectura sensible y reproducible de la actividad enzimática extracelular, facilita la eliminación de riesgos mecanicistas en hipótesis terapéuticas relacionadas con biopelículas. La compatibilidad del ensayo con formatos de placas de 96 pocillos permite su integración fluida en cascadas de cribado para la identificación de compuestos activos y la generación de confianza predictiva.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Examina la hipótesis terapéutica de que la fosfatasa alcalina contribuye a la formación y persistencia del biofilm.
- Valor operativo: Permite la validación funcional del blanco mediante la medición cuantitativa de la actividad enzimática en sistemas de biofilm intactos.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al vincular la modulación de la fosfatasa alcalina con fenotipos de inhibición del biofilm.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: Prepara un formato estandarizado y de alto rendimiento para evaluar los efectos de compuestos sobre marcadores enzimáticos extracelulares.
- Resultado cuantitativo: Genera mediciones basadas en absorbancia a 405 nm que permiten el análisis de respuesta frente a dosis y la confirmación de resultados positivos.
- Escalabilidad: Utiliza un formato de placa de 96 pocillos para facilitar el cribado de tamaño medio de bibliotecas de inhibidores.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Relaciona la actividad de la ALP con el biofilm de S. aureus, un factor de virulencia clave en infecciones crónicas y relacionadas con dispositivos.
- Continuidad traslacional: Proporciona una lectura alineada con biomarcadores que conecta el descubrimiento con las pruebas preclínicas de eficacia.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Aporta información para criterios de avance o interrupción basados en la interacción con el objetivo y el impacto fenotípico en modelos de biofilm.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El ensayo se integra en la fase temprana del descubrimiento, permitiendo la validación del blanco para orientar la identificación de compuestos activos y la evaluación preclínica de estrategias anti-biofilm.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la medición de la ALP como un resultado funcional del metabolismo del biofilm.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas y reproducibles adecuadas para la selección de bibliotecas de compuestos en placas de microtitulación.
- Análisis: Ofrece mediciones cinéticas y en el punto final que permiten la comparación estadística entre condiciones tratadas y controles.
- Investigación Traducida: Se alinea con el desarrollo de biomarcadores al vincular la actividad enzimática con la formación de biofilms y posibles intervenciones terapéuticas.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para el estudio de enzimas extracelulares en biofilms microbianos en múltiples proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación del blanco al reducir la ambigüedad mecanicista sobre el papel de la ALP en el biofilm.
- Valor operativo: Proporciona estandarización, sensibilidad y reproducibilidad mediante una lectura colorimétrica sencilla.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la selección rápida de moduladores de la ALP con vínculos fenotípicos claros al biofilm.
- Impacto en la cartera: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo al conectar la modulación del blanco con la eficacia anti-biofilm.
Consideraciones de Implementación
- Requiere conocimientos básicos de microbiología para el cultivo estéril de biopelículas y el manejo de S. aureus.
- Depende del acceso a un lector de placas de 96 pocillos capaz de medir absorbancia a 405 nm.
- Necesita la estandarización de las condiciones de formación de biopelículas entre pocillos y placas para comparaciones confiables.
- Implica consideraciones de optimización al extenderse a otras especies bacterianas o marcadores extracelulares.
- Incluye limitaciones prácticas, como la necesidad de controlar la absorbancia de fondo y asegurar la correcta interrupción de la reacción con NaOH.
