Name: Lipídico rápido gota protocolo de aislamiento utilizando un Kit de aislamiento de organelas bien establecidas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Aprende un protocolo rápido para aislar gotas lipídicas de hígado de ratón mediante la modificación de un kit comercial de retículo endoplásmico. Este método permite la purificación simultánea de múltiples organelos para estudios de biología celular.

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Agradecemos a la familia de Abramson Cancer Research Institute. Este trabajo es apoyado por las subvenciones siguientes: NIAAA/NIH R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, la Fundación Robert Wood Johnson, Harold Amos Facultad desarrollo Premio médicos, 7158, IDOM RDC piloto Premio P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (J.C.). Este trabajo fue financiado en parte por el NIH P30-DK050306 y sus instalaciones de la base (Patología Molecular y Imaging Core, Biología Molecular del Gene expresión núcleo y base de la cultura de célula) y su piloto programa de subvenciones. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.

Todos los experimentos se realizaron en un banco de laboratorio con equipo de protección personal apropiado para el nivel de bioseguridad 1, incluyendo una bata, guantes y gafas de seguridad. Los experimentos fueron realizados según los protocolos aprobados por la institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Pennsylvania. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el malestar del animal y los animales fueron tratados con atención humana.
1. aislamiento LD utilizando el kit de aislamiento ER
<ol><li>
Preparación Nota: Las cantidades mencionadas son convenientes para un hígado de ratón solo 1 g.<ol>
<li>Preparar 10 mL de tampón de extracción isotónica x 1 (tampón de la IE, del kit del aislamiento del ER) diluyendo 2 mL de tampón de IE x 5 con 8 mL de agua ultrapura. Enfriar el búfer al colocarlo sobre hielo.</li>
		<li>Diluir 10 mL de PBS de x 10 en 90 mL de agua ultrapura para preparar 100 mL de 1 x de tampón fosfato salino (PBS). Enfriar colocando en el hielo.</li>
		<li>Para preparar 10 mL de 5% polietilenglicol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-fenil éter (PGPE) diluyendo 500 μl de PGPE en 9,5 mL de agua ultrapura. Utilice una jeringa de 1 mL para medir PGPE como es viscoso. Enfriar colocando en el hielo.</li>
		<li>Enfriar todos los tubos, colocándolos en hielo: tubos de microcentrífuga de 1,7 mL, tubos de centrífuga de 15 mL, tubos de centrífuga de alta velocidad de 50 mL y 13 mL tubos de ultracentrífuga.</li>
		<li>Enfriar los centrifugadoras a 4 ° C: una microcentrífuga, una centrífuga de alta capacidad para 15 mL tubos, una centrifugadora de alta velocidad para tubos de 50 mL y una ultracentrífuga.</li>
		<li>Esterilice en autoclave los tijeras de disección y pinzas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de tejido
	<ol>
<li>Eutanasia el ratón colocando en una cámara llenada de 100% CO2 durante 10 minutos eutanasia confirmar mediante la realización de la dislocación cervical.</li>
		<li>Utilizando pinzas estériles y tijeras de disección, cortadas las capas de piel y músculo del abdomen en el eje posterior, anterior al exponer el hígado.</li>
		<li>Cortar los ligamentos que conectan el hígado en el diafragma y el intestino. Utilice pinzas para sacar el intestino a hígado, hacia la parte posterior, para exponer los ligamentos.</li>
		<li>Corte entre el hígado y la parrilla costal dorsal, pasando de anterior a posterior, hasta que el hígado se libera.</li>
		<li>Transferir el hígado a un frío 5 cm plato de Petri con 10 mL de PBS 1 x fría.</li>
		<li>Lave el hígado 2 x en una plataforma oscilante en 10 mL de PBS 1 x fría durante 5 minutos a 4 ° C en la placa de Petri de 5 cm. Retirar 1 x PBS después del último lavado.</li>
		<li>Utilizar una cuchilla quirúrgica estéril de tamaño 10 (vea la Tabla de materiales) para cortar el hígado en trozos de 3-5 mm en la placa de Petri (figura 1A) de 5 cm.</li>
		<li>Lave el hígado en cubos de 2 x con 10 mL de PBS 1 x fría durante 5 minutos a 4 ° C en la placa de Petri de 5 cm. Nota: Para el aislamiento del lisosoma, transfiera 0,5 g de hígado a un homogeneizador limpio 45 mL y seguir las indicaciones suministradas por la extracción de lisosoma kit (véase la Tabla de materiales).</li>
		<li>1 x PBS se decanta y transferir los trozos de hígado picados a la fría 45 mL homogeneizadores Dounce. Asegúrese de que todas las piezas van a la parte inferior de la homogeneizadora.</li>
		<li>Agregar 7 mL de tampón de IE 1 x frío (desde el kit de aislamiento ER) y homogeneizar el hielo, moviendo la mano arriba y abajo de 20 x. Asegúrese de que la mano va a la parte inferior de la homogeneizadora durante cada carrera.</li>
		<li>Transferir el homogeneizado (figura 1B) a un tubo de centrífuga de 15 mL frío.</li>
		<li>Enjuagar el homogeneizador con 1 mL de frío 1 x buffer de IE (desde el kit de aislamiento ER) y añadir al resto el homogeneizado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aislamiento de LD
	<ol>
<li>Quitar los núcleos centrifugar el homogeneizado en una centrífuga de alta capacidad a 1.000 x g durante 10 min a 4 ° C (figura 1).</li>
		<li>Transferir el sobrenadante postnuclear (PNS) a un tubo de centrífuga de 50 mL nuevo, frío. Para evitar la pérdida de LD, asegúrese de que cualquier lípido se reunieron en la parte superior del tubo de 15 mL se resuspendió antes de transferir el PNS.</li>
		<li>Tomar alícuota de PNS para análisis de pureza 100 μl y colocar en un tubo de microcentrífuga de frío 1,7 mL. Situado a un lado en el hielo.</li>
		<li>Para Retire la mitocondrias, Centrifugue la muestra PNS, no la parte alícuota, en una centrífuga refrigerada de alta velocidad a 12.000 x g durante 15 min a 4 ° C.<ol>
<li>Opcional: para aislamientos de LD (EPC) crudo (con la contaminación por citosol y membrana celular), recoger la capa de lípidos superior con una pipeta de vidrio y transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL. Continuar a la sección 1.4.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Transferir el sobrenadante postmitochondrial (PMS) a un tubo de ultracentrífuga. Para evitar la pérdida de LD, asegúrese de que cualquier lípido se reunieron en la parte superior se resuspendió antes de transferir el PMS.</li>
		<li>Tomar alícuota de PMS para el análisis de pureza 100 μl y colocar en un tubo de microcentrífuga de frío 1,7 mL. Situado a un lado en el hielo.</li>
		<li>Llene un tubo de ultracentrífuga hasta el borde con frío 1 x buffer de IE para evitar que el tubo que se derrumban durante la ultracentrifugación.</li>
		<li>El balance de las muestras y centrifugar en una ultracentrífuga a 100.000 x g durante 60 min a 4 ° C (figura 1).</li>
		<li>Para quitar la capa de LD, incline el tubo a un ángulo de 45° y utilice una pipeta de vidrio para aspirar. Transfiera el sedimento en un tubo de microcentrífuga de frío 1,7 mL. Nota: La pastilla contiene ER aislado. Utilice esta fracción aguas abajo para el aislamiento de ER.</li>
		<li>Recoger 100 μl del sobrenadante post-ER (por) debajo de la capa de lípidos para el análisis de pureza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lavado de LD
	<ol>
<li>Añadir 1 x PBS a la fracción de LD recopilada en un tubo de microcentrífuga 1.7, para un volumen total de 1,3 mL.</li>
		<li>Vórtice de la muestra.</li>
		<li>Centrifugar en una microcentrífuga a la máxima velocidad durante 5 minutos a 4 ° C para que sedimenten los residuos celulares. Caliente el tubo suavemente con las manos para ayudar a suspender de nuevo la capa de LD. Transferir el sobrenadante, incluyendo la capa de lípidos, a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,7 mL.</li>
		<li>Repita los pasos 1.4.1–1.4.3 2 x x-3, hasta que la pastilla ya no es visible.</li>
		<li>Añadir 1 x PBS a la LD pellet-libre sobrenadante hasta un volumen final de 1.5 mL. La fracción lipídica de la colada por centrifugación en una microcentrífuga a la máxima velocidad durante 5 minutos a 4 ° C.</li>
		<li>Retirar 1 mL de 1 x PBS (por debajo de la capa de lípidos) con una pipeta de vidrio sin alterar la capa de lípidos.</li>
		<li>Repita los pasos 1.4.5 y 1.4.6 4 x x-5, hasta que el PBS 1 x es visualmente transparente con ninguna turbidez.</li>
		<li>Quitar todos los PBS 1 x por debajo de la capa de lípidos, con una pipeta de vidrio (Figura 1E).</li>
		<li>Utilizar el resultado, una fracción pura de LD, para posteriores análisis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cuantificación de la proteína de LD por análisis ácido bicinchoninic Nota: No use un ensayo ácido bicinchoninic (BCA) si morfología LD debe evaluarse.<ol>
<li>Resuspender el LD en 500 μL de PGPE 5%.</li>
		<li>Hervir las muestras por 5 min a 95 ° C, vortex e incubar las muestras a temperatura ambiente durante 5 minutos enfriar.</li>
		<li>Repita el paso 1.5.2 un adicional 2 x.</li>
		<li>Someter a ultrasonidos las muestras durante 5 minutos con una 30 s/ciclo, a intensidad media.</li>
		<li>Normalizar las muestras mediante la medición de la concentración de proteína en todas las muestras de análisis de pureza y en la fracción de LD por ensayo BCA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. aislamiento LD mediante gradiente de densidad de sacarosa
<ol><li>
Preparación
	<ol>
<li>Hacer 200 mL de buffer TE (10 mM Tris-HCl [pH 7.4], 1 mM EDTA [pH 8.0]). Enfriar colocando en el hielo.</li>
		<li>Hacer 100 mL de solución de sacarosa de 60% (p/v) en tampón TE disolviendo 60 g de sacarosa en solución tampón TE, llevando el volumen final a 100 mL. Enfriar colocando en el hielo.</li>
		<li>Hacer 6 mL de solución de sacarosa al 40% (w/v) añadiendo 4 mL de sacarosa al 60% a 2 mL de tampón TE. Enfriar colocando en el hielo.</li>
		<li>Hacer 6 mL de solución al 25% (p/v) de sacarosa añadiendo 2.5 mL de sacarosa al 60% a 3,5 mL de tampón TE. Enfriar colocando en el hielo.</li>
		<li>Hacer 4 mL de solución 10% (p/v) de sacarosa añadiendo 0,7 mL de sacarosa al 60% a 3,3 mL de tampón TE. Enfriar colocando en el hielo.</li>
		<li>Tomar 10 mL de solución de inhibidor de la proteasa y fosfatasa mediante la adición de una tableta de inhibidores de la proteasa y fosfatasa a 10 mL de tampón TE.</li>
		<li>Preparar el tampón de homogeneizado de tejido añadiendo 4 mL de solución de inhibidor de la proteasa y fosfatasa a 50 mL de solución stock de 60% de sacarosa. Enfriar colocando en el hielo.</li>
		<li>Preparar el tampón de recubrimiento añadiendo 2 mL de solución de inhibidor de la proteasa y fosfatasa a 50 mL de tampón TE. Enfriar colocando en el hielo.</li>
		<li>Diluir 10 mL de PBS de x 10 en 90 mL de agua ultrapura para preparar 100 mL de 1 x PBS. Enfriar colocando en el hielo.</li>
		<li>Preparar 10 mL de 5% PGPE por dilución a 500 μl de PGPE en 9,5 mL de agua ultrapura. Utilice una jeringa de 1 mL para medir PGPE como es viscoso. Enfriar colocando en el hielo.</li>
		<li>Enfriar los tubos de centrífuga siguientes colocándolos en hielo: tubos de microcentrífuga de 1,7 mL, tubos de centrífuga de 15 mL, tubos de centrífuga de alta velocidad de 50 mL y 13 mL tubos de ultracentrífuga.</li>
		<li>Enfriar las centrifugadoras requiere a 4 ° C: una microcentrífuga, una centrífuga de alta capacidad (para tubos de 15 mL), una centrifugadora de alta velocidad (para tubos de 50 mL) y una ultracentrífuga.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de tejido
	<ol>
<li>Utilizar pasos 1.2.1–1.2.9 para preparar el tejido para homogeneización.</li>
		<li>Agregar 7 mL de tampón de homogeneizado de tejido frío y homogeneizar el hielo moviendo la mano arriba y abajo de 20 x. Durante los cinco primeros trazos, asegúrese de que la mano va a la parte inferior de la homogeneizadora.</li>
		<li>Transferir el homogenizado a un tubo de centrífuga de 15 mL frío.</li>
		<li>Enjuagar el homogeneizador con 1 mL de tampón de homogeneizado de tejido frío y transferir al tubo de centrífuga 15 mL previamente usados.</li>
		<li>Llevar el volumen del homogeneizado hasta 10 mL con buffer de homogeneizado de tejido.</li>
		<li>Centrifugue la muestra en una centrífuga de alta capacidad a 1.000 x g durante 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Transferencia 8 mL del sobrenadante a un tubo de centrífuga de 50 mL.</li>
		<li>Transfiera 100 μl del sobrenadante restante como muestra PNS para análisis de pureza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gradiente de sacarosa
	<ol>
<li>El tubo de centrífuga de 50 mL que contenga 8 mL de PNS en un ángulo de 45° de inclinación. Añadir cuidadosamente 6 mL de solución de sacarosa al 40%, asegurando que las dos fases alojarte separadas.</li>
		<li>De manera similar, lentamente agregar 6 mL de solución de sacarosa al 25%; a continuación, añadir 4 mL de solución de sacarosa al 10%; por último, añada 8 mL de tampón de recubrimiento.</li>
		<li>Centrifugue la muestra en una centrífuga de alta velocidad a 30.000 x g a 4 ° C durante 30 minutos.</li>
		<li>Transferir la capa superior conteniendo el Sud a un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL.</li>
		<li>Para el lavado de LD, siga los pasos en la sección 1.4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Lipid+Droplets+from+Cells+by+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation.</a> Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+lipid+droplets+from+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolating lipid droplets from multiple species.</a> Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).</li>
<li>Gao, Q., Goodman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+droplet-a+well-connected+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The lipid droplet-a well-connected organelle.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49(2015).</li>
<li>Correnti, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+and+C2+ceramide+activate+fatty+acid+oxidation+in+human+hepatoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12923(2018).</li>
<li>Williams, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+ceramide+synthase+6+in+mouse+and+human+alcoholic+steatosis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis.</a> FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).</li>
<li>Carr, R. M., Ahima, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+lipid+droplet+proteins+in+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases.</a> Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).</li>
<li>Carr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perilipin+Staining+Distinguishes+Between+Steatosis+and+Nonalcoholic%5BTitle%5D)+AND+%22Steatohepatitis+in+Adults+and+Children.+Clinical+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic.</a> Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).</li>
<li>Carr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+TIP47+improves+hepatic+steatosis+and+glucose+homeostasis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).</li>
<li>Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+perilipin+2+prevents+hepatic+steatosis%2C+glucose+intolerance+and+ceramide+accumulation+in+alcohol-fed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice.</a> PLoS One. 9 (5), e97118(2014).</li>
<li>Tsai, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+constitutive+lipid+droplet+protein+PLIN2+regulates+autophagy+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver.</a> Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).</li>
<li>Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).</li>
<li>Liu, K., Czaja, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lipid+stores+and+metabolism+by+lipophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy.</a> Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).</li>
<li>Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cellular+lipid+droplets%3A+two+purification+techniques+starting+from+yeast+cells+and+human+placentas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e509814(2014).</li>
<li>Sato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+lipid+droplet+proteins+in+hepatoma+cell+lines+expressing+hepatitis+C+virus+core+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein.</a> Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).</li>
<li>Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R. 3rd, McManaman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+reveal+a+link+between+the+endoplasmic+reticulum+and+lipid+secretory+mechanisms+in+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells.</a> Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologically+and+Functionally+Distinct+Lipid+Droplet+Subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations.</a> Scientific Reports. 6, 29539(2016).</li>
</ol>

El Dr. Carr recibe apoyo a la investigación de productos farmacéuticos interceptar.

Biología de LD hepático es cada vez más reconocida como un regulador crítico de la fisiología hepatocelular en salud y enfermedad. Como organelos de buena fe, LDs son dinámicos, interactuar con otras estructuras celulares y contienen dentro de los componentes bio-activos involucrados en la homeostasis de lípidos y glucosa. El gradiente de la sucrosa se utiliza habitualmente para el aislamiento de LD y permite a los investigadores a estudiar la estructura de LD, pero requiere hacer numerosas reservas. Hemos demostrado que...

LDs son bioactivos organelos encontrados el citosol de las células eucariotas más y algunas células procariotas1,2,3. El núcleo de la LD está compuesto por lípidos neutros como los triglicéridos (TG) y ésteres de colesterol. También contienen ceramidas, lípidos bioactivos en de4,de vías de señalización celular5. LDs están rodeados por una monocapa de fosfolípidos y recubiertas de proteínas, incluyendo la perilipin proteínas perilipin 2 (PLIN2) y 3 (PLIN3)1,5,6. También están presentes las enzimas lipogénicos, lipasas y proteínas de la membrana la trata de personas que han sido vinculadas a varias enfermedades steatotic hepáticas, incluyendo enfermedad del hígado graso no alcohólico, enfermedad hepática alcohólica y la hepatitis C3,5 ,6,7,8,9,10.
LDs se cree que la forma de la membrana externa de la ER y contienen TG recién sintetizada de ácidos grasos libres derivados de ER11. Sin embargo, sigue siendo desconocido si los lípidos combinados bud, permanecer conectados, o son suprimidos de la ER6,11, haciendo el aislamiento de LDs de ER técnicamente difícil. Ácidos grasos libres pueden ser liberados del Sud por la acción de las lipasas superficie para proporcionar para la producción de energía o la síntesis de la membrana. Además, LDs pueden ser degradados a través de lipophagy como un mecanismo regulador y para producir ácidos grasos libres12.
Además del ER y lisosomas, hay otros organelos, como mitocondrias, peroxisomas, endosomas y la membrana plasmática, que se encuentran en estrecha asociación de LDs11. Esta poligamia apretada dificulta realizar una extracción pura de LD. Sin embargo, innata de baja densidad lípidos neutros puede ser aprovechada mediante centrifugación5.
Tradicionalmente, LDs han aislado con una sacarosa densidad gradiente1,5,13. Sin embargo, estos métodos no han sido diseñados para aislar otros organelos. Además, necesitan el tiempo preparación de los reactivos. Este protocolo adapta un aislamiento comercial de ER kit (véase la Tabla de materiales) para permitir el aislamiento de LD. Usamos el tampón de extracción proporcionado por el kit, agregar un paso de aislamiento de LD. Además, el protocolo también puede utilizarse para ER y aislamiento lisosomal utilizando las mismas muestras, lo que permite una imagen más completa del ciclo de vida de LDs. Para validar este nuevo método, ensayo de rendimiento de LD, morfología, tamaño y pureza. Se comparan los resultados presentados aquí a los obtenidos con un protocolo ampliamente utilizado utilizando un gradiente de sacarosa para el aislamiento de LD.
Utilizamos un 10 a 12-semanas de edad, 20 g hembra C57BL/6 ratón ayunó durante 16 h (eliminación de alimentos en 17:00 para un tiempo de aislamiento de LD de 9:00) con acceso libre al agua. El rendimiento típico de TG es 0.6 mg/g hígado y para la proteína del LD, es hígado de 0,25 mg/g. Esto proporciona suficiente material para ~ 10 immunoblots por SDS PAGE. El protocolo a continuación de los datos de los reactivos usados y un protocolo adecuado para un hígado solo 1 g. El protocolo de aislamiento gradiente de sacarosa es adaptado de Sato14 y15de Wu.

<table><tbody><tr><td>Mezclador de vórtice BioExpress</td><td>GeneMate</td><td>S-3200-1</td><td>Centrífuga mezcladora de vórtice</td></tr><tr><td>54242 R</td><td>Eppendorf</td><td>54242 R</td><td>Contracentrífuga refrigerada Rotor: Centrífuga FA-45-24-11</td></tr><tr><td>Sorvall RC6 +</td><td>Thermo Scientific</td><td>RC6+</td><td>Centrífuga refrigerada de alta velocidad Rotor: Centrífuga F21S-8x50y</td></tr><tr><td>Sorvall Legend RT+</td><td>Thermo Scientific</td><td>Legend RT+</td><td>Centrífuga refrigerada de alta capacidad Rotor: 75006445 Cubeta: 75006441</td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasa COmplete</td><td>Sigma Aldrich</td><td>04 693 116 001</td><td>Tabletas de inhibidores de proteasa</td></tr><tr><td>Diagenode Bioruptur UCD-200</td> Sistema de <td>sonicación</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200</td></tr><tr><td>Molinillo de pañuelos Dounce (45 mL)</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td>Use Mortero suelto</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (1x)</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>Kit de aislamiento de retículo endoplásmico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ER0100</td><td>Para kit de ER Extracción: Contiene: Tampón de extracción isotónica 5X 100 mL Tampón de extracción hipotónica 10 mL Cloruro de calcio, solución de 2,5 M 5 mL Medio de gradiente de densidad OptiPrep 100 mL Aguja de punta roma 1 ea.</td></tr><tr><td>Fuente de luz externa para excitación fluorescente</td><td>Leica</td><td>Leica EL6000</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1758</td><td>Ácido clorhídrico</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Software de análisis</td></tr><tr><td>de imágenes Microscopio de contraste modulante invertido</td><td>Leica</td><td>Leica DM IRB</td><td></td></tr><tr><td>Kit de enriquecimiento de lisosoma para tejidos y células cultivadas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89839</td> para cámara microscópica de <td>aislamiento de lisosoma</td></tr><tr><td></td><td>Qimaging</td><td>QICAM fast 1394</td><td></td></tr><tr><td>Optima XL-100K Ultracentrífuga</td><td>Beckman-Coulter</td><td>XL-100K</td><td>Ultracentrífuga Rotor: SW41Ti</td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-042817</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri 5 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas Pierce BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>04 906 845 001</td><td>Tabletas inhibidoras de fosfatasa</td></tr><tr><td>Cuchilla quirúrgica estéril #10</td><td>Pioneer</td><td>S2646</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td>Cristalino/Certificado ACS</td></tr><tr><td>Triglicéridos Kit Liquicolor</td><td>Stanbio&nbsp;</td><td>2200-225</td><td>Kit de triglicéridos colorimétricos</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Para tampón TE</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151-100</td><td>5%, Polietilenglicol p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-éter fenil, Reactivo de lisis de proteínas</td></tr><tr><td>EDTA ultrapuro (0,5 M, pH 8,0)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-038</td><td>Para tampón TE</td></tr></tbody></table>

lipídico rápido gota protocolo de aislamiento utilizando un kit de aislamiento de organelas bien establecidas

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Gotitas del lípido (LDs) son bioactivos organelos encontrados el citosol de la mayoría eukaryotic y algunas células procariotas. LDs están compuestos de lípidos neutros encajonados por una monocapa de fosfolípidos y proteínas. Lípidos de LD hepáticos, tales como ceramidas y proteínas están implicados en varias enfermedades que causan esteatosis hepática. Aunque los métodos anteriores se han establecido para el aislamiento de LD, requieren una tiempo preparación de reactivos y no están diseñados para el aislamiento de varios compartimentos subcelulares. Se intentó establecer un nuevo protocolo para permitir el aislamiento de LDs, retículo endoplásmico (ER) y lisosomas de hígado de ratón.
Además, todos los reactivos utilizados en el protocolo que presentamos están disponibles en el mercado y requieren de una preparación reactivo mínimo sin sacrificar la pureza del LD. Aquí presentamos datos que comparan este nuevo protocolo un protocolo gradiente de sacarosa estándar, demostrando producción, morfología y pureza comparable. Además, podemos aislar ER y lisosomas utilizando la misma muestra, proporcionando visión detallada de la formación y el flujo intracelular de lípidos y sus proteínas asociadas.

Hemos realizado el aislamiento de LD con el kit de ER en aproximadamente 30 ratones y compararon los resultados con aquellos que siguen el protocolo de aislamiento de sacarosa en aproximadamente 40 ratones. Los resultados reportados son típicos para ambos protocolos. Ratones se mantuvieron en ayuno durante la noche con acceso libre al agua, para aumentar el rendimiento de LD. Aislamiento de LD utilizando un gradiente de sacarosa se ejecute en paralelo con el kit de ER protocolo de aislami...

Este Protocolo establece un método novedoso de aislamiento de gotas de lípido y purificación de hígado de ratón, usando un kit de aislamiento de retículo endoplásmico bien establecida.

Lipídico rápido gota protocolo de aislamiento utilizando un Kit de aislamiento de organelas bien establecidas

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

La investigación sobre la biología de las gotas lipídicas se ha visto obstaculizada por la dificultad de purificación. Además, el estudio del flujo de lípidos celulares requiere la purificación simultánea de múltiples orgánulos, y actualmente no había protocolos simples disponibles. La principal ventaja de esta técnica es hacer más accesible la purificación de gotas lipídicas.Modificamos un kit disponible comercialmente para aislar simultáneamente gotas de lípidos, retículo endoplasmático y lisosomas de una sola muestra. La acumulación de gotas de lípidos hepáticos predispone a los pacientes obesos y alcohólicos a la enfermedad hepática progresiva. Esto ha cambiado la visión de las gotas de lípidos de los compartimentos de almacenamiento inertes a los orgánulos dinámicos de importancia biológica.Para empezar, utilice fórceps estériles y tijeras de disección para cortar la piel y las capas musculares del abdomen del ratón eutanizado en el eje posterior-anterior, exponiendo el hígado. Corte los ligamentos que conectan el hígado con el intestino. Usando fórceps, aleja el intestino del hígado, hacia la parte posterior.Corte el ligamento que conecta el hígado con el diafragma. Luego, corte entre el hígado y la caja torácica dorsal, moviéndose de anterior a posterior, hasta que el hígado se libera. Transfiera el hígado a un plato de Petri frío de cinco centímetros con 10 mililitros de PBS frío 1x, y lave el hígado dos veces en una plataforma mecedora en 10 mililitros de frío 1x PBS durante cinco minutos a cuatro grados celsius.Después del lavado final, verter el 1x PBS, y utilizar una hoja quirúrgica estéril de tamaño 10 para cortar el hígado en trozos de tres a cinco milímetros dentro del plato. Luego, lave el hígado cortado en cubos dos veces con 10 mililitros de PBS frío 1x durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Decantar el 1x PBS, y transferir las piezas hepáticas cortadas en cubos a un homogeneizador de Dounce frío de 45 mililitros, asegurando que todas las piezas estén en la parte inferior.Agregue siete mililitros de tampón frío de 1x IE. Homogeneizar sobre hielo moviendo la plaga hacia arriba y hacia abajo 20 veces, asegurándose de que la plaga va al fondo del homogeneizador durante cada golpe. Transfiera el homogenenato a un tubo centrífugo frío de 15 mililitros.Enjuagar el homogeneizador con un mililitro de tampón frío 1x IE, y añadirlo al resto del homogeneato. Para eliminar los núcleos, centrifugar el homogeneizar en una centrífuga de alta capacidad a 1.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Asegúrese de que cualquier lípido recogido en la parte superior del tubo de 15 mililitros se resuspended para evitar la pérdida de LD.Asegurándose de que el pellet nuclear en la parte inferior del tubo no esté perturbado, transfiera el sobrenadante postnuestrador postnuclear que contiene lípidos a un tubo de centrífuga fresco y frío de 50 mililitros. Transfiera una alícuota de 100 microlitsión del sobrenadante postnuclear a un tubo de microcentrífuga frío de 1,7 mililitros sobre hielo para un análisis de pureza posterior. Para eliminar las mitocondrias, centrifugar la muestra de sobrenadante postnuclear en una centrífuga refrigerada de alta velocidad a 12.000 veces g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.Asegúrese de que cualquier lípido recogido en la parte superior del tubo se resuspenda para evitar la pérdida de LD, y luego transfiera el sobrenadante post-mitocondrial a un tubo ultracentrífugo de 13 mililitros. Transfiera una alícuota de 100 microlitsión del sobrenadante postmitocondrial a un tubo de microcentrífuga frío de 1,7 mililitros sobre hielo para su posterior análisis de pureza. Llene el tubo de ultracentrífuga con sobrenadante post-mitocondrial hasta el borde con tampón frío 1x IE, para evitar que se derrumbe durante la ultracentrifugación.Equilibre las muestras y luego centrifugar en una ultracentrífuga a 100.000 veces g durante 60 minutos a cuatro grados centígrados. Para eliminar la capa LD, incline el tubo en un ángulo de 45 grados y aspire con una pipeta de vidrio. Después de transferir el pellet a un tubo de microcentrífuga frío de 1,7 mililitros, recoja 100 microlitros del sobrenadante post-ER bajo la capa lipídica para el análisis de pureza.Para peletizar cualquier escombro celular, centrifugar en una microcentrífuga a máxima velocidad durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Luego, calienta el tubo suavemente con las manos para ayudar a resuspender la capa LD, y transfiere el sobrenadante, incluyendo la capa lipídica, a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros. Repita estos pasos de lavado, calentando el tubo de dos a tres veces, hasta que el pellet ya no sea visible.Luego, para lavar el sobrenadante LD sin pellets, agregue 1x PBS a un volumen final de 1,5 mililitros, y centrífuga en una microcentrífuga a máxima velocidad durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Utilice una pipeta de vidrio para eliminar un mililitro de 1x PBS, que está debajo de la capa de lípidos, sin alterar la capa lipídica. Repita el lavado de LD de cuatro a cinco veces, hasta que el 1x PBS sea visualmente transparente sin turbidez.A continuación, utilice una pipeta de vidrio para eliminar la 1x PBS por debajo de la capa lipídica, y utilice la fracción LD pura resultante para el análisis posterior. Cuando se tomaron imágenes representativas de LD fluorescentes y de campo brillante de 20x de los métodos de aislamiento LD del kit de ER y de la sacarosa LD, revelaron niveles similares de partículas, lo que sugiere purezas similares utilizando dos protocolos diferentes. Después de la purificación, los niveles de triglicéridos LD y proteínas se midieron utilizando ensayos colorimétricos, y los datos se normalizaron al peso hepático, mostrando que cuando se normalizó el material de partida, los rendimientos de triglicéridos y proteínas de LD fueron similares utilizando el kit de ER y el método de sacarosa.Los diámetros de LD se cuantificaron utilizando software de análisis de imágenes, lo que muestra que el aislamiento LD del kit de ER y el aislamiento ld de sacarosa producían LDs de tamaños similares. Para evaluar la pureza de la LD, las muestras fueron analizadas por inmunoblotting, mostrando que los LD derivados del aislamiento LD del kit de ER y el protocolo de gradiente de sacarosa tenían la misma pureza. PLIN2, un marcador LD, se detectó en todas las muestras excepto en el aislamiento de LD del kit de ER PER y el PNS de la sacarosa.El análisis de pureza de una fracción de ER utilizando inmunoblots muestra que estaban libres del marcador LD PLIN2 pero tenían niveles significativos de la proteína ER SEC61A. También se evaluó la pureza de una fracción lisosomal después de una mayor purificación de los lisosomas utilizando el kit de enriquecimiento de lisosomas. Discovery es actualmente la aplicación más útil de nuestro protocolo.Realizamos lipidómicas en orgánulos purificados, y mostró que las lipotoxinas se incrementan específicamente en gotas lipídicas en la enfermedad hepática alcohólica.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video muestra una técnica para visualizar la formación de la sinapsis inmunológica en células asesinas naturales (NK) en una bicapa lipídica (SLB) soportada. El SLB se marca primero con un ligando del receptor activador de células NK marcado con fluoróforos, seguido de la incubación con células NK. Posteriormente, las células se tiñen para obtener actina polimerizada y gránulos líticos perforin-positivos. Este enfoque permite la visualización de la formación de sinapsis mediante...

Imágenes de superresolución de la formación de sinapsis inmunológica de células NK en una bicapa lipídica soportada

La reconstitución de proteínas de membrana funcionales en los liposomas gigantes de composición definida es un enfoque poderoso cuando se combina con la electrofisiología de patch-clamp. Sin embargo, la producción convencional de liposomas gigante puede ser incompatible con la estabilidad de la proteína. Se describen protocolos para producir liposomas gigantes de lípidos puros o pequeños liposomas que contienen canales iónicos.

Preparación de liposomas gigantes de la Imagen y Patch-Clamp Electrofisiología

Dos técnicas para aislar las gotas de lípidos celulares de 1) las células de levadura y 2) se presentan placentas humanas. La pieza central de ambos procedimientos es la centrifugación en gradiente de densidad, donde la capa flotante resultante que contiene las gotas puede ser visualizado fácilmente por el ojo, se extrae, y se cuantifica por análisis de Western Blot para la pureza.

El aislamiento de gotas de lípidos celulares: dos técnicas de purificación partir de células de levadura y placentas humanas

MicroARNs juegan un importante papel regulador y están surgiendo como nuevas dianas terapéuticas para diversas enfermedades humanas. Se ha demostrado que miRNAs se realizan en las lipoproteínas de alta densidad. Hemos desarrollado un método simplificado para aislar rápidamente HDL purificado adecuado para el análisis de los genes miARN partir de plasma humano.

Método rápido y simplificado para el aislamiento alto rendimiento de procesamiento de miRNA desde muy puras lipoproteína de alta densidad

A continuación, se presenta un protocolo para detectar eventos individuales, SNARE mediada por liposomas y de fusión entre bicapas soportadas en los canales de microfluidos utilizando TIRFM polarizado, con sensibilidad única molécula y ~ 15 ms tiempo de resolución. Lípidos y liberación de carga solubles se pueden detectar de forma simultánea. tamaño de los liposomas, de difusividad de los lípidos, y poro de fusión propiedades se miden.

La fusión mediada por SNARE de proteoliposomas individual con bicapas soportadas atados en una celda de flujo de microfluidos supervisado por microscopía TIRF polarizada

Este protocolo describe el aislamiento y la cuantificación de pequeños ARN de lipoproteínas de alta densidad.

El aislamiento de las lipoproteínas de alta densidad para no codificante ARN pequeño Cuantificación

gotitas de lípidos son orgánulos importantes para la replicación de varios patógenos, incluyendo el virus de la hepatitis C (VHC). Se describe un método para aislar las gotas de lípidos para la espectrometría de masas cuantitativa de proteínas asociadas; se puede utilizar bajo una variedad de condiciones, tales como infección por el virus, el estrés ambiental, o tratamiento con fármacos.

Aislamiento gotas de lípidos para el análisis cuantitativo de Espectrometría de Masas

Se presenta un protocolo rápido y eficaz para el aislamiento de gotitas lipídicas de plastoglobullos asociadas a diversos organismos fotosintéticos. La preparación exitosa de plastoglóbulos aislados es un primer paso crucial que precede a las investigaciones moleculares detalladas, como los análisis proteómicos y lipidómicos.

Aislamiento de gotitas lipídicas de plastoglobulo del tejido foliar de plantas y cianobacterias

Presentamos un protocolo para la reconstitución de proteínas de membrana y encapsulación de enzimas y otros componentes solubles en agua en vesículas lipídicas de tamaño submicrométrico y micrométrico.

Construcción de redes metabólicas fuera de equilibrio en vesículas de tamaño nanométrico y micrométrico

La lipofagia es una forma selectiva de autofagia que implica la degradación de las gotas de lípidos. Las disfunciones en este proceso se asocian con el desarrollo del cáncer. Sin embargo, los mecanismos precisos aún no se comprenden completamente. Este protocolo describe enfoques de imágenes cuantitativas para comprender mejor la interacción entre la autofagia, el metabolismo de los lípidos y la progresión del cáncer.

Explorando la regulación del catabolismo de las gotas lipídicas a través de la lipofagia

Aprende un protocolo rápido para aislar gotas lipídicas de hígado de ratón mediante la modificación de un kit comercial de retículo endoplásmico. Este método permite la purificación simultánea de múltiples organelos para estudios de biología celular.

Lipídico rápido gota protocolo de aislamiento utilizando un Kit de aislamiento de organelas bien establecidas

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