Name: Purificación de la fracción defípoda dendrítica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Aprende a purificar la fracción rica en filopodios dendríticos de neuronas hipocampales cultivadas mediante la afinidad entre TLCN y vitronectina. Este método permite identificar proteínas activas en sinapsis inmaduras.

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Agradecemos a Shigeo Okabe y Hitomi Matsuno por la cultura de baja densidad de las neuronas hipocampales, Masayoshi Mishina por ratones con deficiencia de TLCN, Sachiko Mitsui y Momoko Shiozaki por la asistencia técnica, y miembros del laboratorio Yoshihara para discusiones útiles . Este trabajo fue apoyado por JSPS KAKENHI Grant Nos. JP20700307, JP22700354, y JP24500392 y MEXT KAKENHI Grant Nos. JP23123525 a YF y JP20022046, JP18H04683 y JP18H05146 a YY.

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de RIKEN Wako.
1. Cultura de las neuronas del hipocampo
<ol><li>Preparación del medio de cultivo
	<ol>
<li>Preparación de la mezcla de vitamina 200x. Disolver 100 mg de sal hemicalcio ácido D-pantoténico, 100 mg de cloruro de colina, 100 mg de ácido fólico, 180 mg de i-inositol, 100 mg de niacinamida, 100 mg de pyridoxal HCl, y 100 mg de tiamina HCl en 500 ml de agua ultrapura utilizando un agitador magnético. La solución no está completamente disuelta. Mezclar cuidadosamente, alícuota en tubos de 50 ml y almacenar a -20 oC.</li>
		<li>Preparación de la solución de Riboflavina. Disolver 100 mg de Riboflavina en 500 ml de agua ultrapura utilizando un agitador magnético. La solución no está completamente disuelta. Mezclar cuidadosamente, alícuota en tubos de 50 ml y almacenar a -20 oC.</li>
		<li>Preparación de 1 M CaCl2. Disolver 7,35 g de CaCl2x 2Hen50 ml de agua ultrapura utilizando un agitador magnético.</li>
		<li>Preparación del medio esencial mínimo (MEM). Disolver 400 mg de KCl, 6800 mg de NaCl, 2.200 mg de NaHCO3, 158 mg de NaH2PO4x 2H2O, 7000 mg de D-glucosa y 200 mg de MgSO4-7H2O en 950 ml de agua ultrapura utilizando un agitador magnético.</li>
		<li>Valorar 1,8 ml de 1 M CaCl2 al MEM de una manera gota a gota utilizando un pipeta de 1 ml con una agitación constante en un agitador magnético. Ajuste el pH del MEM a pH 7,25 con 1 mol/L HCl.</li>
		<li>Añadir 5 ml de 200x de mezcla de vitaminas y 200 ml de solución de riboflavina al MEM. Ajuste el volumen de la solución a 1.000 ml con agua ultrapura. Filtrar la solución utilizando un sistema de filtro de 0,22 m y almacenarla a 4 oC.</li>
		<li>Preparación de 10 soluciones de stock DNase-I. Disolver 100 mg de DNase-I en 12,5 ml de la solución salequilibrada de Hanks (HBSS), filtrar a través de un filtro de 0,22 m, alícuota en tubos de 1,5 ml y almacenar los tubos a -20 oC.</li>
		<li>Preparación de la solución de stock de citosina-D-arabinofuranoside (Ara-C). Disolver 25 mg de Ara-C en 8,93 ml de agua ultrapura (concentración final de 10 mM), filtrar a través de un filtro de 0,22 m, alícuota en tubos de 1,5 ml y almacenar a -20 oC</li>
		<li>Preparación del medio de chapado. Mezclar 1 ml de solución de aminoácidoME, 750 ml de 1 M HEPES, 1 mL de B27, 125 ml de glutamina de 200 ml, 250 ml de penicilina/estreptomicina, 2,5 ml de suero bovino fetal (FBS) y 44,375 ml de MEM en un tubo de 50 ml.</li>
		<li>Preparación del medio Stop. Mezclar 1 ml de solución de aminoácidos MEM, 750 ml de 1 M HEPES, 5 mL de FBS (final 10%), y 43,25 ml de MEM en un tubo de 50 ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de platos recubiertos de poli-L-lisina
	<ol>
<li>Recubrir platos de cultivo de células de plástico de 35 mm con 0,2 mg/ml de hidrobromuro de polillisina durante 1 día a 25 oC. NOTA: Poli-L-lisina no debe utilizarse en lugar de poli-L-lisina hidrobromida.</li>
		<li>Lavar los platos con 2 ml de agua ultrapura 3 veces. Incubar los platos con 1,5 ml de medio Stop a 25oC hasta su uso.</li>
	</ol></li>
	<li>Disección de neuronas hipocampales a partir de embrión de ratón
	<ol>
<li>Fuente de tejido de las neuronas del hipocampo. Diseccionar el hipocampo de ratones C57BL6/J de tipo salvaje y deficiente en TLCN en los días embrionarios 16-17 según el método de Lu et al.19.</li>
		<li>Incubar hipocampo diseccionado en 0.25% trypsin y 1x DNaseI en HBSS que contiene 15 mM HEPES, pH 7.2 para 15 min a 37 oC con agitación cada 3 min. Retire la solución. Incubar el hipopótamo en 10 mL de medio STOP para inactivar la trippsina a 4oC durante 5 min.</li>
		<li>Mover el hipocampo a 10 mL de medio STOP fresco e incubar a 4 oC durante 5 min. Mover el hipocampo en 10 mL de medio STOP fresco e incubar a 4 oC durante otros 5 min. Mover el hipocampo en 900 éL de medio STOP y 100 oL de 10x DNaseI en un 15 min. tubo mL. Disociar el hipocampo en neuronas aisladas pipeteando 20 veces usando una pipeta de 1 ml. NOTA: La punta del pipeteo de 1 ml toca ligeramente la parte inferior del tubo de 15 ml durante la disociación del hipocampo.</li>
		<li>Agregue 9 ml de medio de chapado y filtre a través de un colador de células de 70 m en un tubo de 50 ml. Cuente el número de células usando un hemocitómetro y ajuste a 3.5 x 104 células/ml en el medio de chapado.</li>
		<li>Aspirar STOP medio de platos recubiertos de poli-L-lisina. Placar las células en platos recubiertos de poli-L-lisina a 7 x 104 células / plato (2 mL / plato).</li>
		<li>Después de 60-64 h de incubación por debajo del 5% de CO2 a 37 oC, añadir 2 seres de ara-C (final 10 m) a las neuronas, y agitar el plato lentamente. Mantener los platos de cultivo en una caja humidificada sin cambiar el medio de cultivo por debajo del 5% deCO2 a 37oC.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Purificación de la fracción defípoda dendrítica rica en filopodia
<ol><li>Después de 13 días in vitro (DIV), añadir microperlas de poliestireno magnético (3 x 106 partículas / plato) a 20 platos que contienen las neuronas cultivadas. Después de 1 día, lavar las neuronas en 1 ml de PBS con agitación 3 veces para eliminar los microperlas medianas y no unidas. Después de eliminar el PBS, lise las neuronas con 500 l /plato de tampón de lisis (PBS que contiene 0.01% Triton X-100, cóctel inhibidor de proteasa libre de EDTA, y cóctel inhibidor de fosfatasa).</li>
	<li>Recoger el lisado con un rascador celular y mover el lisado a microtubos de baja unión a proteínas (10 tubos). Ajuste los tubos en un separador de imán y espere 1 min. Recoger el sobrenadante y utilizarlo como la fracción sin ataduras para la tinción de plata y el análisis de manchas occidentales.</li>
	<li>Transfiera las perlas a un nuevo microtubo de unión a proteínas, se ajuste a un separador magnético y retire por completo el sobrenadante. Añadir 500 l de tampón de lisis y lavar las perlas con un mezclador de vórtice durante 15 s. Ajuste el tubo en un separador de imán, espere 1 min, retire el sobrenadante y agregue 500 ml de tampón de lisis. Repita el lavado de las perlas 10 veces y retire el sobrenadante.</li>
	<li>Elute las proteínas unidas a las perlas (la fracción enlazada) por la adición de 50 l de 1 tampón de muestra de SDS (62,5 mM Tris HCl, pH 6,8, 2,5% SDS y 10% de glicerol) y hervir el tubo a 98 oC durante 5 min. Centrifugar el tubo a 860 x g durante 10 s y establecer el tubo de tubo en un separador magnético durante 1 min. Recoger el sobrenadante y utilizarlo como fracción enlazada. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.</li>
	<li>Mida las concentraciones proteicas de las fracciones no consolidadas y enlazadas por el ensayo de proteína BCA. Visualice las soluciones proteicas con azul bromofenol y ajuste la concentración a 5 ng/L para SDS-PAGE.</li>
</ol>3. Tinción de Plata y Análisis de Manchas Occidentales
<ol><li>Separe las fracciones enlazadas y no enlazadas (50 ng) por SDS-PAGE utilizando un gel degradado de 5-20%. Mancha de plata el gel.</li>
	<li>Blot occidental usando anti-TLCN-C (1/3,000), vitronectina antibovina (1/5,000), anti-actina (1/1,000) y anti-a-tubulina (1/1.000) como anticuerpos primarios y IgG de cabra conjugado en HRP (1/5,000) como anticuerpo secundario. Visualice los antígenos utilizando el reactivo de detección de manchas occidentales quimioluminiscentes y un imager de quimioluminiscencia.</li>
</ol>

<ol><li>Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptogenesis+via+dendritic+filopodia+in+developing+hippocampal+area+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1.</a> Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-regulated+dynamic+behavior+of+early+dendritic+protrusions%3A+evidence+for+different+types+of+dendritic+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia.</a> Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).</li>
<li>Ziv, N. E., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+role+of+dendritic+filopodia+in+synaptogenesis+and+spine+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation.</a> Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).</li>
<li>Lohmann, C., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+local+calcium+signaling+in+rapid+synaptic+partner+selection+by+dendritic+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia.</a> Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).</li>
<li>Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+formation+and+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine formation and stabilization.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).</li>
<li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+human+and+mouse+postsynaptic+proteomes+finds+high+compositional+conservation+and+abundance+differences+for+key+synaptic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins.</a> PLoS One. 7 (10), e46683(2012).</li>
<li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+proteome%2C+diseases+and+evolution+of+the+human+postsynaptic+density%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density.</a> Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).</li>
<li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+telencephalin+and+ERM+family+proteins+mediates+dendritic+filopodia+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation.</a> Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).</li>
<li>Mao, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodia+Conduct+Target+Selection+in+Cortical+Neurons+Using+Differences+in+Signal+Kinetics+of+a+Single+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase.</a> Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).</li>
<li>Matsuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telencephalin+slows+spine+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Telencephalin slows spine maturation.</a> Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).</li>
<li>Raemaekers, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF6-mediated+endosomal+transport+of+Telencephalin+affects+dendritic+filopodia-to-spine+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation.</a> The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).</li>
<li>Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telencephalon-specific+antigen+identified+by+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).</li>
<li>Yoshihara, Y., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telencephalin%3A+a+neuronal+area+code+molecule%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Telencephalin: a neuronal area code molecule?</a> Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).</li>
<li>Annaert, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+telencephalin+and+the+amyloid+precursor+protein+predicts+a+ring+structure+for+presenilins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins.</a> Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).</li>
<li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitronectin+induces+phosphorylation+of+ezrin%2Fradixin%2Fmoesin+actin-binding+proteins+through+binding+to+its+novel+neuronal+receptor+telencephalin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).</li>
<li>Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Actinin-dependent+cytoskeletal+anchorage+is+important+for+ICAM-5-mediated+neuritic+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).</li>
<li>Esselens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin+1+mediates+the+turnover+of+telencephalin+in+hippocampal+neurons+via+an+autophagic+degradative+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway.</a> Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).</li>
<li>Furutani, Y., Yoshihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Analysis+of+Dendritic+Filopodia-Rich+Fraction+Isolated+by+Telencephalin+and+Vitronectin+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Synaptic+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27(2018).</li>
<li>Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified+Method+for+Ultra-Low+Density%2C+Long-Term+Primary+Hippocampal+Neuron+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).</li>
<li>Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+the+C-terminal+domain+regulates+cell+surface+expression+of+the+NMDA+receptor+NR1+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).</li>
<li>Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+synaptogenesis+of+hippocampal+neurons+without+NMDA+receptor+function+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture.</a> European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Desarrollamos un método de purificación para la fracción dendrítica rica en filopodia utilizando la afinidad entre la molécula de adhesión celular TLCN y la matriz extracelular profisitecina. En comparación con la fracción de PSD, podría ser posible identificar las proteínas sinápticas que actúan sobre la sinapsis inmadura de la fracción dendritica rica en filopodia. Por lo tanto, los componentes de la fracción dendrítica rica en filopodia son diferentes de los de la fracción PSD por 74%. A diferencia de la fracción de P...

Filopodia dendrítica se cree que son precursores de las espinas. Los filamentos de actina en la filopodia dendrítica regulan su extensión y retracción1,2,3. Después de entrar en contacto con un axón, la filopodia dendrítica seleccionada comienza su maduración en espinas, y se forma una sinapsis4,5. Los componentes de las espinas se han determinado a partir de un análisis exhaustivo de las fracciones de densidad postsináptica6,7, mientras que los componentes de la filopodia dendrítica siguen siendo en gran medida desconocidos. Se ha demostrado que la telencefalina (TLCN), ERM, SynGAP, Ras, PI3 quinasa, Akt, mTOR, polo-como quinasa 2, CaMKII, syndecan-2, paralemin-1, ARF6, y EphB regulan la formación de filopodia dendrítica5,8,9 ,10,11, mientras que no se ha desarrollado un método para el análisis integral de moléculas presentes en la filopodia dendrítica.
TLCN (ICAM-5) se expresa específicamente por las neuronas espinosas en el segmento cerebral más rostral, el telencéfalo12. TLCN tiene 9 dominios similares a Ig en su región extracelular, una región transmembrana y una cola citoplasmática13. EL TLCN se une a vitronectina (VN) y a la integrina LFA-1 en su región extracelular, a la presenilinicina ensu región transmembrana, y a la fosfo-ERM y a la actina en su región citoplasmática 5,8,14,15 ,16. El TLCN se une al citoesqueleto de actina a través de fosfo-ERM en las puntas de filopodia dendrítica y de actinina en espinas y ejes dendríticos8,16.
Mostramos que la sobreexpresión de TLCN mejoró la formación de filopodia dendrítica e indujo la reversión de las espinas a la filopodia10. La forma activa constitutiva de ezrin ligada a la región citoplasmática TLCN y la formación de filopodia dendrítica mejorada8. Por lo tanto, TLCN regula la formación de filopodia dendrítica a través de proteínas de unión a la actina. Esselens y otros demostraron que las microperlas indujeron la acumulación de TLCN en las neuronas cultivadas17. Mostramos que las estructuras de copa shagocíticas se formaron sobre dendritas neuronales alrededor de microperlas recubiertas de VN de una manera dependiente del TLCN15. Los componentes de la filopodia dendrítica son similares a los de la copa fagocítica. Es difícil recoger filopodia dendrítica, pero es relativamente más fácil recoger la copa fagocítica usando microperlas magnéticas. Así, desarrollamos un método para purificar la copa fagocítica en lugar de la filopodia dendrítica18. Aquí, describimos el método de purificación para la fracción dendrítica rica en filopodia.

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>1,7 mLl MCT de baja unión</td><td>Sorenson BioScience</td><td>39640T</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>2530149</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultivo celular de plástico de 35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Anti-actina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5060</td><td></td></tr><tr><td>Anti-alfa-actinina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5044</td><td></td></tr><tr><td>Anti-alfa-tubulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9026</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ezrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>clone3C12, SAB4200806</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Galphaq</td><td>Santacruz</td><td>sc-393</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MAP2</td><td>Chemicon</td><td>clon AP20, MAB3418</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Moesin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>clon 38/87, M7060</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PLCbeta1</td><td>Santacuz</td><td>sc-5291</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PSD95</td><td>MA2</td><td>ABR</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Spectrin beta</td><td>Chemicon</td><td>MAB1622</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>0080085SA</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas BCA</td><td>Thermo</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Merck</td><td>1.08122.0005</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio, hidratado</td><td>Wako</td><td>038-19735</td><td></td></tr><tr><td>Rascador de células</td><td>Falcon</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de colina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7527</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel completo de inhibidores de proteasa libres de EDTA</td><td>Roche 11873580001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citosina beta-D-arabinofuranósido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-6645</td><td></td></tr><tr><td>DNasa-I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>Ácido D-pantoténico sal hemicálcica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5155</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Imán</td><td>Thermo</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>ECL Prime Western Reactivo de detección de transferencia</td><td>GE RPN2232</td><td></td><td></td></tr><tr><td>e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gel degradado</td><td>ATTO</td><td>E-T520L</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fólico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8758</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-conejo conjugada con HRP</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-035-144</td><td></td></tr><tr><td>i-Inositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7508</td><td></td></tr><tr><td>LAS-1000 mini</td><td>Película Fuji</td><td>LAS-1000 mini</td><td>Para la detección de luminiscencia de la membrana WB</td></tr><tr><td>Microesferas magnéticas de poliestireno</td><td>Sperotech</td><td>PM-20-10</td><td></td></tr><tr><td>MEM solución de aminoácidos</td><td>Gibco</td><td>11130-051</td><td>30 mM Clorhidrato de L-Arginina, 5 mM L-Cistina, 10 mM L-Clorhidrato de H2O, 20 mM L-Isoleucina, 20 mM L-Leucina, 19,8 mM Clorhidrato de L-Lisina, 5,1 mM L-Metionina, 10 mM L-fenilalanina, 20 mM L-Treonina, 2,5 mM L-triptófano, 10 mM L-tirosina y 20 mM L-Valina</td></tr><tr><td>Sistema de electroforesis de tamaño mini-losa</td><td>ATTO</td><td>AE-6530</td><td></td></tr><tr><td>Niacinamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de fosfatasa PhosSTOP</td><td>Roche 4906845001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidrobromuro de poli-L-lisina</td><td>Nacali</td><td>28360-14</td><td></td></tr><tr><td>Piridoxal HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6155</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9504</td><td></td></tr><tr><td>Silver Stain 2 Kit wako</td><td>Wako</td><td>291-5031</td><td></td></tr><tr><td>Tiamina HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1270</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Célula de Transferencia Semi-Seca</td><td>Bio-rad</td><td>1703940JA Agua ultrapura</td><td></td></tr><tr><td></td><td>MilliQ</td><td></td><td>Para la producción de agua ultra pura</td></tr></tbody></table>

purificación de la fracción defípoda dendrítica

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

La filopodia dendrítica son protuberancias delgadas y largas basadas en el filamento de actina, y se extienden y se retraen como si buscaran un axón objetivo. Cuando la filopodia dendrítica establece contacto con un axón objetivo, comienzan a madurar en espinas, lo que conduce a la formación de una sinapsis. La telencefalina (TLCN) se localiza abundantemente en filopodia dendrítica y se excluye gradualmente de las espinas. La sobreexpresión de TLCN en neuronas hipocampales cultivadas induce la formación de filopodia dendrítica. Mostramos que la telencefalia se une fuertemente a una molécula de matriz extracelular, vitronectina. Microperlas de Vitronectina inducida por la formación de copas fagocíticas en dendritas neuronales. En la copa fagocítica, se acumulan TLCN, proteínas de unión a TLCN como Ezrin/Radixin/Moesin(phospho-ERM) foso-ERM, y F-actina, lo que sugiere que los componentes de la copa fagocítica son similares a los de la filopodia dendrítica. Por lo tanto, desarrollamos un método para purificar la copa fagocítica en lugar de filopodia dendrítica. Las perlas de poliestireno magnético fueron recubiertas con vitronectina, que está abundantemente presente en el medio de cultivo de las neuronas del hipocampo y que induce la formación de copas fagocíticas en dendritas neuronales. Después de 24 horas de incubación, las copas fagocíticas fueron ligeramente solubilizadas con detergente y recogidas con un separador de imán. Después de lavar las cuentas, las proteínas de unión fueron eluidas y analizadas por la tinción de plata y la hincha occidental. En la fracción de unión, TLCN y actina estaban abundantemente presentes. Además, muchas proteínas identificadas a partir de la fracción fueron localizadas a la filopodia dendrítica; por lo tanto, nombramos la fracción de unión como la fracción dendrítica rica en filopodia. Este artículo describe los detalles sobre el método de purificación para la fracción dendrítica rica en filopodia.

En las neuronas del hipocampo cultivadas, el TLCN fue localizado abundantemente a la filopodia dendrítica, el eje y el soma y colocalizó con F-actina (Figura1A,B). Cuando se añadieron microperlas de poliestireno a las neuronas del hipocampo cultivadas, las cuentas fueron recubiertas automáticamente con vitronectina (VN) derivada del suero bovino fetal (FBS) en el medio de cultivo; estaban destinados principalmente a dendritas, e indujeron la ...

En este protocolo, introducimos un método para purificar la fracción dendrítica rica en filopodia a partir de la estructura de protrusión phagocítica similar a la copa en las neuronas del hipocampo cultivadas aprovechando la afinidad específica y fuerte entre un filopodial dendrítico molécula de adhesión, TLCN, y una molécula de matriz extracelular, vitroctina.

Purificación de la fracción defípoda dendrítica

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

En comparación con la fracción PSD, puede ser posible identificar la proteína sináptica que actúa sobre la sinapsis inmadura alrededor de la fracción rica en filopodia dendrítica. Usamos neuronas vivas para inducir la formación de gorra fagocítica. La principal ventaja de esta técnica es que la proteína activa en la génesis artificial podría identificarse a partir de la fracción rica en filopodia dendrítica.Para empezar, preparar 200x mezcla de vitaminas disolviendo 100 mg de vitamina B5, 100 mg de cloruro de colina, 100 mg de ácido fólico, 180 mg de I-inositol, 100 mg de vitamina B3, 100 mg de clorhidrato de vitamina B6, y 100 mg de clorhidrato de tiamina en 500 ml de agua ultrapura utilizando un agitador magnético. Mezcle cuidadosamente la alícuota en tubos de 50 ml y guárdelo a 20 grados centígrados. Para preparar la solución de riboflavina, disolver 100 mg de riboflavina en 500 mg de agua ultrapura utilizando un agitador magnético.Mezcle cuidadosamente la alícuota en tubos de 50 ml y guárdelo a 20 grados centígrados. Para preparar un dicloruro de calcio molar disolver 7,35 gramos de cloruro de calcio dihidrato en 50 ml de agua ultrapura utilizando un agitador magnético. Para la

purification-of-the-dendritic-filopodia-rich-fraction

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