Name: Disección de la Retina Pupal de Drosophila para inmunohistoquímica, Western análisis y aislamiento de ARN (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Aprende a disecar retinas pupales de Drosophila para inmunohistoquímica, análisis Western y extracción de ARN. Este método eficiente preserva la integridad tisular y permite múltiples aplicaciones posteriores en neurociencia y biología del desarrollo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Agradecemos a Zack tambor y nuestros revisores para comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por R15GM114729.

1. preparación de tejido
<ol><li>Configurar Drosophila cruza (como se describe anteriormente20) o cepas específicas de Drosophila para obtener pupas del genotipo deseado de la cultura. Para asegurar que un gran número de pupas emerge coincidentemente, establecer estas culturas mosca por duplicado en medios de alimentos ricos en nutrientes o alimentos medios suplidos generosamente con pasta de levadura.</li>
	<li>Mantener cultivos de Drosophila a 25 ° C. Para cruces utilizando el sistema UAS-GAL4, GMR-GAL4 es un conductor ideal expresado en células de ojo larvas disco posteriores al surco morfogenético y desarrollo pupal21,22,23, 24. Cruz de la Cruz UAS-lacZ X GMR-GAL4 sirve como un control ideal como unidades de expresión de la proteína β-galactosidasa no endógeno e inerte.</li>
	<li>Uso la punta de una 6" bambú tablilla que se ha mojado con agua destilada suavemente Levante blanco pre-pupa (figura 1B) del lado de los frascos de cultivo sano (figura 1A) y coloque en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (figura 1).</li>
	<li>Colocar los tubos en una caja de punta de pipeta de plástico junto con un pequeño trozo de tejido empapado en agua destilada para mantener la cámara a humedad suficiente para proteger a las pupas de desecación (figura 1). Incubar las pupas a 25 ° C hasta la disección.</li>
	<li>Utilizar una tablilla de bambú seco 6" para empujar suavemente las pupas hacia fuera del tubo de microcentrífuga y sobre un negro plato de disección. Pone un fresco pedazo de cinta de doble cara en el plato disección de las pupas.</li>
	<li>Usando un par de pinzas, coloque cuidadosamente el lado dorsal de pupas para arriba (es decir, opérculos hacia arriba, figura 1B) en la cinta (figura 2A). Asegúrese de que las pupas se adhieren bien a la cinta. Nota: Humedad en la envoltura pupal inhiben la adhesión segura a la cinta, en cuyo caso, permitir que las pupas secar antes de colocar en la cinta de doble cara.</li>
</ol>2. disección de ojo-cerebro complejos
<ol><li>Utilizar pinzas para quitar el opérculo de cada pupa (figura 2).</li>
	<li>Utilice tijeras de microdisección para rebanar o cortar abierto la envoltura pupal de cada pupa. La aleta abrir la envoltura pupal para revelar la cabeza, el tórax y el segmento abdominal anterior, asegurar los bordes de la envoltura pupal en la cinta de doble cara (figura 2). Nota: No es necesario revelar completamente las pupas.</li>
	<li>Perforar el abdomen de cada pupa con pinzas afiladas, agarrar al animal y sacarlo de su envoltura pupal (figura 2).</li>
	<li>Colocar las pupas en el plato negro de disección, de la cinta y cubra con unos 400 μL de helada-tampón-solución de fosfato (PBS, pH 7,4).</li>
	<li>Sujete cada pupa por el abdomen con pinzas y tijeras de microdisección, hacer un corte limpio transversal a través del tórax entero, corte la pupa en medio (Figura 2D).</li>
	<li>Eliminar el remanente posterior de cada canal de PBS y poner a un lado en la bandeja de disección (descartar, consulte el paso 3.2.1).</li>
	<li>Con dos pares de Pinzas finas, abra el tórax y la cabeza de cada pupa para revelar el ojo-cerebro complejo (Figura 2E). Para ello, sujete los bordes de corte del epitelio del tórax y gradualmente rasgar para abrir el tórax y luego la cápsula, exponiendo el tejido gordo ojo-cerebro complejo y sus alrededores.</li>
	<li>Sin agarrar el tejido, use pinzas para guía del complejo de ojo-cerebro lejos de los restos de la cápsula de la cabeza o pala el complejo músculo-ojo-cerebro de la cápsula principal abierto rasgado. Nota: El complejo de ojo-cerebro es en forma de pesa de gimnasia, grisáceo y más transparente que la grasa circundante de color crema (figura 2B, E).</li>
	<li>Con pinzas, con cuidado retire grasa más asociada a los complejos de músculo-ojo-cerebro sin tocar el tejido del ojo.</li>
</ol>3. procesamiento del tejido para inmunofluorescencia
<ol><li>Diseccionar al menos 6-10 pupas como descritos (pasos 2.1-2.9). Nota: Tres a cuatro repeticiones independientes de cada disección tienden a producir suficientes datos para probar una hipótesis.</li>
	<li>
Lavado y fijación
	<ol>
<li>Cortar la punta de un P20 o pipeta P100 con una cuchilla de afeitar limpia para aumentar la apertura de punta a ~ 1 mm de radio y lubricar mediante pipeteo una mezcla de PBS y grasa hacia arriba y hacia abajo. Esta grasa se puede obtener de los restos de caparazón quitados en el paso 2.6.</li>
		<li>Transferir los complejos músculo-ojo-cerebro a ~ 400 μL de PBS en un plato de vidrio 9-bien, en el hielo. Utilizar la punta lubricada y una micropipeta de desplazamiento de aire P20 o P100 para transferir. Nota: Complejos de músculo-ojo-cerebro se adhieren a los consejos sin lubricación durante el pipeteo y ser dañados o perdidos.</li>
		<li>Eliminar la grasa restante asociada con el tejido del ojo mediante pipeteo PBS hacia arriba y hacia abajo para agitar suavemente los complejos músculo-ojo-cerebro. En este y todos los pasos de lavado posterior, no directamente pipetear complejos músculo-ojo-cerebro arriba y abajo esto dañará el tejido frágil ojo.</li>
		<li>Transferencia de los complejos de músculo-ojo-cerebro de un volumen mínimo (< 20 μl) de PBS en por lo menos 250 μl de fijador. Mezclar mediante pipeteo la solución hacia arriba y hacia abajo. Incubar durante 35 min, en el hielo. Nota: Puede utilizarse la misma punta lubricada preparada en el paso 3.1.1 para este traslado.</li>
		<li>Con la misma punta de pipeta, transfiera los complejos músculo-ojo-cerebro en un pozo que contiene μl de ~ 400 de PBS. Mezclar mediante pipeteo la solución hacia arriba y hacia abajo e incubar durante 5-10 min en hielo, para lavar. ¡Repetir el lavado por lo menos dos veces. Nota: Complejos de músculo-ojo-cerebro se pueden mantener durante varias horas en el último lavado PBS, en hielo o a 4 ° C, antes de proceder al paso 3.3.1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tinción de anticuerpos
	<ol>
<li>Para bloquear el tejido antes de la exposición a las soluciones de anticuerpos, transferir los complejos músculo-ojo-cerebro a ~ 400 μL de PBT. Utilice la punta lubricada y una micropipeta de desplazamiento de aire P20 o P100 para la transferencia. Incubar durante 10 a 60 min, en el hielo.</li>
		<li>Preparar la solución de anticuerpo primario mediante la dilución de anticuerpos apropiados en PBT. Desde complejos músculo-ojo-cerebro se incuban en 10 alícuotas de μl de solución de anticuerpo, el volumen elaborado será una repetición de 10.</li>
		<li>Alícuota 10 μl de solución de anticuerpo en un pozo limpio de una bandeja de 72 bien de micropocillos (ver discusión).</li>
		<li>Cortar la punta de una pipeta P10 con una cuchilla de afeitar limpia para aumentar la apertura de punta a ~0.5 mm de radio y lubrique por PBT pipeteo arriba y abajo.</li>
		<li>Transferir no más de 5 complejos de músculo-ojo-cerebro, en un volumen de < 3 μl de PBS, en cada 10 μl de solución de anticuerpo utilizando una micropipeta de desplazamiento de aire P10 y la punta lubricada.</li>
		<li>Homogeneizar la solución de anticuerpo por pipetear la solución hacia arriba y hacia abajo. No pipetear los complejos músculo-ojo-cerebro arriba y abajo, esto dañará el tejido.</li>
		<li>Para minimizar la evaporación de la solución de anticuerpo, coloque un pedazo pequeño de tejido empapado en agua destilada a la bandeja de micropocillos y sellar la bandeja (por ejemplo, con la tapa siempre). Incubar durante una noche a 4 ° C.</li>
		<li>Transferir los complejos músculo-ojo-cerebro de la bandeja de micropocillos a ~ 400 μL de PBT en un plato de cristal llenos de 9, para lavar. Utilice una micropipeta de desplazamiento de aire P10 y PBT-lubricar punta (preparar como se describe en el paso 3.3.4). Mezclar mediante pipeteo la solución hacia arriba y hacia abajo. Incubar durante 5-10 min en hielo.</li>
		<li>¡Repetir el lavado por lo menos dos veces. Utilizar una micropipeta de desplazamiento de aire P20 o P100 y punta PBT-lubricado para transferir los complejos músculo-ojo-cerebro entre soluciones de lavado.</li>
		<li>Preparar la solución de anticuerpo secundario diluyendo apropiados etiquetado fluoróforo secundarios anticuerpos en PBT como sea necesario. 100 μl de solución de anticuerpo secundario es suficiente por la hornada de pupas de 6-10. Parte alícuota de la solución de anticuerpo secundario en una bandeja de disección de vidrio cayeron 9.</li>
		<li>Transferencia de los complejos de músculo-ojo-cerebro en solución de anticuerpo secundario. Utilice una micropipeta de desplazamiento de aire P20 o P100 y PBT-lubricar punta para la transferencia.</li>
		<li>Incubar los complejos músculo-ojo-cerebro en solución de anticuerpo secundario de 1-2 h a temperatura ambiente o 3-5 h a 4 ° C. Para prevenir el blanqueo de fluoróforos por la luz, cubrir la preparación con papel de aluminio. Nota: La duración óptima de incubación en la solución de anticuerpo secundario puede diferir según los anticuerpos primarios y secundarios utilizados.</li>
		<li>Transferir los complejos músculo-ojo-cerebro a ~ 400 μL de PBT en un plato de vidrio de 9 pozos, lavar. Mezclar mediante pipeteo la solución hacia arriba y hacia abajo. Incubar durante 5-10 min en hielo. Este paso de lavado debe repetirse al menos dos veces.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fijación secundaria
	<ol>
<li>Para una fijación secundaria, transferir los complejos músculo-ojo-cerebro al menos 200 μL de fijador e incubar por 20 min a temperatura ambiente o a 35 min a 4 ° C. Nota: La fijación secundaria endurece el tejido del ojo, que ayuda de montaje (paso 3.5).</li>
		<li>Utilizar una micropipeta de desplazamiento de aire P20 o P100 y punta PBT-lubricado para transferir complejos músculo-ojo-cerebro ~ 400 μL de PBT en un plato de cristal de 9 pozos, con hielo, lavar durante 5 minutos.</li>
		<li>Repita el paso de lavado al menos una vez.</li>
		<li>Uso un P20 o P100 Micropipetas de desplazamiento de aire y punta lubricada de PBT para transferir los complejos músculo-ojo-cerebro ~ 400 μL de PBS en un plato de vidrio 9-bien, en el hielo, para enjuagar durante 1-2 minutos mantienen el tejido en movimiento por pipeteo PBS, pero no el tejido , hacia arriba y hacia abajo para evitar complejos de músculo-ojo-cerebro de colocar y adherir el plato de vidrio durante el enjuague de PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montaje
	<ol>
<li>Transferir los complejos músculo-ojo-cerebro a ~ 200 μL de medio de montaje. Utilizar una micropipeta de desplazamiento de aire P20 o P100 y punta PBT-lubricado para transferir los complejos músculo-ojo-cerebro. Permitir que el tejido se equilibren en los medios de comunicación para 1-2 h de montaje.</li>
		<li>Coloque una gota de 5-8 μl fresco del medio de montaje en un portaobjetos limpio.</li>
		<li>Corte una punta de P10 con una cuchilla de afeitar limpia para aumentar la apertura de punta a ~0.5 mm de radio y utilizar esto y una micropipeta de desplazamiento de aire P10 para transferir los complejos músculo-ojo-cerebro en 5-8 μl de medio de montaje sobre la gota de medio de montaje de la diapositiva.</li>
		<li>Usar dos agujas de tungsteno para separar los ojos de los lóbulos ópticos. Prender un complejo músculo-ojo-cerebro a la diapositiva con una aguja de tungsteno resistente y rodajas cada ojo de su lóbulo óptico asociado con una aguja de tungsteno finas (figura 2F).</li>
		<li>Utilizar la aguja de tungsteno fina maniobra cada ojo a la superficie de lo portaobjetos con la superficie basal de cada ojo junto a la diapositiva. Suavemente baje un cubreobjetos limpio sobre el tejido y garantizar con esmalte de uñas. Nota: Arreglar los ojos en la diapositiva para que queden cerca uno del otro o en línea facilitará la microscopia posterior.</li>
		<li>Imagen de la retina mediante microscopía confocal o fluorescente. Nota: Diapositivas deben ser almacenadas a 4 ° C si no reflejadas inmediatamente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. preparación del tejido ocular para Western Blotting:
<ol><li>Diseccionar pupas de 10-16 (pasos 2.1-2.9) con las siguientes modificaciones: a) se reúnen y disecar las pupas en dos tandas, 10-15 min aparte y b) diseccionar en PBS suplementado con los inhibidores de la proteasa y fosfatasa (PBS + pi).</li>
	<li>Transferencia de los complejos de músculo-ojo-cerebro utilizando un P20 o P100 Micropipetas de desplazamiento de aire y lubricada punta (preparado como en el paso 3.2.1) en ~ 400 μL de PBS + pi en un plato de vidrio 9-bien, en el hielo, enjuague brevemente. Nota: Este tip lubricado puede utilizarse para realizar los siguientes pasos 4.3 y 4.4.</li>
	<li>Repita el paso de enjuague dos veces.</li>
	<li>Transferir todos los complejos de músculo-ojo-cerebro a ~ 400 μL de PBS frío hielo + pi decantó en un plato limpio negro de disección.</li>
	<li>Retire cada ojo de los lóbulos ópticos utilizando una aguja de tungsteno resistente (para calmar el complejo músculo-ojo-cerebro) y una fina hoja de afeitar o el microdissection tijeras para corte limpio de cada ojo del lóbulo óptico. Nota: Ojos son 'pegajosos' en esta etapa y pueden adherirse levemente al disección plato. Esto es ventajoso ya que puede ayudar a facilitar la eliminación de los ojos de los lóbulos ópticos (ver discusión).</li>
	<li>'Barrido' todos los ojos en una 'pila' en el PBS + pi en la bandeja de disección, usando una hoja de un buen par de pinzas.</li>
	<li>Corte una punta de P10 con una cuchilla de afeitar limpia para ensanchar la abertura de punta a ~0.5 mm de radio y lubricar la punta interior por pipeteo Buffer de lisis de tejido (WTLB) occidental hacia arriba y hacia abajo.</li>
	<li>Transferencia de los complejos de músculo-ojo-cerebro de 5 μl de PBS + pi en un tubo de microcentrífuga de 500 μl. Utilice este Consejo lubricado y una micropipeta de desplazamiento de aire P10 para completar a la transferencia.</li>
	<li>Coloque el tubo de microcentrífuga en hielo. Agregar 1 volumen (5 μl) de WTLB a la muestra y 10 μl de tampón de muestra de concentrado de proteína de x 2 (o 2,5 μl de tampón de muestra de concentrado de proteína de 5 x). Mezclar golpeando.</li>
	<li>Vórtice de la microcentrífuga brevemente del tubo y girar por ejemplo utilizando una centrífuga mini escritorio.</li>
	<li>Almacenar la muestra a-20 ° C hasta su análisis. Analizar utilizando protocolos estándar.</li>
</ol>5. preparación del tejido ocular para la extracción de RNA:
<ol><li>Uso de guantes, escritorio limpio, microscopio, herramientas de disección y negro disección plato primero con etanol al 70% y luego con reactivo de descontaminación de Rnasa. Deje que se seque.</li>
	<li>Diseccionar pupas de 30-40 como descritos (pasos 2.1-2.9) con las siguientes modificaciones: a) se reúnen y diseccionar pupas de 6 a 8 lotes, 15-20 min aparte; b) diseccionar en PBS y c libre de nucleasas) aislar por separado cada lote de ojos sino acumular todo el tejido retiniano en el mismo tubo de microcentrífuga (paso 5.5). Nota: Tener a dos personas diseccionar al mismo tiempo acelerará el aislamiento eficiente del tejido de buen ojo.</li>
	<li>Por cada lote, aislar los complejos músculo-ojo-cerebro (pasos 2.1-2.9) y transferencia a ~ 400 μL de PBS libre de nucleasas en un plato de vidrio 9-bien aclarar brevemente, en el hielo, utilizando una micropipeta de desplazamiento de aire P20 o P100 y punta lubricada (preparado como se describe en el paso 3.1.2). Nota: Este tip lubricado puede utilizarse para realizar los siguientes pasos 5.8, 5.4 y 5.5.</li>
	<li>Repita el paso de enjuague dos veces.</li>
	<li>Transferir los complejos músculo-ojo-cerebro en una gota fresca 400 μL de PBS helado libre de nucleasas en un limpio negro plato de disección.</li>
	<li>Retire cada ojo de los lóbulos ópticos utilizando una aguja de tungsteno resistente (para calmar el cerebro ojo complejo) y una fina hoja de afeitar o el microdissection tijeras para corte limpio de cada ojo del lóbulo óptico. Nota: Ojos son 'pegajosos' en esta etapa y pueden adherirse levemente al disección plato. Esto es ventajoso ya que puede ayudar a facilitar la eliminación de los ojos de los lóbulos ópticos (ver discusión).</li>
	<li>'Barrido' todos los ojos en una 'pila' en el PBS libre de nucleasas en la bandeja de disección, usando una hoja de un buen par de pinzas.</li>
	<li>Transferencia de los ojos a un tubo de microcentrífuga estéril libre de ARNasas y flash-congelación en nitrógeno líquido.</li>
	<li>Repita la disección (pasos 5.3-5.8) de cada lote de pupas. En el mismo tubo de microcentrífuga que se ha mantenido en nitrógeno líquido (paso 5.5) para acumular todos los ojos en un tubo de transferencia de cada lote de ojos.</li>
	<li>Almacenar las muestras a-80 ° C hasta la extracción de RNA.</li>
</ol>

<ol><li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+order+in+the+Drosophila+pupal+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">The emergence of order in the Drosophila pupal retina.</a> Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).</li>
<li>Wolff, T., Ready, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWolff%2C+T+%22The+development+of+Drosophila+melanogaster%22">The development of Drosophila melanogaster</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview. 1277-1325 (1993).</li>
<li>Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+genetics+%26+development%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in the Drosophila eye.</a> Current opinion in genetics & development. 17 (4), 309-313 (2007).</li>
<li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+an+ommatidium+one+cell+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Building an ommatidium one cell at a time.</a> Developmental Dynamics. 241 (1), 136-149 (2012).</li>
<li>Hayashi, T., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+mechanics+mediate+pattern+formation+in+the+developing+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Surface mechanics mediate pattern formation in the developing retina.</a> Nature. 431, 647(2004).</li>
<li>Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+Adhesion+Mediated+by+Hibris+and+Roughest+Regulates+Morphogenesis+and+Patterning+in+the+Drosophila+Eye%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Preferential Adhesion Mediated by Hibris and Roughest Regulates Morphogenesis and Patterning in the Drosophila Eye.</a> Developmental Cell. 8 (6), 925-935 (2016).</li>
<li>Cordero, J. B., Larson, D. E., Craig, C. R., Hays, R., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Decapentaplegic+signaling+regulates+patterning+and+adhesion+in+the+Drosophila+pupal+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Dynamic Decapentaplegic signaling regulates patterning and adhesion in the Drosophila pupal retina.</a> Development (Cambridge, England). 134 (10), 1861-1871 (2007).</li>
<li>Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+behavior+in+the+developing+Drosophila+pupal+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+development%22%5BJournal%5D)">Cellular behavior in the developing Drosophila pupal retina.</a> Mechanisms of development. 125 (3-4), 223-232 (2008).</li>
<li>Martín-Bermudo, M. D., Bardet, P. L., Bellaïche, Y., Malartre, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vav+oncogene+antagonises+EGFR+signalling+and+regulates+adherens+junction+dynamics+during+Drosophila+eye+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The vav oncogene antagonises EGFR signalling and regulates adherens junction dynamics during Drosophila eye development.</a> Development. 142 (8), 1492-1501 (2015).</li>
<li>Chan, E. H., Chavadimane Shivakumar, P., Clément, R., Laugier, E., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+cortical+tension+mediated+by+N-cadherin+controls+cell+geometric+order+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Patterned cortical tension mediated by N-cadherin controls cell geometric order in the Drosophila eye.</a> eLife. 6, e22796(2017).</li>
<li>Lin, H. V., Rogulja, A., Cadigan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wingless+eliminates+ommatidia+from+the+edge+of+the+developing+eye+through+activation+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Wingless eliminates ommatidia from the edge of the developing eye through activation of apoptosis.</a> Development. 131 (10), 2409-2418 (2004).</li>
<li>Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+wingless+in+an+early+pupal+cell+death+event+that+contributes+to+patterning+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+development%22%5BJournal%5D)">A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye.</a> Mechanisms of development. 121 (12), 1523-1530 (2004).</li>
<li>Mendes, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c%E2%80%90d+regulates+developmental+apoptosis+in+the+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c‐d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina.</a> EMBO reports. 7 (9), 933-939 (2006).</li>
<li>Monserrate, J., Brachmann, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+death+zone%3A+a+spatially+restricted+region+for+programmed+cell+death+that+sculpts+the+fly+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye.</a> Cell Death & Differentiation. 14 (2), 209-217 (2007).</li>
<li>Bushnell, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JNK+is+antagonized+to+ensure+the+correct+number+of+interommatidial+cells+pattern+the+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">JNK is antagonized to ensure the correct number of interommatidial cells pattern the Drosophila retina.</a> Developmental Biology. 433 (1), 94-107 (2018).</li>
<li>Wolff, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+techniques+for+pupal+and+larval+Drosophila+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li>
<li>Hsiao, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+Immunohistochemistry+of+Larval%2C+Pupal+and+Adult+Drosophila+Retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4347(2012).</li>
<li>Tea, J. S., Cespedes, A., Dawson, D., Banerjee, U., Call, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+Mounting+of+Drosophila+Pupal+Eye+Discs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (93), e52315(2014).</li>
<li>Johnson, R. I., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Quantitative+Method+to+Analyze+Drosophila+Pupal+Eye+Patterning%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Quantitative Method to Analyze Drosophila Pupal Eye Patterning.</a> PLoS ONE. 4 (9), e7008(2009).</li>
<li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreenspan%2C+RJ+%22Fly+pushing+%3A+the+theory+and+practice+of+Drosophila+genetics%22">Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Ellis, M. C., O'Neill, E. M., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Drosophila+glass+protein+and+evidence+for+negative+regulation+of+its+activity+in+non-neuronal+cells+by+another+DNA-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression of Drosophila glass protein and evidence for negative regulation of its activity in non-neuronal cells by another DNA-binding protein.</a> Development. 119 (3), 855-865 (1993).</li>
<li>Duffy, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+system+in+drosophila%3A+A+fly+geneticist%27s+swiss+army+knife%5BTitle%5D)+AND+%22genesis%22%5BJournal%5D)">GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife.</a> genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li>
<li>Li, W. Z., Li, S. L., Zheng, H. Y., Zhang, S. P., Xue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broad+expression+profile+of+the+GMR-GAL4+driver+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Mol+Res%22%5BJournal%5D)">A broad expression profile of the GMR-GAL4 driver in Drosophila melanogaster.</a> Genet Mol Res. 11 (3), 1997-2002 (2012).</li>
<li>Song, Z., McCall, K., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCP-1%2C+a+Drosophila+Cell+Death+Protease+Essential+for+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DCP-1, a Drosophila Cell Death Protease Essential for Development.</a> Science. 275 (5299), 536-540 (1997).</li>
<li>Hay, B. A., Wassarman, D. A., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+homologs+of+baculovirus+inhibitor+of+apoptosis+proteins+function+to+block+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila homologs of baculovirus inhibitor of apoptosis proteins function to block cell death.</a> Cell. 83 (7), 1253-1262 (1995).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método de disección de ojo pupal de Drosophila aquí descrito permite el aislamiento de complejos de músculo-ojo-cerebro de 6 a 10 en 10 a 15 min. Sin embargo, paciencia y práctica son esenciales para dominar la técnica de disección y mejorar la calidad y velocidad de disecciones. Este tiempo breve disección asegura que cada ojo es aproximadamente la misma etapa de desarrollo, reducir la variabilidad en la expresión del fenotipo o gen de retinas en un conjunto de datos. Mientras protocolos alternativos pueden ...

La retina de Drosophila se compone de aproximadamente 750 ommatidia rodeada de pigmento las células dispuestas en panal enrejado1,2,3,4. Cada ommatidium contiene ocho neuronas fotorreceptoras, cuatro células secretoras de la lente de cono y dos células de pigmento primarias. Que rodean cada ommatidium son células productoras de pigmento de enrejado y los grupos de cerdas sensoriales. Debido a su naturaleza poste-mitotic y arreglo hexagonal estereotipada, la retina pupal de Drosophila proporciona un sistema modelo excelente para el estudio de los procesos morfogenéticos incluyendo células adherencia5,6, 7,8,9,10 y apoptosis11,12,13,14,15.
Varios protocolos publicados utilizan presión de aire a extraer complejos músculo-ojo-cerebro de Drosophila pupa16,17,18. El protocolo descrito aquí en su lugar utiliza instrumentos de microdisección para cuidadosamente y precisamente aislar complejos músculo-ojo-cerebro con el objetivo de obtener tejido retiniano intacto. Esto es crucial si retinas son para ser utilizados para morfológicos, proteína o expresión génica análisis ya que puede dañar a retinas estrés celular o incluso la muerte, que podría modificar la expresión del fenotipo o gene del celular. Además, después de la práctica, pueden aislarse complejos músculo-ojo-cerebro de 6 a 10 en 10 a 15 minutos, facilitando el objetivo de minimizar la variabilidad en la edad y etapa de desarrollo de tejido ocular disecada.
La fijación, inmunotinción y montaje de todo Protocolo se describe a continuación es conveniente para la preparación de ojos de Drosophila para microscopía fluorescente. Retinas pueden ser incubadas con anticuerpos contra proteínas de interés. Por ejemplo, anticuerpos contra componentes de ensambladura de los adherens puede ser utilizado para visualizar las circunferencias apicales de las células para poder características como tipo de la célula, forma y arreglo de los19. Antes de la fijación, ojos en su lugar pueden ser hendidos del cerebro con el fin de extracción de proteínas para análisis occidental o ARN para su uso en qRT-PCR o secuenciación del RNA.

<table><tbody><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td>Software de procesamiento de imágenes</td></tr><tr><td>Férulas de bambú, 6 "&nbsp;</td><td>Ted Pella Inc</td><td>116</td><td></td></tr><tr><td>Beta mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Beta-glicerol fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50020</td><td></td></tr><tr><td>Plato de disección negro Placa</td><td></td><td></td> de <td>Petri de vidrio llena hasta el borde con SYLG170 o SYLG184 (coloreado de negro con polvo de carbón finamente molido). Dejar a temperatura ambiente durante 24-48 h para polimerizar.</td></tr><tr><td>Portacuchillas</td><td>Fine Science Tools</td><td>10053</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, sin EDTA, inhibidor de la proteasa comprimidos Roche</td><td></td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal (Zeiss LSM 501)</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>o similar Microscopio</td></tr> de <tr><td>dietil pirocarbonato (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>40718</td><td></td></tr><tr><td>Cinta adhesiva de doble cara</td><td>3M</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila medios alimentarios, ricos en nutrientes&nbsp;</td><td></td><td></td><td>7,5% de sacarosa, 15% de glucosa, 2,5% de agar, 20% de levadura de cerveza, 5% de peptona, 0,125% de MgSO4,7H2O, 0,125% CaCl2.2H20</td></tr><tr><td>Drosophila medios alimentarios, receta estándar de</td><td></td><td></td><td>harina de maíz Bloomington Drosophila Stock Center.&nbsp; (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)</td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Solución</td><td></td><td></td> fijadora <td>formadehído al 4% en PBS, pH 7,4.</td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia (microscopio TCS SP5 DM)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>o microscopio similar</td></tr><tr><td>Pinzas&nbsp;</td>Las pinzas de <td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>deben afilarse con frecuencia.</td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Plato de vidrio de 9 pocillos&nbsp;</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td>También conocido como platos de 9 pocillos&nbsp;</td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio (22 x 22 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio de vidrio (25 x 75 x 1 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-413</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de vidrio</td><td>Corning</td><td>3160-100BO</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Software Image Studio versión 5.2.5</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>Software de procesamiento de imágenes para la cuantificación de Western blots.</td></tr><tr><td>Tampón de muestra Laemmli</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td>Tampón de muestra de proteína concentrada 2X, suplemento con beta mercaptoetanol según las instrucciones del fabricante.</td></tr><tr><td>Marcador de carril que reduce el búfer de muestras&nbsp;</td><td>Tampón de</td> muestra de proteína concentrada ThermoFisher <td>Scientific 39000</td><td>5X.</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrígula&nbsp;</td>Tijeras de microdisección <td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Bandejas de micropocillos (72 x 10 y micro; L pocillos)</td><td>Nunc</td><td>438733</td><td></td></tr><tr><td>Medios</td><td></td><td></td> de montaje <td>0,5% N-propilgalato y 80% glicerol en PBS</td></tr><tr><td>N-propilgalato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>PBS libre de nucleasas (PBS en 0,1% DEPC, pH 7,4)</td><td></td><td></td><td>Agregue el volumen adecuado de DEPC a PBS, mezcle bien e incube durante la noche a temperatura ambiente con agitación constante. Autoclave durante al menos 20 minutos. Tienda en 4&deg; C</td></tr><tr><td>PBS (solución salina tamponada con fosfato pH 7.4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368</td><td>Prepare de acuerdo con las instrucciones del fabricante</td></tr><tr><td>PBS+pi (PBS más inhibidores de proteasa y fosfatasa)</td><td></td><td></td><td>10 mM de NaF, 1 mM de fosfato de betaglicerol y 1 mM de Na3VO4 en PBS, pH 7.4.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>PBT</td><td></td><td></td><td>0,15% TritonX y 0,5% albúmina sérica bovina en PBS, pH 7,4</td></tr><tr><td>Soporte de alfiler</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo primario: cabra anti-GAPDH</td><td>Imgenex</td><td>IMG-3073</td><td>Para Western blot. Utilizado a 1:3000</td></tr><tr><td>Anticuerpo primario: conejo anti-escisión Dcp-1</td><td>Señalización celular</td><td>9578S</td><td>Para inmunofluorescencia. Utilizado a 1:100</td></tr><tr><td>Anticuerpo primario: rata anti-DEcad</td><td>Estudios del desarrollo Banco de hibridomas</td><td>DCAD2</td><td>Para inmunofluorescencia. Utilizado a 1:20</td></tr><tr><td>Anticuerpo primario: rata anti-DEcad</td><td>DOI: 10.1006/dbio.1994.1287</td><td>DCAD1</td><td>&nbsp; Regalo de Tadashi Uemura. Se utiliza a escala 1:100.</td></tr><tr><td>Kit de extracción de ARN: Relia Prep Kit de minipreparación de tejido de ARN&nbsp;</td><td>Promega</td><td>Z6110</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de descontaminación de rnasa (RNasa Away)</td><td>Molecular BioProducts</td><td>7002</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de bisturí</td><td>Fine Science Tools</td><td>10050</td><td>Rompa un pequeño trozo de hoja de escapala y asegúrelo en el soporte de la hoja.</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario: 488-conjugado&nbsp; burro anti-rata IgG (H + L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-545-153</td><td>para inmunofluorescencia. Utilizado a 1:200</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario: cy3 conjugado cabra anti-conejo IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-165-144</td><td>Para inmunofluorescencia. Utilizado a 1:100</td></tr><tr>Anticuerpo secundario: <td>Tecnología de señalización celular</td><td>7077</td><td>anti-rata anti-rata conjugada con HRP</td> <td>para Western blot. Utilizado a 1:3000</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario: IgG (H+L) anticabra de conejo conjugado con HRPJackson</td> <td>ImmunoResearch</td><td>305-035-003</td><td>Para Western blot. Utilizado en 1:3000</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215309</td><td></td></tr><tr><td>Vanadato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50860</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro (NanoDrop)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2000c&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico de disección (M60 o M80)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>o microscopio similar</td></tr><tr><td>Sylgard (negro)</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG170</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard (transparente)</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG184</td><td>Color negro con polvo de charcol finamente molido</td></tr><tr><td>Tejido:</td><td>Kimwipes KIMTECH</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>TritonX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de Trizma pH7.5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de tungsteno, fina</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-10</td><td>Inserto en el soporte de alfileres</td></tr><tr><td>Aguja de tungsteno, robusta</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-20</td><td>Inserto en el soporte de pasadores</td></tr><tr><td>WTLB (tampón de lisis de tejidos occidental)</td><td></td><td></td><td>150 mM de NaCl, 1,5 % de Triton X-100, 1 mM de EDTA, 20 % de glicerol, 10 mM de NaF, 1 mM de beta-glicerol de fosfato y 1 mM de Na3VO4 en 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5). Complementar con una mesa de cóctel de proteasas cOmplete por 10 ml de solución.</td></tr><tr><td>Pasta de levadura</td> <td>(supermercado local)</td><td></td><td>Aproximadamente 2 cucharadas de levadura ActiveDry de Fleischmann (o similar) disuelta en ~ 20 mL de H2O destilado</td></tr></tbody></table>

disección de la retina pupal de drosophila para inmunohistoquímica, western análisis y aislamiento de arn

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

La retina pupal de Drosophila proporciona un sistema modelo excelente para el estudio de procesos morfogenéticos durante el desarrollo. En este trabajo, presentamos un protocolo confiable para la disección de la delicada retina pupal de Drosophila . Nuestro abordaje utiliza herramientas fácilmente disponibles de microdisección para abrir pupas y precisamente extraer complejos músculo-ojo-cerebro. Estos pueden fijarse, objeto de immunohistochemistry y retinas entonces montados en portaobjetos de microscopio y reflejados si el objetivo es detectar estructuras celulares o subcelulares. Alternativamente, retinas interpretaciones pueden ser aislados del tejido cerebral, lisis en buffers de apropiada y utilizadas para que proteína gel electroforesis o mRNA extracción (evaluar la expresión de la proteína o gen, respectivamente). Paciencia y práctica significativa pueden ser necesario para dominar el protocolo de microdisección descrito, pero una vez dominado, el protocolo permite aislamiento relativamente rápida de retinas principalmente intactas.

El ojo de pupa es un tejido de fácil acceso que sirve como un excelente modelo para investigar procesos de desarrollo morfogénesis de la drive. Aquí, nosotros hemos diseccionado retinas y utiliza inmunofluorescencia para detectar las ensambladuras de los adherens apical (Figura 3A, C) o la caspasa Dcp-1 (figura 3D) que se activa durante la apoptosis (figura 3)25. Estos enfoques permiten obser...

Este artículo presenta un método quirúrgico para disección Drosophila pupas retinas junto con protocolos para el procesamiento del tejido para la extracción de RNA, inmunohistoquímica y análisis occidental.

Disección de la Retina Pupal de Drosophila para inmunohistoquímica, Western análisis y aislamiento de ARN

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Este protocolo es significativo porque este es un método eficiente para el aislamiento del tejido ocular pupal Drosophila para múltiples aplicaciones aguas abajo. La principal ventaja de esta técnica es que permite la rápida disección de un gran número de ojos pupales sin dañar el tejido. La disección de la retina pupal Drosophila será un reto para los principiantes.Practicar la técnica es la mejor manera de mejorar la velocidad de las disecciones y la calidad de los resultados. Después de colocar las pupas Drosophila en un plato de disección negro, coloque un pedazo fresco de cinta adhesiva de doble cara en el plato diseccionador, lejos de las pupas, y use un par de fórceps para colocar cuidadosamente el lado dorsal pupae hacia arriba en la cinta. Coloque el plato debajo de un microscopio estéreo y use fórceps para eliminar el opérculo de cada pupa.Utilice tijeras de microdisección para cortar cada caso de pupal, lo que permite que se abra la cabeza, el tórax y el segmento abdominal anterior, y asegure los bordes de la caja pupal a la cinta de doble cara. Perfora el abdomen de cada pupa con fórceps afilados, y retira la pupa de su estuche pupal. Coloque la pupa en el plato de dise

dissection-drosophila-pupal-retina-for-immunohistochemistry-western

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Preparación de desarrollo y de adultos Drosophila Los cerebros y retinas de imágenes en vivo

Solo Drosophila Omatidio disección e Imagen

Un enfoque estándar para preparar a los...

Preparación de los adultos Drosophila Ojos de seccionamiento fino y análisis microscópico

Drosophila pupa inmunohistoquímica Abdomen

La disección e inmunohistoquímica de larva, pupa y adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinas

Este video describe cómo diseccionar y aislar el complejo ojo-cerebro de las pupas de Drosophila. El protocolo presentado demuestra que el procedimiento produce tejido de alta calidad, compatible con, por ejemplo, la inmunotinción, así como otros experimentos de expresión génica.

Disección del complejo ojo-cerebro de pupas de mosca: un método para aislar el tejido de la retina

Las estructuras adultas de Drosophila se derivan de estructuras en forma de saco llamadas discos imaginales. El análisis de estos discos proporciona información sobre muchos procesos de desarrollo, incluida la determinación de tejidos, el establecimiento de límites de compartimentos, la proliferación celular, la especificación del destino celular y la polaridad celular plana. Este protocolo se utiliza para preparar discos imaginales para microscopía óptica/fluorescente.

La disección y la inmunotinción de imaginal discos de Drosophila melanogaster

El objetivo de esta técnica es permitir a los investigadores realizar la disección, inmunotinción y montaje de discos oculares de pupa de Drosophila melanogaster de cualquier edad.

Disección y montaje de<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal discos Eye

La capacidad para detectar con precisión las transcripciones o las proteínas en los tejidos de la Drosophila es fundamental para el estudio de su abundancia y localización relacionada con el proceso de desarrollo. Aquí está la descripción de un sencillo procedimiento para disecar alas pupas. Estas alas pueden utilizarse como muestras en diversas técnicas (análisis de PCR, immunohistochemistry, etc.).

Un método rápido y eficiente para disecar alas Pupal de Drosophila apto para Immunodetections o ensayos PCR

Este protocolo describe la disección y el immunostaining del adulto de Drosophila melanogaster los tejidos del cerebro. Específicamente, este protocolo destaca el uso de setas neuronas cuerpo y fotorreceptor Drosophila como subconjuntos neuronal de ejemplo que pueden utilizarse con precisión para descubrir principios generales subyacentes a muchos aspectos del desarrollo neuronal.

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Aquí, presentamos un protocolo para la etapa y diseccionar desarrollar tejido olfativo de especies de Drosophila . El tejido disecado más adelante puede ser utilizado para análisis moleculares como RT-PCR (reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa) o RNA, secuenciación (RNAseq), así como análisis en vivo como inmunohistoquímica o en situ hibridación.

Preparación de desarrollar tejido olfatorio periférico para Molecular y el análisis de Immunohistochemical en Drosophila

Aprende a disecar retinas pupales de Drosophila para inmunohistoquímica, análisis Western y extracción de ARN. Este método eficiente preserva la integridad tisular y permite múltiples aplicaciones posteriores en neurociencia y biología del desarrollo.

Disección de la Retina Pupal de Drosophila para inmunohistoquímica, Western análisis y aislamiento de ARN

Explorar más videos