Name: Medir estabilidad enzimática por calorimetría isoterma de titulación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprende a medir la estabilidad enzimática mediante calorimetría isoterma de titulación (ITC) en bioquímica. Este protocolo eficiente reduce el tiempo de análisis respecto a métodos tradicionales y permite evaluar modificaciones en enzimas industriales.

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1. preparación de muestras
<ol><li>
1.000 mL de tampón de acetato de sodio de 0.1 M a pH 4.6
	<ol>
<li>Medir 800 mL de agua destilada en un matraz aforado de 1.000 mL.</li>
		<li>Peso 8,2 g de acetato de sodio anhidro y añadir en el vaso.</li>
		<li>Coloque el vaso en una placa de agitación, colocar una varilla de agitación en el vaso, encienda la placa de agitación y revuelva hasta que se disuelva completamente.</li>
		<li>Cuando se haya disuelto completamente el acetato de sodio anhidro, medir el pH de la solución con un medidor de pH calibrado.</li>
		<li>Añadir 1 M HCl o NaOH por lo tanto para obtener el pH deseado de 4.6.</li>
		<li>Añadir agua destilada hasta el volumen total es de 1.000 mL.</li>
		<li>Almacenar a temperatura ambiente hasta su uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Solución de enzima
	<ol>
<li>Preparar 10 mL de la botella de solución dentro de la gama 10-30 mg/mL por primera medición 8 mL del 0,1 M sodio acetato buffer pH 4.6 de 15 mL graduado de enzima.</li>
		<li>Añadir la solución tampón en un tubo cónico de 15 mL con enzima y agite vigorosamente hasta que la enzima se haya disuelto.</li>
		<li>Agregue una solución búfer más hasta que el volumen total es de 10 mL.</li>
		<li>Almacenar la solución de enzima a 4 ° C hasta su uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Solución de sustrato
	<ol>
<li>Para preparar una solución de sustrato dentro de la gama de 300-600 mM, calcular la cantidad de sustrato necesario en gramos para hacer la concentración deseada.</li>
		<li>Pesar el sustrato y colocar en un vaso de precipitados de 100 mL vidrio</li>
		<li>Medir 20 mL de la solución tampón utilizando un cilindro aforado de 25 mL y añada en el vaso de vidrio.</li>
		<li>Coloque el vaso en una placa de agitación y coloque una varilla de agitación magnética en el vaso. Encender la calefacción y ajustar en consecuencia la velocidad de agitación.</li>
		<li>Permiten revolviendo para continuar hasta que el sustrato se haya disuelto.</li>
		<li>Verter la solución de sustrato en un tubo cónico de 50 mL y agregar 0.1 M sodio tampón de acetato pH 4.6 hasta el volumen total es de 45 mL. Mezclar por agitación.</li>
		<li>Almacenar la solución de sustrato a temperatura ambiente hasta su uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. realizar el experimento
<ol><li>Preparando el instrumento ITC<ol>
<li>Asegúrese de que la celda de referencia está cargada con 350 μl de agua destilada. Antes de cargar la enzima en la célula de la muestra, verificar que la celda de la muestra se haya limpiado.</li>
		<li>Limpieza de protocolo-llene la jeringa de carga con 500 μl de solución de limpieza de 2% (Tabla de materiales), Inserte cuidadosamente la aguja en la celda de muestra, llene la celda y Extraiga lentamente el líquido usando la misma jeringa. Deseche el líquido en un vaso de precipitados. Repita este paso dos veces con solución de limpieza de 2% (Tabla de materiales), tres veces con etanol al 70% y luego lavar diez veces con agua destilada.</li>
		<li>Llene la jeringa de carga con 450 μl de solución enzimática, cuidadosamente Inserte la aguja hasta el fondo de la celda de muestra y presionar el émbolo hasta la línea μl 100 lentamente para evitar la formación de burbujas de aire.</li>
		<li>Lavar la jeringa de titulación de 50 μL con agua destilada tres veces por colocar la punta de la aguja en el agua poco a poco tomando el agua en la jeringa, luego distribuye el agua en un recipiente de desechos.</li>
		<li>Eliminar el agua residual mediante enjuague con solución de sustrato tres veces.</li>
		<li>Llene la jeringa de titulación con solución de sustrato mediante la elaboración de la solución hasta que la jeringa está llena sin burbujas de aire.</li>
		<li>Con la jeringa en la solución de substrato, saque el émbolo y aproximadamente 2 μl de aire para entrar en la parte superior de la jeringa y vuelva a insertar el émbolo.</li>
		<li>Retire la manija de la bureta de la ITC, colocar la jeringa dentro del mango de la bureta y atornille hasta que quede apretado.</li>
		<li>Limpie la punta del agitador con una pelusa, luego cuidadosamente coloque el mango de la bureta en el instrumento ITC y trabarlo en su lugar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. configuración del ITCrun
<ol><li>En el equipo, Abra ITCrun y haga clic en configurar.</li>
	<li>Revolvimiento de velocidad , haga clic en y a 350 RPM. Compruebe el tamaño de la jeringa (μL) y asegurar que está en 50 μl.</li>
	<li>La temperatura y pulse Actualizar. Se recomienda que este paso sea realizado por lo menos 1 h antes de preparar la ITC. Esto permite suficiente tiempo para que el instrumento para calentar o enfriar según sea necesario.</li>
	<li>Para la configuración del experimento, seleccione valoración incremental.</li>
	<li>Haga clic en Insertar para las inyecciones. Ajustar el intervalo de inyección a 5.400 s, volumen de inyección (μL) 4 y el número de inyecciones a 4. Pulse OK para confirmar la configuración.</li>
	<li>En el cuadro equilibrado, seleccione Auto-equilibrar y grande espera que calienta. (Si los calores esperados son pequeños, uno puede seleccionar pequeños bajo calores esperados, sin embargo, esto aumentará el tiempo de equilibrado).</li>
	<li>Establezca la línea de base inicial a 300 s.</li>
	<li>Para iniciar la ejecución, haga clic en el iniciar símbolo junto a la velocidad de agitación y haga clic en iniciar que se encuentra al lado el símbolo de la llave.</li>
	<li>Guarde el archivo y que el instrumento a ejecutar.</li>
</ol>4. Análisis de datos
<ol><li>Abra el archivo en NanoAnalyze. Haga clic en datos y seleccionar columnas de datos.</li>
	<li>Seleccionar todos los datos, copiar y luego pegar los datos en Microsoft Excel.</li>
	<li>Ajuste cero basal añadiendo el valor deseado en el 300 s para que sea cero. Esta corrección se aplica a toda la columna de valores de índice de calor.</li>
	<li>Encontrar el valor mínimo o máximo de la tasa de calor para cada inyección mediante la ecuación: =MIN(cell:cell) o MAX(cell:cell). Cada punto de datos representa la actividad enzimática máxima de la enzima en cada inyección.</li>
	<li>Trazar gráficos de los valores de MIN o MAX contra el tiempo en que el valor se produjo durante la valoración.</li>
</ol>

<ol><li>Anastas, P., Eghbali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+chemistry%3A+principles+and+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Green chemistry: principles and practice.</a> Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).</li>
<li>Jin, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+Recombinant+Glucose+Isomerase+for+Efficient+Production+of+High+Fructose+Corn+Syrup%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biochemistry+Biotechnoiogy%22%5BJournal%5D)">Immobilization of Recombinant Glucose Isomerase for Efficient Production of High Fructose Corn Syrup.</a> Applied Biochemistry Biotechnoiogy. 183 (1), 293-306 (2017).</li>
<li>Budak, ŞÖ, Koçak, C., Bron, P. A., de Vries, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBudak%2C+%C5%9E%C3%96+%22Microbial+Cultures+and+Enzymes+Dairy+Technology%22">Microbial Cultures and Enzymes Dairy Technology</a>. , 182-203 (2018).</li>
<li>van Donkelaar, L. H. G., Mostert, J., Zisopoulos, F. K., Boom, R. M., van der Goot, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+enzymes+for+beer+brewing%3A+Thermodynamic+comparison+on+resource+use%5BTitle%5D)+AND+%22Energy%22%5BJournal%5D)">The use of enzymes for beer brewing: Thermodynamic comparison on resource use.</a> Energy. 115, 519-527 (2016).</li>
<li>Rodriguez-Colinas, B., Fernandez-Arrojo, L., Ballesteros, A. O., Plou, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galactooligosaccharides+formation+during+enzymatic+hydrolysis+of+lactose%3A+Towards+a+prebiotic-enriched+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Galactooligosaccharides formation during enzymatic hydrolysis of lactose: Towards a prebiotic-enriched milk.</a> Food Chemistry. 145, 388-394 (2014).</li>
<li>Lawrence, P. B., Price, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+PEGylation+influences+protein+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">How PEGylation influences protein conformational stability.</a> Current Opinions in Chemical Biology. 34, 88-94 (2016).</li>
<li>Bernal, C., Rodriguez, K., Martinez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+enzyme+immobilization+and+protein+engineering%3A+An+alternative+path+for+the+development+of+novel+and+improved+industrial+biocatalysts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Integrating enzyme immobilization and protein engineering: An alternative path for the development of novel and improved industrial biocatalysts.</a> Biotechnology Advances. 36 (5), 1470-1480 (2018).</li>
<li>Rigoldi, F., Donini, S., Redaelli, A., Parisini, E., Gautieri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Engineering+of+thermostable+enzymes+for+industrial+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Bioengeneering%22%5BJournal%5D)">Review: Engineering of thermostable enzymes for industrial applications.</a> Applied Bioengeneering. 2 (1), 011501(2018).</li>
<li>Johnson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+calorimetry+as+a+tool+for+protein+folding+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 531 (1), 100-109 (2013).</li>
<li>Chen, N. G., Gregory, K., Sun, Y., Golovlev, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+model+of+thermal+deactivation+of+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Transient model of thermal deactivation of enzymes.</a> Biochimica et biophysica acta. 1814 (10), 1318-1324 (2011).</li>
<li>Mason, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorimetric+Methods+for+Measuring+Stability+and+Reusability+of+Membrane+Immobilized+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Jounal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">Calorimetric Methods for Measuring Stability and Reusability of Membrane Immobilized Enzymes.</a> Jounal of Food Science. , (2017).</li>
<li>Leksmono, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Lactase+Enzymatic+Activity+in+the+Teaching+Lab%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab.</a> Journal of visualized experiments : Journal of Visual Experiments. (138), e54377(2018).</li>
</ol>

Una gran ventaja del análisis de estabilidad de enzima ITC descrito aquí es la automatización. Una vez todos los buffers adecuados y soluciones, el tiempo de cada ensayo es aproximadamente 15 minutos para la persona que realiza el ensayo. Por el contrario, los ensayos convencionales para la actividad de la invertasa y la lactasa requieren aproximadamente 2 horas con la participación continua de la persona que realiza el ensayo y muchos ensayos de actividad enzimática toman mucho más trabajo. En una publicación anterior, ...

Las enzimas son proteínas capaces de catalizar una amplia variedad de reacciones orgánicas. Función de más enzimas en solución acuosa a cerca de pH neutro, evitando el uso de solventes agresivos. Debido a su alta selectividad, enzima catalizado reacciones producen menos (en algunos casos ningunos subproductos) subproductos de catalizadores no selectivos tales como ácidos y bases1. Esto es especialmente relevante en la fabricación de alimentos en todas las reacciones químicas deben hacerse para que el producto final es seguro para el consumo humano. Actualmente, se utilizan enzimas para producir jarabe de maíz de alta fructosa2,3de queso, cerveza4, leche sin lactosa5y otros productos alimentarios importantes. Aunque este trabajo se centra en el uso de enzimas en la industria de alimentos, hay muchos otros usos para las enzimas incluidas en síntesis química y de la droga verde.
La utilidad de las enzimas es limitada por la estabilidad de la actividad enzimática, que depende del mantenimiento de la estructura tridimensional de la enzima. La estructura de la enzima puede ser estabilizada por modificaciones como pegilación6, inmovilización en un soporte sólido7modificaciones genéticas8y formulaciones. En la actualidad, estabilidad de la enzima por lo general se mide por calorimetría diferencial de barrido (DSC) y ensayos de actividad enzimática de extremo9. DSC mide la temperatura a la que se desarrolla una enzima; a mayor temperatura, más estable la estructura. Sin embargo, la pérdida de actividad ocurre a menudo en una temperatura más baja que se requiere para desplegar la enzima o dominios dentro de la enzima10. Por lo tanto, DSC no es suficiente para determinar si una modificación de la enzima aumenta la estabilidad de la actividad enzimática. Análisis de enzima de extremo son generalmente intensivos en el tiempo, requieren de múltiples muestras y suelen implican una reacción colorimétrica juntada que no es aplicable a soluciones muy coloreadas u opacas o suspensiones.
Este trabajo muestra un método para la medición directa de la estabilidad de la actividad enzimática por calorimetría isoterma de titulación (ITC). CCI mide la tasa de calor liberado o absorbido durante el curso de una reacción. Puesto que casi todas las reacciones producen o absorben calor, ITC puede utilizarse para la mayoría de las reacciones catalizadas por enzima, incluyen reacciones que no tienen una reacción acoplada o se producen en medios opacos como la leche. ITC se ha utilizado por muchas décadas para medir parámetros cinéticos químicos para muchos tipos de reacciones, pero el protocolo que presentamos se centra en el uso de TIC para medir la tasa máxima de calor de las reacciones enzima-catalizadas y demuestra que la actividad enzimática es linealmente correlacionada con la tasa máxima de calor. ITC las medidas de tasas de máximo calor en su mayoría son autónomas y requieren de muy poco tiempo personal para configurar y analizar.

<table><tbody><tr><td>a-Lactosa</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>desconocido (demasiado viejo)</td><td>500g</td></tr><tr><td>Acetato de Sodio, Anhidro 99% min</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13184-30</td><td>250g</td></tr><tr><td>Lactasa&nbsp;</td><td>MP Bio</td><td>100780</td><td>5g</td></tr><tr><td>Solución de ácido hidrocólico, 1N&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>SA48-500 Medidor de</td> sobremesa de <td>500 ml</td></tr><tr><td>- pH</td><td>VWR</td><td>89231-622</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP8231GAL</td><td></td></tr><tr><td>Micro-90 de</td> 1 galón <td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>NC024628</td><td>1L (solución de limpieza)</td></tr></tbody></table>

medir estabilidad enzimática por calorimetría isoterma de titulación

Measuring Enzymatic Stability by Isothermal Titration Calorimetry

Este trabajo demuestra un nuevo método para medir la estabilidad de la actividad enzimática por calorimetría isoterma de titulación (ITC). La tasa pico de calor observada después de una sola inyección de la solución sustrato en una solución de enzima se correlaciona con la actividad enzimática. Múltiples inyecciones de sustrato en la misma solución de enzima con el tiempo muestran la pérdida de actividad enzimática. El ensayo tiene carácter autónomo, que requiere muy poco tiempo de personal y es aplicable a la mayoría de los medios de comunicación y las enzimas.

Los resultados representativos figura 1 y figura 5 muestran los datos de dos enzimas, lactasa e invertasa. Lactasa e invertasa catalizan la hidrólisis de un disacárido en dos monosacáridos, endothermically y exotérmico, respectivamente. Ambas reacciones enzimáticas fueron funcionadas en concentraciones que impiden la saturación de la enzima.
Los datos de lactasa demuestran cómo datos ITC pueden utilizarse para estimar la estabilidad d...

La estabilidad térmica de la actividad enzimática se mide fácilmente por calorimetría isoterma de titulación (ITC). Ensayos de estabilidad de la proteína la mayoría actualmente utilizan medir proteína despliegue, pero no proporcionan información sobre la actividad enzimática. CCI permite la determinación directa del efecto de las modificaciones de la enzima sobre la estabilidad de la actividad enzimática.

Medir estabilidad enzimática por calorimetría isoterma de titulación

This work demonstrates a new method for measuring the stability of enzyme activity by isothermal titration calorimetry (ITC). The peak heat rate observed ...

El uso de enzimas como catalizadores en las reacciones puede reducir la cantidad de energía necesaria para la reacción y reducir los subproductos tóxicos. Sin embargo, el uso de enzimas en la industria es limitado, porque las enzimas no son estables y pueden ser costosas. Este protocolo podría reducir la cantidad de tiempo que se tarda en determinar si las condiciones son perjudiciales para la actividad enzimática, o si las modificaciones a la enzima han aumentado su estabilidad.La principal ventaja de esta técnica es que requiere menos horas de hombre que los ensayos tradicionales de estabilidad enzimática. Además, este protocolo se puede utilizar con una amplia gama de enzimas porque se puede utilizar con cualquier reacción que libere o absorba el calor. Para comenzar, prepare 0.1 tampón de acetato de sodio molar.Mida 800 mililitros de agua destilada en un vaso de precipitados graduado de 1.000 mililitros. Luego, pesa 8,2 gramos de acetato de sodio anhidro, y agréguelo al vaso de precipitados. Coloque el vaso de precipitados en un plato de agitación.Coloque una varilla de agitación en el vaso de precipitados y encienda la placa de agitación para agitar hasta que se disuelva por completo. Cuando el acetato de sodio anhidro esté completamente disuelto, utilice un medidor de pH calibrado para medir el pH de la solución. Utilice una pipeta para añadir 1 molar de ácido clorhídrico o hidróxido de sodio en consecuencia para obtener el pH deseado a 4.6.Agregue agua destilada en el vaso de precipitados hasta que el volumen total alcance los 1.000 mililitros. Para preparar la solución enzimática, en un cilindro graduado de 15 mililitros, mida 8 mililitros del tampón de acetato de sodio molar 0.1. A continuación, agregue la solución tampón en un tubo cónico de 15 mililitros con enzima, y agite vigorosamente hasta que la enzima se haya disuelto.Agregue más solución de búfer hasta que el volumen total alcance los 10 mililitros. Conservar la solución enzimática a 4 grados centígrados hasta su uso. Para preparar la solución de sustrato, pesar el sustrato, y colocarlo en un vaso de vidrio de 100 mililitros.Utilice un cilindro graduado para medir 20 mililitros de la solución tampón y, a continuación, agréguelo al vaso de precipitados de vidrio. Coloque el vaso de precipitados en una placa de agitación y coloque una varilla de agitación magnética en el vaso de precipitados. Encienda el fuego y ajuste la velocidad de agitación en consecuencia.Deje que la agitación continúe hasta que el sustrato se haya disuelto. Vierta la solución de sustrato en un tubo cónico de 15 mililitros y agregue el tampón de acetato de sodio previamente preparado, hasta que el volumen total sea de 45 mililitros. Agitar el tubo para mezclar.Conservar la solución del sustrato a temperatura ambiente hasta su uso. En el equipo, abra Ejecución de ITC y haga clic en Configuración. Haga clic en la velocidad de agitación y ajuste a 350 rpm.Compruebe que el tamaño de la jeringa es de 50 microlitros. Ajuste la temperatura a 55 grados centígrados y pulse Actualizar. Espere al menos una hora antes de continuar, para dar tiempo suficiente para que el instrumento ITC se caliente o se enfríe según sea necesario.Antes de cargar la enzima, asegúrese de que la célula de referencia esté cargada con 350 microlitros de agua destilada. Para limpiar la celda de muestra, llene la jeringa de carga con 500 microlitros de 2 por ciento de solución de limpieza. Inserte cuidadosamente la aguja en la celda de la muestra, llene la célula y retire lentamente el líquido con la misma jeringa.Deseche el líquido en un vaso de precipitados. Repita este paso dos veces con una solución de limpieza del 2 por ciento, tres veces con 70 por ciento de etanol, y luego lave diez veces con agua destilada. Una vez limpiada la célula de la muestra, llene la jeringa de carga con 450 microlitros de solución enzimática.Inserte cuidadosamente la aguja hasta la parte inferior de la celda de la muestra y presione lentamente el émbolo hasta la línea de 100 microlitros para evitar la formación de burbujas de aire. A continuación, lave la jeringa de valoración de 50 microlitros con agua destilada tres veces colocando la punta de la aguja en el agua para recoger lentamente el agua en la jeringa y, a continuación, dispensar el agua en un recipiente de desecho. Enjuague con la solución de sustrato tres veces para eliminar el agua residual.Después de eso, llene la jeringa de valoración con solución de sustrato extrayendo la solución hasta que la jeringa esté llena sin burbujas de aire. Con la jeringa todavía en la solución de sustrato, retire el émbolo y permita que aproximadamente 2 microlitros de aire entren en la parte superior de la jeringa, y vuelva a insertar el émbolo. Retire la manija de la bureta del ITC, coloque la jeringa dentro de la manija de la bureta y atornille hasta que esté bien.Limpie la punta de la jeringa de valoración con un tejido libre de pelusas y, a continuación, coloque cuidadosamente el mango de la bureta en el instrumento ITC y ciérralo en su lugar. Para la configuración del experimento, seleccione la valoración incremental. Haga clic en insertar para configurar las inyecciones.Ajuste el intervalo de inyección a 5.400 segundos, el volumen de inyección a 4 microlitros y el número de inyecciones a cuatro. Pulse OK para confirmar la configuración. En el cuadro de equilibrio, seleccione auto equilibrado y grandes calores esperados.Establezca la línea base inicial en 300 segundos. Para iniciar la ejecución, haga clic en el símbolo de inicio situado junto a la tasa de agitación y, a continuación, haga clic en Inicio, que se encuentra junto al símbolo de llave inglesa. Guarde el archivo y permita que el instrumento se ejecute.Para analizar datos, abra el archivo en Nano Analyze. Haga clic en datos y seleccione columnas de datos. Seleccione todos los datos, copie y pegue los datos en Microsoft Excel.Ajuste 0 línea base agregando el valor requerido en 300 segundos para que sea 0. Aplique esta corrección a toda la columna de valores de tasa de calor. A continuación, trazar gráficos de los valores mínimo o máximo con respecto al momento en que se produjo el valor durante la valoración.En este protocolo, los rastros de datos ITC de la actividad de lactasa se muestran con cuatro inyecciones secuenciales de lactosa en una solución de lactasa en un tampón de pH 4.6 a 55 grados centígrados, 45 grados centígrados, 35 grados centígrados y 25 grados centígrados. Se realizó un control sin enzimas a 55 grados centígrados para el calor de la mezcla. Para cada inyección de enzima, hay un calor exotérmico inicial de mezcla, y posteriormente, la hidrólisis endotérmica catalizada de lactasa de lactosa se produce hasta que se completa la reacción, y la tasa de calor vuelve a la línea de base.El mínimo pico endotérmico después de cada inyección, es un poco menor que la inyección anterior debido a la disminución de la actividad enzimática. Como era de esperar, la estabilidad enzimática para cada inyección disminuye con el aumento de la temperatura. El experimento de control muestra que la actividad de lactasa a 25 grados celsius tuvo una disminución del 8 por ciento en la actividad enzimática, debido a la dilución después de cuatro inyecciones.Teniendo en cuenta que la cuarta inyección muestra una disminución del 73 por ciento en el ensayo, la pérdida real de actividad enzimática fue por lo tanto del 65 por ciento. Por lo tanto, la dilución de la lactasa resultó de cada inyección, tuvo un efecto relativamente pequeño de 11 por ciento en la actividad enzimática. Es importante que el tampón utilizado para hacer las soluciones de enzimas y sustratos se empate lo más cerca posible.La falta de pH o concentración puede resultar en un mayor calor de mezcla que puede enmascarar el calor de reacción. Puede aplicar este protocolo para estudiar las enzimas y determinar su estabilidad midiendo la tasa de calor liberado o absorbido durante el curso de una reacción.

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La medición de los flujos de nutrientes y tóxicos en planta es esencial para el estudio de la nutrición y toxicidad de las plantas. Aquí, cubrimos los protocolos de radiotrazadores para la determinación de la afluencia y el eflujo en raíces de plantas intactas, utilizando flujos de potasio (K+) y amoníaco/amonio (NH3/NH4+) como ejemplos. Se discuten las ventajas y limitaciones de tales técnicas.

Flujos de nutrientes minerales y sustancias tóxicas de medición en plantas con Trazadores Radiactivos

Aprende a medir la estabilidad enzimática mediante calorimetría isoterma de titulación (ITC) en bioquímica. Este protocolo eficiente reduce el tiempo de análisis respecto a métodos tradicionales y permite evaluar modificaciones en enzimas industriales.

Medir estabilidad enzimática por calorimetría isoterma de titulación

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