Estudio sobre el metabolismo de seis insecticidas sistémicos en un cultivo de suspensión celular recién establecido derivado del té (Camellia Sinensis L.) Hojas

El té es una de las bebidas más populares en todo el mundo. Los pesticidas se utilizan a veces para proteger las plantas de té de las plagas. Algunos pesticidas sistémicos pueden ser hechos para esto por enzimas en el árbol del té.

Y luego se integró a través de la oxidación, hidrólisis, o reacciones de reducción. Los cultivos de suspensión de células vegetales se pueden utilizar como un, fácilmente para estudiar el comportamiento del metabolismo vegetal de los pesticidas. Este método tiene varias ventajas.

En primer lugar, puede funcionar en condiciones de microorganismos libres, evitando así la interferencia de la degradación de los plaguicidas causada por los microbios. En segundo lugar, puede proporcionar material constante para nosotros en cualquier momento. Por último, también se puede utilizar fácilmente para comparar teorías del comportamiento de pesticidas en un solo experimento.

En este estudio, establecemos cultivos de suspensión de células de té a partir de colores variables de hojas de té. El estado óptimo de cultivos de las suspensiones celulares se utilizó entonces para comparar el comportamiento de disipación de seis pesticidas. Este experimento será llevado a cabo por Jiao Weiting y Ge Guoqin.

Esta es nuestras plantas estériles de té que funciona como la fuente de explant. Corte a lo largo del ala media de una hoja estéril usando tijeras. Y luego, subdividir cada mitad en trozos pequeños de aproximadamente 0,3 veces 0,3 centímetros en un plato de Petri.

Coloque los explantes estériles en un medio visual de la MS que contenga 2, 4-D y KT. Se pueden colocar seis explantas en un matraz de 300 mililitros. Cultivo de la hoja explanta a una temperatura constante de 25 grados Celsius en la oscuridad. Después de 28 días, seleccione la primera generación de callos inducidos y luego transfiera a matraz nuevo.

Adquirir el callo suelto y variable después de tres a cuatro subculturas. Cortar los grandes, callos variables y sueltos del medio sólido en trozos pequeños utilizando una cuchilla quirúrgica estéril en condiciones estériles. Somos unos tres gramos de los pequeños pedazos de un callo.

Coloque el callo en B5 que contiene 2, 4-D y el KT. Cultivo de la suspensión de células líquidas a una temperatura constante en la incubadora de agitación en la oscuridad. Después de siete a diez días de cultivo, retire el matraz de cultivo y déjelos reposar durante unos minutos. Tome el sobrenadante como sedimento aquí obligará el cultivo a un medio fresco.

Retire los callos grandes precipitados. Obtenga el cultivo final de suspensión celular bien cuidado después de cuatro a tres ciclos de subcultura de 28 días cada uno. Mantenga una muestra de células vivas a cien grados centígrados durante diez minutos como célula de control antes de la tinción de viabilidad.

Centrifugar todo el cultivo de suspensión celular durante ocho minutos a 6.000 G.Retire el sobrenadante antes de suspender las células en 5 mililitros de tampón PBS y agítelo durante un minuto a mano. Añadir 2,5 mililitros de la solución TTC y agitar a mano de nuevo. Incubar la mezcla durante una hora en una incubadora de pie a 13 grados centígrados.

Añadir una alícuota de cuatrocientos microlitros a la vista para esterilizar la solución de cada neonicotinoides tiametoxam, acetimoprid, imidacloprid e imideproxasa. Todo a la primera fase orgánica. Dimetoato y omethoato en los cultivos de suspensión celular respectivamente.

Muestras de cultivo de suspensiones celulares con insecticidas a temperatura constante y velocidad de incubadora temblorosa. Tome las muestras en días diferentes. Para probar la muestra que contiene un neonicotinoide, retire una alícuota de 1 mililitro del cultivo celular homogéneo.

Colóquelo en un tubo centrífugo de plástico de 1,5 mililitros y centrifugarlo a 4.000 G durante dos minutos. Pasar el sobrenadante a través de una membrana de filtro de 0,22 micrómetros antes del análisis por HPLC-UV y UPLC QTOF. Para probar la muestra, continúe en la primera fase orgánica.

Retire una alícuota de 500 microlitios del cultivo celular y colóquela en un tubo centrífugo de 35 mililitros o un tubo de centrífuga de plástico de 1,5 mililitros. Añadir 0,1 gramos de cloruro de sodio y cinco mililitros extraer disolvente en el tubo centrífugo de 35 mililitros de las 500 muestras de microlitro. Vórtice la mezcla durante un minuto.

Y luego dejar que descansen durante 10 minutos. Tome 2,5 mililitros de sobrenadante en un tubo de vidrio de 10 mililitros y evapore a casi sequedad utilizando un evaporador de nitrógeno a 14 grados centígrados. Disolver el residuo con una acetona mililitro.

Vórtice durante un minuto, pasarlo a través de una membrana de filtro de 0,22 micrómetros antes del análisis por GC-FPD. Ponga cinco plantas en macetas de plástico de cuatro litros durante quince días. Añadir cero microgramos por mililitro o 100 microgramos por mililitro de tiametoxam o dimetoaxe en macetas de plástico, respectivamente.

Preparar la muestra de planta intacta de acuerdo con el método anterior, excepto para el pre-remojo y luego analizar por espectrometría de masas Orbitrap. Utilice un HPLCUV para detectar el contenido y los productos metabólicos del tiametoxam y el acetimoprid a longitudes de onda de 254 nanómetros, y de imidacloprid e imidaproxasa a 270 nanómetros. Detectar el contenido de dimetoato y omethoato por GC-FPD utilizando una columna tubular.

Detectar los metabolitos de insecticidas en el cultivo celular utilizando el UPRC QTOF con una columna Carbono-18. Detectar los metabolitos de insecticidas en el extracto de la planta de ensayo utilizando espectrometría de masas UPLC Orbitrap. El callo de una planta estéril tiene menor contaminación marrón pero mayor inductividad que la del callo de las hojas de té recogidos.

El callo derivado de hojas estériles siempre era de color amarillento brillante, mientras que el callo derivado de hojas recogidas era blanco con manchas marrones. Cuando la concentración de KT fue de 0,1 miligramos por litro, el callo era de color amarillento y de textura suelta. La tasa de crecimiento del callo fue la más alta, hasta 61.5%cuando la concentración de 2, 4-D fue de un miligramo por litro con la concentración de KT fue de 0,5 miligramos por litro.

Los datos de crecimiento de callo fueron los mejores y la tasa de crecimiento del callo fue la más alta alcanzó 46.9%Por lo tanto, la mejor combinación de homent de la planta fue un miligramo por litro de 2, 4-D y 0,1 miligramos por litro de KT para el crecimiento del callo del té. El callo cubrió completamente las hojas por la cuarta subcultura, y cuando el ciclo de la subcultura era de 28 días. El callo había crecido vigorosamente con color amarillento y textura suelta y sin dorar.

Después de comparar los datos brutos del callo y el color de la suspensión celular, el medio líquido B5 era más adecuado para el cultivo de suspensión celular. El valor OD del cultivo de suspensión celular se utilizó para representar la cantidad de crecimiento celular. Durante los 75 días de cultivo, la proporción de 15 gramos por mililitro tenía un valor de OD significativamente mayor que el de las otras dos proporciones.

La viabilidad celular dentro del cultivo de suspensión de la célula de té se probó mediante tinción TTC. El compuesto TTC incoloro se puede convertir en formadin rojo por deshidrogenasa en las mitocondrias de las células vivas, pero el color no se puede cambiar en las células muertas. Y este es todo el proceso de establecer un cultivo de suspensión de células de té.

Este es el primer estudio comparativo del metabolismo de diferentes pesticidas en el té utilizando una técnica de cultivo de suspensión celular. Se identificaron varios metabolitos de plaguicidas, y algunos de ellos fueron investigados en plantas de té mantenidas. Este nuevo método podría servir como modelo para estudios metabólicos de pesticidas en té u otras plantas.