Name: Formación material de la araña recombinante sedas a través de la Solvación acuosa utilizando calor y presión (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Aprende a solubilizar sedas de araña recombinantes en agua mediante calor y presión para producir hidrogeles, películas y fibras. Este método eficiente preserva las propiedades del material sin disolventes orgánicos.

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Los autores le gustaría agradecer con gratitud la financiación de la iniciativa de investigación científica y tecnológica de Utah (USTAR).

1. preparación de la mezcla de seda de araña recombinante de las existencias de proteína liofilizada
<ol><li>Determine la formulación y el volumen necesarios para las formaciones de material previstas. Las formulaciones típicas oscilan entre el 3% (p/v) y el 15% (p/v). Con esta selección, calcule el rSSp, las concentraciones y las proporciones correspondientes.<ol>
<li>Utilice las siguientes formulaciones respectivas para preparar cada material descrito en este protocolo: hidrogeles/esponjas/liogeles, 6% (p/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; Films/revestimientos, 5% (p/v) 80:20 MaSp1: MaSp2; adhesivos, 12% (p/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; fibras, 12,5% (p/v) 80:20 MaSp1: MaSp2. Nota: a pesar de que la mayoría de las formulaciones están mejor equipadas para formas y materiales específicos, hay una amplia gama de formulaciones que a menudo pueden superponerse. Además, los materiales de rSSp finales también se pueden adaptar durante la formación y el procesamiento para producir las propiedades deseadas. En general, cada proteína requerirá la investigación de los parámetros apropiados o útiles.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seleccione un vial limpio y nuevo de 8 mL de cultivo de vidrio de borosilicato con un tapón de rosca revestido de caucho.</li>
	<li>Retire la tapa y coloque el vial vacío en un balance analítico. TARE la masa del vial vacío para que la balanza Lea la masa cero.</li>
	<li>Agregue el polvo de rSSp liofilizado deseado al vial vacío para cada material específico.<ol>
<li>Utilizar estas masas específicas de cada tipo de proteína para cada material, al preparar un 2 mL de solución: hidrogeles/esponjas/liogeles, 60 mg de MaSp1 y 60 mg de MaSp2; Films/recubrimientos, 80 mg de MaSp1 y 20 mg de MaSp2; adhesivos, 120 mg de MaSp1 y 120 mg de MaSp2; fibras, 200 mg de MaSp1 y 50 mg de MaSp2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir la cantidad deseada de agua ultrapura, al menos 2 mL, al vial que ya contiene los polvos de rSSp ponderados. Nota: se recomienda un volumen mínimo de 2 mL para todos los procedimientos de solvación.</li>
	<li>Selle la tapa del vial y vórtice rápidamente el contenido para crear una mezcla de rSSp dispersa y homogénea que ahora está lista para el procedimiento de solvación. Se pueden emplear enfoques adicionales de homogeneización como la mezcla de sonicación o impulsor, o, además, la mezcla de vórtice.</li>
</ol>2. solvatación de seda de araña recombinante
PRECAUCIÓN: durante el procedimiento de solvación se generan elevadas presiones y calores. Para este proceso se requieren equipos de protección personal adecuados, especialmente gafas, mangas largas y guantes resistentes al calor.
<ol><li>Realizar una comprobación final del vial, o recipiente, tapón para asegurarse de que se ha apretado firmemente y con seguridad. A continuación, transfiera la mezcla de rSSp suspendida a un horno microondas convencional. Nota: las unidades de microondas dentro del rango de potencia de 700 a 1.500 vatios, que poseen capacidades de cámara interna más pequeñas, y plataformas giratorias se recomiendan para proporcionar mejores condiciones de solvación.</li>
	<li>Iniciar el funcionamiento del microondas con 5 s ráfagas a plena potencia. Después de cada ráfaga, abrir brevemente la puerta y mezclar/girar cuidadosamente el vial para evitar la sedimentación y mantener la mezcla suspendida.</li>
	<li>Repetir este proceso de microondas hasta que la mezcla y/o solución haya obtenido una temperatura de al menos 130 ° c, cuando se mida con un termómetro infrarrojo directamente contra la solución que contiene porciones del vial. Repita este proceso hasta que todas las partículas sólidas se hayan disuelto por completo y ya no sean visibles. Nota: se sugiere permitir que el vial y la solución se enfríen ocasionalmente, especialmente si la formulación tiene una alta concentración de rSSp presente. Las temperaturas superiores a 200 ° c aumentan el riesgo de fallo del sello vial. También se debe prestar especial atención para evitar que la mezcla/solución sobrecalentada toque el sello, lo que también resultará en un fallo de contención del vial.</li>
	<li>Después de resolver con éxito la mezcla de rSSp en una solución, permita que la temperatura de la solución y el tapón del vial se enfríe por debajo de 100 ° c (punto de ebullición) antes de abrir.</li>
</ol>3. los hidrogeles
<ol><li>Prepare un hidrogel de la solución después de sacarlo del microondas y dejar que se enfríe y se ajuste. Convierte el hidrogel en geometrías específicas antes de que se enfríe completamente. Nota: diferentes rSSps requerirá una cantidad variada de veces para la transición a un hidrogel. Por ejemplo, las secuencias de tipo MaSp2 tienden a formar hidrogeles más rápidamente en comparación con secuencias de tipo MaSp1. Las concentraciones de proteínas, la salinidad y el pH también afectan directamente a la tasa de transición a un hidrogel.</li>
</ol>4. las esponjas
<ol><li>Prepare una esponjas de rssp primero permitiendo que la solución primaria solvatadas forme un hidrogel.</li>
	<li>Coloque el hidrogel en un baño de agua, coloque este baño en el congelador a-20 ° c y espere hasta que el baño se congele por completo.</li>
	<li>Complete el proceso de formación de esponja quitando el hidrogel congelado y el baño de agua del congelador y descongelando a 25 ° c. La esponja resultante ahora se puede quitar del agua descongelada.</li>
</ol>5. lyogel
<ol><li>Prepare un lyogel rSSp congelando directamente un hidrogel formado, ya sea con o sin baño de agua, y transfiriendo la muestra de hidrogel congelado a un liofilizador (secador de congelación).</li>
	<li>Retire el material de gel liofilizado final del recipiente en el que se produjo la sublimación de humedad.</li>
</ol>6. las películas y revestimientos
<ol><li>Utilice uno de los tres métodos siguientes: fundición de soluciones, pulverización de soluciones o recubrimiento por inmersión para producir películas o recubrimientos de rSSp.<ol>
<li>Convertir la solución de seda solubilizada en/sobre las formas PDMS de la forma deseada.</li>
		<li>Vierta y extienda 200 μL de la solución de película y deje secar esto antes de pelarlos del sustrato de PDMS para su análisis o tratamiento.</li>
		<li>Después de permitir que se sequen, retire las películas formadas para las pruebas mecánicas o post-tratamiento de las películas para mejorar las propiedades mecánicas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para preparar un recubrimiento o una película que no se pueda extraer del sustrato, utilice el recubrimiento por pulverización o por inmersión para producir una capa de película delgada. Nota: para pulverizar el abrigo, este protocolo ha encontrado el éxito con un pulverizador de pintura modelo maestro aerógrafo.<ol>
<li>Forme un recubrimiento de inmersión simplemente sumergiendo el sustrato de elección en el rSSp solubilizado y repita después del secado para lograr el espesor deseado.</li>
		<li>Realice una capa de pulverización inicial antes de aplicar una capa de inmersión para aumentar la consistencia y la efectividad del recubrimiento final.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. adhesivos
Nota: la formación de adhesivos se logra a través de uno de los siguientes métodos.
<ol><li>Agregue directamente el rSSp solubilizado sobre un sustrato y luego aplique un segundo sustrato sobre la parte superior de la solución. Sujete firmemente las piezas juntas y seque las muestras en un horno con una temperatura mínima de 25 ° c durante al menos 16 h.</li>
	<li>Alternativamente, pulverizar las dos superficies de sustrato con una capa de pulverización y luego sujetar los sustratos juntos.</li>
	<li>La aplicación del rSSp a través del método dip de recubrimiento de los sustratos y pegado de los sustratos también se puede utilizar para preparar y adhesivo.</li>
</ol>8. fibras Wet-hiladas
<ol><li>Cargue la solución de droga solubilizada en una jeringa concéntrica con punta Luer-Lok a través de una aguja deslizante de 19 G. Expulse las burbujas de aire y deje que la droga se siente en el extremo Luer-Lok de la jeringa.</li>
	<li>Inserte al menos 25 mm de tubo PEEK, diámetro interno 0,01 pulgadas, en los accesorios de una sola pieza de la tubería PEEK para el dedo apretado para 1/16 pulgadas OD y 10/32 cono. Conecte este accesorio a un tubo PEEK al adaptador hembra Luer-Lok.<ol>
<li>Sustituya la aguja calibre 19 por esta configurada en la jeringa cargada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Llene un baño de vidrio alto y claro con un 99% de isopropanol puro para usar en el baño de coagulación.<ol>
<li>Llene los baños elásticos, situados debajo de los godets de estiramiento. Estos tendrán 80:20 isopropanol: agua destilada en el primer baño elástico, y 20:80 isopropanol: agua destilada en el segundo baño elástico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajuste el sistema de estiramiento godet de tal manera que el primer godet después del baño de coagulación y el primer godet en el primer baño elástico giran a la misma velocidad.<ol>
<li>Inicie el primer tramo ajustando las velocidades de la godet final en el baño elástico 1, el godet superior medio, y el primer godet en el baño elástico 2 a la misma velocidad. Esta velocidad será 2x tan rápido como la velocidad inicial de eliminación de fibra.</li>
		<li>Inicie el segundo tramo ajustando las velocidades de la godet final en el baño elástico 2, el último godet superior y el bobinador a la misma velocidad. Esta velocidad será 2x tan rápido como la velocidad utilizada para el primer tramo o 4x la velocidad inicial de eliminación de fibras.</li>
		<li>Coloque los guantes de nitrilo en el exterior de los godets intermedios para evitar que la fibra resbale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Empiece a extruir lentamente la solución en el baño de coagulación. En un sistema automatizado, establezca la velocidad de extrusión para que coincida con un retiro de 10 mm/s.<ol>
<li>Permita que la extrusión de fibra se convierta en uniforme antes de sacar las fibras del baño usando un gancho o fórceps finos de metal. Verifique la eliminación de la fibra del baño creado un lazo entre la punta de la tubería PEEK y la ruta de la fibra dejando el baño el baño.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Guiar la fibra recuperada a través de la serie de godets tal que la fibra se sumerge en los baños elásticos, pero secar en el aire entre los baños elásticos y antes de entrar en un carrete. Este secado se logra mediante los godetos intermedios colocados más altos. Nota: la tasa de eliminación de fibra y/o la tasa de extrusión tendrá que ser ajustada en base a la concentración de proteína, aditivos, y el tipo de proteína para permitir un amplio tiempo de coagulación sin unir las fibras en la parte inferior del baño de coagulación.</li>
	<li>Conecte la fibra completamente estirada al carrete en el mecanismo de bobinador utilizando cinta adhesiva.</li>
</ol>

<ol><li>Huemmerich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Structure+Elements+of+Spider+Dragline+Silks+and+Their+Contribution+to+Protein+Solubility%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Primary Structure Elements of Spider Dragline Silks and Their Contribution to Protein Solubility.</a> Biochemistry. 43 (42), 13604-13612 (2004).</li>
<li>Schacht, K., Scheibel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+Hydrogel+Formation+of+a+Recombinant+Spider+Silk+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Controlled Hydrogel Formation of a Recombinant Spider Silk Protein.</a> Biomacromolecules. 12 (7), 2488-2495 (2011).</li>
<li>Jones, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+Than+Just+Fibers%3A+An+Aqueous+Method+for+the+Production+of+Innovative+Recombinant+Spider+Silk+Protein+Materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">More Than Just Fibers: An Aqueous Method for the Production of Innovative Recombinant Spider Silk Protein Materials.</a> Biomacromolecules. 16 (4), 1418-1425 (2015).</li>
<li>Tucker, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+and+Physical+Properties+of+Recombinant+Spider+Silk+Films+Using+Organic+and+Aqueous+Solvents%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Mechanical and Physical Properties of Recombinant Spider Silk Films Using Organic and Aqueous Solvents.</a> Biomacromolecules. 15 (8), 3158-3170 (2014).</li>
<li>Harris, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sticky+Situation%3A+An+Investigation+of+Robust+Aqueous-Based+Recombinant+Spider+Silk+Protein+Coatings+and+Adhesives%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">A Sticky Situation: An Investigation of Robust Aqueous-Based Recombinant Spider Silk Protein Coatings and Adhesives.</a> Biomacromolecules. 17 (11), 3761-3772 (2016).</li>
<li>Jones, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+Heat+and+Pressure+for+Solubilization+of+Recombinant+Spider+Silk+Proteins+in+Aqueous+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Importance of Heat and Pressure for Solubilization of Recombinant Spider Silk Proteins in Aqueous Solution.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (11), 1955(2016).</li>
<li>Copeland, C. G., Bell, B. E., Christensen, C. D., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Process+for+the+Spinning+of+Synthetic+Spider+Silk%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Development of a Process for the Spinning of Synthetic Spider Silk.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 1 (7), 557-584 (2015).</li>
<li>Arcidiacono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+Processing+and+Fiber+Spinning+of+Recombinant+Spider+Silks%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Aqueous Processing and Fiber Spinning of Recombinant Spider Silks.</a> Macromolecules. 35 (4), 1262-1266 (2002).</li>
<li>Work, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Major+Ampullate+Silk+Fiber+Formation+by+Orb-Web-Spinning+Spiders%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+American+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Major Ampullate Silk Fiber Formation by Orb-Web-Spinning Spiders.</a> Transactions of the American Microscopical Society. 96 (2), 170-189 (1977).</li>
<li>Decker, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+Destruction+of+Endotoxin+in+Synthetic+Spider+Silk+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Method for the Destruction of Endotoxin in Synthetic Spider Silk Proteins.</a> Scientific Reports. 8 (12166), 1-6 (2018).</li>
</ol>

Los autores no declaran ningún conflicto de intereses.

Después de que las proteínas de seda de araña recombinante son purificadas tienen que ser preparadas en una solución que puede ser utilizada para la formación del material. Mezclando la proteína de seda de araña liofilizada con agua y exponiendo esta mezcla a la irradiación de microondas, para generar calor y presión, es posible preparar una solución de rSSp. Una amplia variedad de formas de material se puede producir a partir de este método simple y eficiente de la solubilización de rSSp. Cada material tiene que ser pre...

Los sedas de araña han cosechado el interés de los científicos materiales por su impresionante combinación de fuerza, elasticidad y biocompatibilidad. La recreación de fibras ha sido tradicionalmente el empuje de la investigación. Este esfuerzo fue obstaculizado por la proteína de la seda de araña recombinante (rSSp) insolubilidad en agua, así como la incapacidad de las técnicas de solvación tradicionales (agentes chatrópicos y detergentes) para lograr la solución acuosa. Además, las técnicas que se han desarrollado para las versiones de poder disolvente de rssp no funcionan en todas las variantes de rssp y también requieren una manipulación sustancial y el tiempo que a menudo resulta en la pérdida de proteína1,2. Esto ha dado lugar en gran parte en el campo utilizando 1, 1, 1, 3, 3, 3-Hexafluoroisopropanol (HFIP) como un disolvente de la que formar fibras, y otras formas de material limitadas. La ventaja es que todos los rSSp conocidos son solubles en HFIP, proporcionando uniformidad de datos entre cada grupo de investigación. La desventaja es que el HFIP es un solvente tóxico que es costoso y poco práctico de escalar debido a problemas de salud y consideraciones ambientales.
Se desarrolló un enfoque novedoso para la solvación de rSSp que estableció un puente entre la brecha tecnológica entre el HFIP de solvente orgánico áspero y otras técnicas que trabajaron selectivamente para la solvación de rSSp. La combinación de las presiones y los calentamientos específicos se aplicó a las suspensiones de rSSp y agua. Los resultados fueron cerca de 100% de la solvación y recuperación de la rSSp, así como altas concentraciones de proteínas; se determinó que una variedad de formas de materiales eran posibles a partir de estas formulaciones que no eran todas alcanzables usando HFIP u otros disolventes orgánicos3,4,5,6. El objetivo de este enfoque es solubilizar de manera eficiente y fácil las proteínas de araña recombinante purificadas y secas en una solución acuosa que luego puede ser utilizada para la producción de una variedad de formas de materiales.
Las fibras, las películas, los recubrimientos, los adhesivos, los hidrogeles, los lyogels, las microesferas y los materiales de esponja se logran fácilmente a partir de la misma solución de rSSp acuosa utilizando este método. La evolución continua de este método, no sólo con rSSp adicionales sino con otras proteínas, podría conducir a nuevas formas de materiales y alternativas de purificación de proteínas y soluciones de solubilización.

<table><tbody><tr><td>Jeringa de 3 mL con punta Luer-Lok</td><td>BD</td><td>309657</td> Se <td>pueden usar jeringas de otros tamaños, pero para mantener las puntas puestas, se recomienda usar puntas Luer-Lok</td></tr><tr><td>Vial de cultivo de 4 ml, transparente con tapa forrada de goma</td><td>Wheaton</td><td>225142</td><td>El volumen mínimo de droga es de 1 ml, el máximo es de 2 ml</td></tr><tr><td>Frasco de cultivo de 8 ml, transparente con tapa forrada de goma</td><td>Wheaton</td><td>225144</td><td>El volumen mínimo de droga es de 2 ml, el máximo es de 4 ml</td></tr> de <tr><td>alcohol isopropílico al 99 %, reactivo de grado ACS/USP</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>231000099</td><td></td></tr><tr><td>Freezone 4.5 Plus</td><td>Labconco</td><td></td><td>7386030 Liofilizador</td></tr><tr><td>Luer Adaptador Luer Hembra Luer x 10-32 Hembra, Tefzel (ETFE)</td><td>IDEX</td><td>P-629</td><td></td></tr><tr><td>Microondas</td><td>Magic Chef</td><td>HMD1110B</td><td>120 V, 60 Hz CA; 1000 vatios; capacidad de 1,1 pies cúbicos; con mesa</td></tr> <tr><td>giratoria de vidrioTubo de</td> PEEK <td>IDEX</td><td>F-120X</td><td></td>de 1/16" de diámetro</tr> exterior <tr><td>x 0,010" de diámetro interno</td><td>IDEX</td><td>1531B</td><td></td></tr><tr><td>Pulverizador: Aerógrafo Maestro</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

formación material de la araña recombinante sedas a través de la solvación acuosa utilizando calor y presión

Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure

Muchas arañas producen siete tipos de sedas. Seis de las sedas son fibras en forma cuando son producidas por las arañas. Estas fibras no son solubles en agua. Con el fin de reproducir las notables propiedades mecánicas de las arañas de seda, deben ser producidos en los anfitriones heterólogos como las arañas son tanto territoriales como caníbales. Los análogos sintéticos de la seda de araña también tienden a ser insolubles en soluciones acuosas. Por lo tanto, un gran porcentaje de investigación en sedas de araña recombinante dependen de disolventes orgánicos que son perjudiciales para la producción a gran escala de materiales. El método de nuestro grupo obliga a la solvación de estas sedas de araña recombinante en agua. Notablemente, cuando estas proteínas se preparan utilizando este método de calor y presión, una amplia gama de formas de material se puede preparar a partir de la misma solución de proteínas de seda de araña recombinante (rSSp) incluyendo: películas, fibras, esponja, hidrogel, lyogel, y adhesivos. Este artículo demuestra la producción de la rssp solvatadas y las formas de material de una manera que es más fácil de entender que de los materiales y métodos escritos por sí solos.

A partir del método descrito de solubilización de rSSp, se puede lograr una variedad de formas de material como se ve en la figura 1. El método de solubilización es aplicar calor y presión, generados por un microondas convencional, a una suspensión de rSSp y agua. Cuando se alcanzan temperaturas y presiones críticas, la proteína se solubilizará. A partir de esta solución de rSSp solubilizada, se presentan las condiciones requeridas para siete formas materiale...

Aquí, presentamos un protocolo para producir soluciones de proteína de seda de araña recombinante soluble en agua y las formas materiales que se pueden formar a partir de esas soluciones.

Formación material de la araña recombinante sedas a través de la Solvación acuosa utilizando calor y presión

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order ...

Este método de solubilización de sedas de araña recombinantes produce formas de materiales que no son posibles utilizando disolventes orgánicos ásperos tradicionales. Además, el proceso es grano, lo que resulta en una solución proteica simple en el agua. Mediante la utilización de este método, los materiales formados o producidos mantienen las características deseables de las proteínas de seda de araña.Esta técnica de solubilización para sedas de araña recombinantes permite la solubilización de sedas de araña recombinantes en un proceso de un solo paso. Esto es deseable porque estas proteínas notoriamente difíciles de producir no se pierden a través de un procesamiento extenso. Además, dado que las soluciones son sólo proteínas en el agua, se pueden agregar otros compuestos biológicamente activos si eso es deseable para la aplicación.Particularmente, la relación de función de la estructura proteica, este sistema es memético a cómo una araña hace una fibra en que utiliza agua y proteínas a una alta concentración. Mediante el uso de este método de solubilización y una formación material posterior, debe ser posible obtener comprensión en los materiales que se forman, y las estructuras que son responsables de ellos. Se cree que puede ser, hemos utilizado esta técnica para solubilizar péptidos sintéticos que de otra manera requerirían un ambiente alcalino o ácido para solvate.Eso puede ser ventajoso en aplicaciones posteriores para esos péptidos. Además, una serie de proteínas conocidas cuando se expresan sintéticamente tienden a terminar en la fracción insoluble. La resolubilización, y luego el refolding de estas proteínas es a menudo un proceso laborioso que resulta en grandes pérdidas.Mediante la utilización de esta técnica, podría ser posible aumentar la eficiencia de los procesos de recuperación de proteínas insolubles. Colocar un vial sellado en un microondas es un poco desalentador, lo que da el riesgo de sobrecalentamiento y, por lo tanto, sobre presurizar el vial. Comprender el enfoque escalonado para aplicar calor y presión es fundamental.En segundo lugar, para la seda de araña recombinante en particular, tener sal presente no permitirá que la técnica funcione o funcione con la misma eficacia dependiendo de la cantidad de sal presente. La eliminación de sal es la clave. Tenga paciencia y cuidado, controle de cerca los tiempos y temperaturas del microondas dentro del vial.Es fundamental porque hay una serie de piezas móviles para el funcionamiento que a menudo son difíciles de transmitir a través de materiales escritos tradicionales y secciones de método. Dado que hay muchas proteínas que tienen problemas de solubilidad que impiden un estudio adecuado, este método tiene potencial para ser aplicado a través de una variedad de espacios proteicos para mejorar, o incluso permitir técnicas analíticas y caracterización. Para comenzar, seleccione un vial de cultivo de vidrio borosilicato limpia y nuevo de ocho mililitros con una tapa de tornillo forrada de goma y coloque el vial vacío en un equilibrio analítico.Rasgue la masa del vial vacío para que la balanza diga masa cero. Agregue el polvo de proteína de seda de araña recombinante liofilizado deseado al vial vacío para el material específico. A continuación, añada la cantidad deseada de agua ultra pura, al menos dos mililitros, al vial.Selle la tapa del vial y vórtice rápidamente el contenido para crear una mezcla de proteína de seda de seda recombinante dispersa y homogénea. Realice una comprobación final de la tapa del vial para asegurarse de que se ha apretado firmemente y de forma segura. A continuación, transfiera la mezcla suspendida de proteína de seda de araña recombinante a un horno microondas convencional con el rango de potencia de 700 a 1500 vatios.Comience el funcionamiento del microondas con ráfagas de cinco segundos y ajuste la potencia completa encendiendo y apagando manualmente. Después de cada ráfaga, abra brevemente la puerta y mezcle cuidadosamente el vial para evitar la sedimentación y mantenga la mezcla suspendida. Ocasionalmente deje que el vial y la solución se enfríen, y evite que la solución sobrecalentada toque el sello.Utilice un termómetro infrarrojo para medir la temperatura de la solución que contiene la porción del vial. Repita el proceso de microondas hasta que la temperatura alcance al menos 130 grados centígrados, y todas las partículas sólidas se hayan disuelto por completo. A continuación, deje que la temperatura de la solución y la tapa del vial se enfríen por debajo de 100 grados centígrados.Antes de que esta solución se enfríe por completo, fundición desde el vial en geometrías específicas para formar un hidrogel. Después de que se forme el hidrogel, colóquelo en un baño de agua y transfiéralo al congelador a menos 20 grados centígrados. Espere hasta que el baño esté completamente congelado.Completar el proceso de formación de esponjas mediante la eliminación del hidrogel congelado y el baño de agua del congelador, y descongelación a 25 grados centígrados. A continuación, retire la esponja resultante del agua descongelada. Para preparar un liogel, transfiera una muestra de hidrogel congelado a un liofilizador.Después de 24 horas, retire el material de gel liofilizado final del recipiente. Para producir películas de proteína de seda de araña recombinante, fundó 200 microlitros de la proteína de seda de araña recombinante solubilizada caliente del vial en una forma PDMS de la forma deseada. Después de que se seque, despegelo del sustrato de PDMS para su análisis o tratamiento.Para preparar un recubrimiento que no se pueda eliminar del sustrato, utilice un pulverizador de aerógrafo para aplicar la proteína de seda de araña recombinante solubilizada para realizar un recubrimiento inicial de pulverización en el sustrato de su elección. Después de que se seque, sumerja el sustrato recubierto en la proteína de seda de araña recombinante solubilizada para formar un recubrimiento de inmersión. Repita el recubrimiento de inmersión para alcanzar el espesor deseado.Para formar adhesivos, utilice una pipeta para agregar la proteína de seda de araña recombinante solubilizada en un sustrato, y luego aplique un segundo sustrato sobre la parte superior de la solución. Sujete firmemente las piezas y luego seque las muestras en un horno con una temperatura mínima de 25 grados Centígrados durante al menos 16 horas. Para generar fibras hiladas húmedas, utilice una aguja deslizante de calibre 19 y cargue la solución de droga solubilizada en una jeringa concéntrica con una punta de bloqueo Luer.Expulse las burbujas de aire y deje que la droga se siente en el extremo de bloqueo Luer de la jeringa. Inserte al menos 25 milímetros de tubo PEEK en los accesorios herméticos de una pieza del tubo PEEK para uno de más de 16 pulgadas de diámetro exterior y 10 sobre 32 peines. Sustituya la aguja del calibre 19 por esta configuración en el adaptador hembra luer lock de la jeringa.A continuación, coloque guantes de nitrilo en el exterior de los godets intermedios, para evitar que la fibra se genere se deslice, y para evitar dañar los motores. Obtenga un baño de vidrio alto y transparente con 99% de isopropanol puro para usar como baño de coagulación. Llene el primer baño elástico con una proporción de 80 a 20 de isopropanol y agua destilada.En el segundo baño elástico, llenar una proporción de 20 a 80 de isopropanol y agua destilada. Configure el sistema de estiramiento de laet de dios en el ordenador. Para ajustar la velocidad principal de la eliminación de fibra, ajuste la barra deslizante para el triplete godet A velocidad a un valor entre 10 a 14 milímetros por segundo, dependiendo de lo bien y rápidamente que se está formando la fibra.Inicia un primer estiramiento moviendo la barra deslizante de la relación de estiramiento godet triple B a dos Para la godet final en el baño elástico uno, La godet superior media, y la primera godet en baño elástico dos. Inicia el segundo tramo moviendo la barra deslizante de la relación de estiramiento godet triple C a dos para la godet final en el baño elástico dos, la última godeta superior y la bobinadora. Esta configuración asegura que la primera godet después del baño de coagulación, y la primera godet en el primer baño elástico están girando a la misma velocidad.A continuación, cargue la solución de seda en la jeringa de un instrumento de línea de centrifugado personalizado. En el sistema automatizado, establezca la tasa de extrusión en 10 milímetros por segundo, con el fin de extruir la solución de seda en el baño de coagulación de vidrio lleno de isopropanol. Deje que la extrusión de fibra se vuelva uniforme, antes de sacar las fibras del baño con un gancho de metal delgado.Verifique que la extracción de la fibra del baño crea un bucle entre la punta del tubo PEEK y la trayectoria de la fibra que sale del baño. Guía la fibra recuperada a través de la serie de godets, de tal manera que la fibra se sumerge en los baños elásticos, pero secando en el aire entre los baños elásticos, y antes de entrar en un carrete. En este protocolo a través de una solubilización de la proteína de seda de araña recombinante, se puede lograr una variedad de formas materiales.Aquí se presentan siete formas materiales. Hidrogeles, lyogels, esponjas, adhesivos, recubrimientos, películas y fibras. Las fibras requieren el procesamiento más extenso extruyendo en un baño de coagulación, y luego estirando en serie la fibra cruda en los baños de estiramiento del contenedor posterior.Dado que las soluciones de proteínas y agua se calientan a una temperatura y presión relativamente altas, nuestra experiencia ha sido que las soluciones son estériles en el momento en que la proteína está solvada. Esto permite que cualquiera de las formas materiales presentadas aquí sea llevada al cultivo celular, siempre y cuando se manejen apropiadamente, para estudiar la respuesta celular a los materiales. Ciertamente esta técnica ha llevado al descubrimiento de nuevas formas de material, incluyendo adhesivos y material de esponja.Formas materiales que no están necesariamente orientadas hacia la formación de fibra, aunque la formación de fibra es una de las áreas que también ha visto mejoras a través del desarrollo de esta técnica. Generar calor y presión dentro de un vial sellado tiene peligro inherente. Use siempre equipo de protección personal al realizar estos procedimientos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

A continuación se describe una estrategia eficaz para extirpar las glándulas productoras de seda desde el abdomen de la mujer araña viuda negro. Este procedimiento permite el rápido aislamiento de los productores de seda siete diferentes glándulas de una forma altamente purificada, un proceso importante para los investigadores que estudian la producción de la seda de araña y el montaje de la fibra.

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A pesar de las excelentes propiedades mecánicas y bioquímicas de las sedas de araña, este material no pueden ser cosechadas en grandes cantidades por medios convencionales. A continuación se describe una estrategia eficiente para hacer girar las fibras artificiales de seda de araña, que es un proceso importante para los investigadores que estudian la producción de seda de araña y su uso como la próxima generación de biomateriales.

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La mezcla es un enfoque eficaz para generar biomateriales con una amplia gama de propiedades y características combinadas. Al predecir las interacciones moleculares entre las diferentes proteínas de la seda natural, nuevas plataformas de aleación de proteínas de seda de seda con la resistencia mecánica sintonizable, respuesta eléctrica, transparencia óptica, procesamiento químico, biodegradabilidad, estabilidad térmica o se pueden diseñar.

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Este protocolo demuestra la capacidad de utilizar la impresión reactiva de inyección de tinta para imprimir microagitadores biocompatibles y respetuosos con el medio ambiente automotiles para su uso en aplicaciones biomédicas y medioambientales.

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A modo de aprovechar microscopio de fuerza atómica (AFM) el método para la visualización de ADN plásmido, proteínas citoplasmáticas, y los complejos ADN-proteína se describe. El método incluye los enfoques alternativos para la preparación de muestras para el AFM imágenes después de la manipulación bioquímica. ADN que contiene regiones específicas que interactúan las proteínas se observan en las condiciones de amortiguación casi fisiológico.

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