Name: Purificación y trasplante de células progenitoras miógena derivan exosomas para mejorar la función cardiaca en ratones distróficos musculares de Duchenne (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Aprende a purificar y trasplantar exosomas derivados de células progenitoras miógenas para mejorar la función cardiaca en ratones con distrofia muscular de Duchenne mediante técnicas de ecocardiografía.

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Tang fue parcialmente financiado por la American Heart Association: NIH-AR070029, NIH-HL086555, GRNT31430008, HL134354 de NIH.

Los animales fueron tratados según protocolos aprobados y normas de bienestar animal del institucional cuidado Animal y del Comité de uso del colegio médico de Georgia en la Universidad de Augusta.
1. aislamiento y purificación de exosomas derivados de MPC
<ol><li>Semilla 5 x 106 C2C12 células en una placa de cultivo celular de 15 cm con 20 mL completa Dulbecco modifican medio del águila (DMEM) con 10% suero bovino fetal (FBS), 100 U/mL de penicilina G y estreptomicina 100 de μg/mL. Incubar a 37 ° C y 5% CO2.</li>
	<li>Preparar medio agotado de exosomas por ultracentrifugación de FBS a 100.000 x g de 18 h a 4 ° C utilizando un rotor oscilante de cubo. Deseche los pellets.</li>
	<li>Reemplazar el DMEM completo con medio exosomas-agotado cuando las células de la capa monomolecular a 80% de confluencia en la placa de cultivo.</li>
	<li>Utilizar una pipeta para recoger el sobrenadante de la placa de cultivo celular cada 48 h para un total de tres veces. Recoger el sobrenadante en tubos de centrífuga de 50 mL y centrifugar a 150 x g durante 10 min eliminar las células restantes.</li>
	<li>Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 μm para eliminar restos celulares. Ultracentrífuga el medio filtrado en tubos ultra claros usando el rotor oscilante de cubo a 100.000 x g durante 120 min a 4 ° C para precipitar exosomas.</li>
	<li>Resuspender el precipitado que contiene los exosomas en tampón fosfato salino (PBS) y llenar el tubo muy claro todo con PBS. Realizar la ultracentrifugación de esta suspensión a 100.000 x g durante 120 min a 4 ° C para eliminar proteínas contaminantes.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado de exosomas en 100 μl PBS. Almacenar a-80 ° C para su uso futuro.</li>
	<li>Para el análisis de microscopia electrónica, colocar 3 μl de suspensión de exosomal en una cuadrícula de formvar recubierto cobre microscopio 200 malla por 5 min a temperatura ambiente. Continuar con acetato de uranilo estándar tinción23. Examinar la red semiseco por microscopía electrónica de transmisión.</li>
</ol>2. intramiocárdica exosomas entrega
Nota: Utilizamos seis ratones de cada grupo.
<ol><li>Anestesiar ratones DBA/2J-DMDMDX (hombre; > 10 meses de edad y peso corporal (PC) > 18 g) con la inyección intraperitoneal (i.p.) de 100 mg/kg P.C. de ketamina combinada con 10 mg/kg BW de xilacina y confirmar la profundidad de la anestesia por presión del dedo del pie.</li>
	<li>Fijar cada ratón en posición supina sobre una plataforma quirúrgica con cinta para sujetar cada miembro y colocar una sutura 3-0 horizontalmente por debajo de los dientes superiores para mantener la mandíbula superior en lugar.</li>
	<li>Aplicar la crema depilatoria en el lado izquierdo del pecho de ratón para quitar la piel de la piel.</li>
	<li>Realizar intubación endotraqueal a través de la cavidad bucal mediante un catéter 24 G y ventilar el ratón con aire a una velocidad de 195 respiraciones/min con un ventilador de roedor (véase la Tabla de materiales).</li>
	<li>Desinfectar la piel con alcohol al 75% y yodo povidona al 10%.</li>
	<li>Haga una incisión oblicua de 10\u201215 de mm desde el borde esternal izquierdo en la axila izquierda, corte de músculo pectoral mayor y pectoral menor por una tijera, luego realizar una toracotomía izquierda a través del cuarto espacio intercostal. Suavemente Introduzca las bandas retractor para separar la cavidad torácica en un ancho de 10 mm. Tenga cuidado para evitar daños en el pulmón izquierdo.</li>
	<li>Utilizar dos pinzas rectas para quitar el pericardio, los separe y colocarlos detrás de las puntas del separador para exponer el corazón. MPC-Exo de inyectar (50 μg en 30 μL PBS) o 30 μL PBS (como control) intramyocardially en la pared anterior del ventrículo izquierdo utilizando una aguja de insulina 31 G en un sitio.</li>
	<li>Use suturas de nylon 6-0 para cerrar la cavidad torácica, músculos pectorales y la piel en secuencia.</li>
	<li>Recuperar ratones. Una vez que la respiración espontánea rítmica está presente, quite los ratones del respirador y extubación. Observar y registrar la condición de ratones después de la cirugía.</li>
</ol>3. ecocardiografía
Nota: Un único observador cegado a los grupos experimentales realiza ecocardiografía y análisis de datos.
<ol><li>Dos días después del trasplante de PBS/exosomas, anestesiar los ratones con 1\u20122% isoflurano.</li>
	<li>Fijar un ratón en la posición supina con cinta y aplique el gel acústico precalentado en el área izquierda del pecho.</li>
	<li>
Evaluar la función ventricular izquierda por ecocardiografía como se describió anteriormente16,24.
	<ol>
<li>Obtener la vista de eje largo paraesternal de ventrículo izquierdo (LV) en dos dimensiones (modo B) y luego gire la sonda de ultrasonido 90° para obtener una vista de eje corto del LV a nivel del músculo papilar.</li>
		<li>Grabar imágenes ecocardiográficas modo M y medir diámetro telediastólico ventricular izquierdo (DDVI), volumen telesistólico ventricular izquierdo (LVESD), volumen telediastólico ventricular izquierdo (VTDVI) y el volumen telesistólico ventricular izquierdo (VTSVI). Nota: Acortamiento fraccional (% FS) = [(LVEDD − LVESD) / DDVI] x 100 y fracción de eyección ventricular izquierda (FEVI %) = [(LVEDV − LVESV) / VTDVI] x 100.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. inmunohistoquímica
<ol><li>Dos días después del trasplante de PBS/exosomas, anestesiar ratones (véase el paso 2.1) y cortar el esternón abierto para exponer la cavidad torácica. Disecar la vena cava inferior e inundar el corazón por el ápice del ventrículo izquierdo con 3 mL de PBS, seguido de 3 mL de paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente, usando un catéter de mariposa con una aguja de 25 G conectada a una jeringa de 5 mL.</li>
	<li>Incorporar corazones fijos en parafina y cortadas en secciones de 5 μm de espesor.</li>
	<li>Desparafinizar portaobjetos en xileno y rehidratar en soluciones de etanol en el siguiente orden: xileno 100% (3 min), xileno 100% (3 min), 100% de etanol (1 min), etanol al 100% (1 minuto), etanol al 95% (1 minuto), etanol al 80% (1 minuto), H2O (1 min).</li>
	<li>Fijar las secciones de tejido con paraformaldehído al 4% por 8 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Sumerja los portaobjetos en citrato de sodio (0,01 M, pH 6.0) y realizar recuperación de antígeno utilizando un recuperador de antígeno.</li>
	<li>Permeabilizar las secciones por 1 h a temperatura ambiente con 1% polietilenglicol éter terc-Octylpheny PBS.</li>
	<li>Bloque de secciones con 5% de suero de cabra en PBS durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar las secciones con diluido de anticuerpo primario (anticuerpo anti-distrofina) en PBS (1: 100) durante la noche a 4 ° C, luego lavar tres veces con PBS durante 5 minutos.</li>
	<li>Incubar las secciones con diluido de anticuerpo secundario (Alexa Fluor 488 había conjugado anti-conejo de cabra IgG) en PBS (1: 400) por 45 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Control autofluorescence usando un amortiguamiento de Autofluorescencia kit (véase la Tabla de materiales).</li>
	<li>Medio de montaje de uso con DAPI (vea la Tabla de materiales) para montar las diapositivas.</li>
	<li>Observar diapositivas debajo de un microscopio confocal.</li>
</ol>

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</ol>

Todos los autores declara que tienen no hay conflictos de intereses.

El método de aislamiento de exosomas pura es esencial para el estudio de la función de exosomas. Una de las técnicas comunes para el aislamiento de exosomas es polietilenglicoles (PEGs) mediada por precipitación17,18,25. Exosomas pueden ser precipitada en las clavijas y peleteado por centrifugación a baja velocidad. Mediada por PEG purificación es muy conveniente y de bajo costo, no necesita ningún equipo avanzado, pero hay preo...

Distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una X-ligado recesiva, progresiva enfermedad neuromuscular causada por una mutación en el gen de la DMD y la pérdida de distrofina funcional1. Distrofina se expresa principalmente en el miocardio y músculo esquelético y menos se expresa en el músculo liso, glándulas endocrinas y neuronas2,3. DMD es el tipo más común de distrofia muscular con una incidencia de uno por cada 3.500 a 5.000 niños recién nacidos en todo el mundo4,5. Individuos suelen desarrollan necrosis muscular progresiva, pérdida de independiente a pie en la adolescencia temprana y la muerte en las décadas de segunda a tercera de sus vidas debido a la insuficiencia cardíaca y la insuficiencia respiratoria6.
Miocardiopatía dilatada, arritmias e insuficiencia cardíaca congestiva son manifestaciones cardiovasculares comunes de DMD7,8. No se puede curar la enfermedad, tratamiento de apoyo puede mejorar los síntomas o retrasar la progresión de la insuficiencia cardíaca, pero es muy difícil mejorar la función de corazón9,10.
Similares para los pacientes con DMD distrofia muscular X-ligado (MDX) ratones son deficientes en la proteína de distrofina y presente síntomas de cardiomiopatía11y por lo tanto son ampliamente utilizados en la investigación DMD asociado miocardiopatía. Con el fin de restaurar la distrofina en los músculos afectados, terapia de células madre alogénico ha demostrado para ser un eficaz tratamiento para la DMD12,13,14. Exosomas, vesículas de membrana 30-150 nm secretadas por varios tipos celulares, juegan un papel clave en la comunicación de célula a célula a través de transporte de material genético, ARN mensajero (ARNm) como no-codificación RNAs15,16,17 ,18,19,20,21.
Nuestros estudios previos han demostrado que los exosomas derivados de células progenitoras miógeno (MPC), como línea de celular C2C12, pueden transferir dystrophin mRNA al host cardiomiocitos después de inyección cardiaca directa22, indicando que entrega alogénico de Exosomas derivados de MPC (MPC-Exo) transitorio pueden restaurar la expresión del gen DMD en ratones MDX. Este artículo se centra en técnicas de purificación y trasplante MPC-Exo.

<table><tbody><tr><td>0,22 y mu; m Filtro</td><td>Fisherbrand</td><td>09-720-004</td><td></td></tr><tr><td>15 cm Plato de cultivo celular</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>157150</td><td></td></tr><tr><td>catéter 24 G</td><td>TERUMO</td><td>SR-OX2419CA</td><td></td></tr><tr><td>31 G aguja de insulina</td><td>BD 328291</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehído&nbsp;</td><td>Affymetrix</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubos de centrífuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>6-0 sutura</td><td>Pro Advantage by NDC</td><td>P420697</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 cabra anti-conejo IgG Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico Solución Antimicótica Corning</td><td>&nbsp;</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-distrofina</td><td>Abcam</td><td>ab15277</td><td></td></tr><tr><td>Antígeno retriever&nbsp;</td><td>Aptum Biologics</td><td>R2100-US Kit de enfriamiento de</td> autofluorescencia para <td>recuperación de antígenos</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP-8400</td><td></td></tr><tr><td>C2C12 línea celular</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Unico</td><td>C8606</td><td></td></tr><tr><td>Change-A-Tip Cauterias de alta temperatura</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>HIT</td><td></td></tr><tr><td>Microscopía confocal</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss 780 Ratones confocales</td><td></td></tr><tr><td>verticales DBA/2J-mdx</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>013141</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning&nbsp;</td><td>10-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino (FBS)</td><td>Corning&nbsp;</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra&nbsp;</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>191356</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Patterson Veterinario</td><td>07-893-1389</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Henry Schein</td><td>056344</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje con DAPI&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Juego de retractores para ratones</td><td>Kent Scientific</td><td>SURGI-5001</td><td></td></tr><tr><td>Éter de polietilenglicol terc-octilfenilo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Ventilador para roedores</td><td>Harvard Apparatus</td><td>55-7066</td><td></td></tr><tr><td>SW-28 Rotor Ti</td><td>Beckman</td><td>342207</td><td></td></tr><tr><td>La plataforma</td> <td>de imágenes Vevo 2100Sistema de ultrasonido FUJIFILM VisualSonics</td><td>Vevo 2100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman</td><td>365672</td><td></td></tr><tr><td>Tubos ultratransparentes</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>xilacina (XylaMed)</td><td>Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td><td>1XYL003 8XYL006</td><td></td></tr></tbody></table>

purificación y trasplante de células progenitoras miógena derivan exosomas para mejorar la función cardiaca en ratones distróficos musculares de duchenne

Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice

Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad genética recesiva x-ligada causada por una carencia de la proteína distrofina funcional. No se puede curar la enfermedad, y conforme avanza la enfermedad, el paciente desarrolla síntomas de insuficiencia cardíaca congestiva, miocardiopatía dilatada y arritmias. Los ratones mutantes DMDMDX no expresan distrofina y se utilizan comúnmente como un modelo de ratón de la DMD. En nuestro reciente estudio, se observó que la inyección intramiocárdica de tipo ancho (WT)-progenitor miógena exosomas derivados de células (MPC-Exo) transitoriamente restauran la expresión de distrofina en el miocardio de ratones mutantes DMDMDX , asociada con una mejora transitoria de la función cardiaca, lo que sugiere que WT-MPC-Exo puede proporcionar una opción para aliviar los síntomas cardiacos de la DMD. Este artículo describe la técnica de purificación de MPC-Exo y el trasplante en corazones de ratones mutantes DMDMDX .

Un diagrama de flujo para aislar y purificar exosomas de células C2C12 se muestra en la figura 1A. Para confirmar la presencia de exosomas, realizamos análisis de microscopia electrónica de transmisión. Imagen de microscopía electrónica de transmisión (figura 1B) muestra la morfología de las vesículas de forma brillante y redonda de exosomas C2C12 derivados. Mancha blanca /negra occidental análisis confirmaron la presencia de ma...

Aquí, presentamos un protocolo para mejorar transitoriamente la función cardiaca en ratones de la distrofia muscular de Duchenne mediante el trasplante de exosomas derivados de células progenitoras miógena normal.

Purificación y trasplante de células progenitoras miógena derivan exosomas para mejorar la función cardiaca en ratones distróficos musculares de Duchenne

Duchene Muscular Dystrophy (DMD) is an X-linked recessive genetic disease caused by a lack of functional dystrophin protein. The disease cannot be cured, ...

Este protocolo presenta el método para mejorar transitoriamente la función cardíaca en los ratones con distrofia muscular de Duchenne mediante el trasplante de exón derivado de células progenitoras miogénicas normales. El trasplante exosomal puede mejorar la función cardíaca en ratones con DMD en asociación con una mayor expresión de distrofia en los corazones receptores. El método adecuado para el aislamiento de exones, la purificación y el trasplante intramiocardio contribuyen al éxito del trasplante de exón para mejorar la función cardíaca de los ratones con la distrofia muscular de Duchenne.La terapia de exosomas derivada de MPC podría mejorar la función del músculo esquelético mediante la transferencia de ARNm de distrofina normal mediada por exosomas. Este video demuestra las técnicas críticas para la purificación de exosomas, la administración de exosomas intramiocardiales y la ecocardiografía después del trasplante. La demostración de ecocardiografía será realizada por Yan Shen, técnico de nuestro laboratorio.Para comenzar este procedimiento, sembrar cinco millones de células C2C12 en un plato de cultivo de 15 centímetros con 20 mililitros de DMEM completo que contiene 10%FBS y antibióticos. Incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. A continuación, utilice un rotor de cubo oscilante para ultracentrífuir FBS a 100.000 veces G y a cuatro grados Celsius durante 18 horas para preparar el medio agotado por exosomas.Deseche el pellet y recoja el sobrenadante. Cuando las células monocapa alcancen el 80% de confluencia en el plato de cultivo, reemplace el DMEM completo por un medio agotado por exosomas. Utilice una pipeta de transferencia para recoger el sobrenadante del plato de cultivo celular cada 48 horas.Centrifugar los tubos a 150 veces G durante diez minutos para extraer las células restantes. Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 micrómetros para eliminar cualquier residero celular y transferir el medio filtrado a tubos ultra claros. A continuación, utilice un rotor de cubo oscilante para ultracentrífater los tubos a 100, 00 veces G y a 4 grados Celsius durante 120 minutos para precipitar los exosomas.Resuspender el pellet que contiene exosoma en PBS y luego llenar todo el tubo ultra-claro con PBS. Ultracentrífaza esta suspensión a 100, 00 veces G y a 4 grados Celsius durante 120 minutos para eliminar las proteínas contaminantes. Deseche el sobrenadante y resuspendir el pellet exosoma en 100 microlitros de PBS.Conservar a menos 80 grados Centígrados para uso futuro. Primero, fije cada ratón anestesiado en la posición supina en una plataforma quirúrgica asegurando cada extremidad con cinta adhesiva. Coloque una sutura 3-0 horizontalmente debajo de los dientes superiores para mantener la mandíbula superior en su lugar.A continuación, aplica crema depilatoria en el lado izquierdo del pecho del ratón para quitar el abeto de la piel. Usando un catéter de calibre 24, realice la intubación endotraqueal a través de la cavidad oral. Y utilice un respirador de roedores para ventilar el ratón con aire de la habitación a una velocidad de 195 respiraciones por minuto.Desinfectar la piel con 70%alcohol y 10%yodo povidona. Luego haz una incisión oblicua de 10 a 15 milímetros desde el borde esternal izquierdo hasta la axila izquierda. Use tijeras para cortar el pectoral mayor y pectoralis menor.Y hacer una toracota izquierda a través del cuarto espacio intercostero. Inserte suavemente las bandas retráctiles para extender la cavidad torácica a una anchura de 10 milímetros teniendo cuidado de no dañar el pulmón izquierdo. Después de esto, use dos pinzas rectas para eliminar el pericardio.Tire de ellos y colóquelos detrás de las puntas del retractor para exponer el corazón. Utilice una aguja de insulina de calibre 31 para inyectar MPC-Exo o PBS intramiocardimente en la pared anterior del ventrículo izquierdo en un sitio. Luego, usa suturas de nylon 6-0 para cerrar la cavidad torácica, los músculos pectorales y la piel, en secuencia.Dos días después del trasplante de exosomas de PBS, anestesia a los ratones como se describe en el protocolo de texto. Utilice cinta adhesiva para fijar un ratón en posición supina y aplique gel acústico precalentado en la zona izquierda del pecho. A continuación, utilice la ecocardiografía para evaluar la función ventricular izquierda.Obtener la vista de eje largo parasternal del ventrículo izquierdo en dos dimensiones y luego girar la sonda de ultrasonido 90 grados para obtener una vista del eje corto del ventrículo izquierdo a nivel muscular papilar. Después de esto, grabe imágenes ecocardiográficas en modo M y mida el diámetro diastólico final del ventrículo izquierdo, el volumen sistólico final ventricular izquierdo, el volumen diastólico final del ventrículo izquierdo y el volumen sistólico final del ventrículo izquierdo. La frecuencia cardíaca de los ratones debe controlarse al menos 400 lpm para la función de medición cardíaca.Después de que los exosomas se aíslen y se purifican a partir de células C2C12, su presencia se confirma mediante el análisis de microscopía electrónica de transmisión. La imagen de microscopía electrónica de transmisión muestra la morfología de las vesículas brillantes y redondas de los exosomas derivados de C2C12. El análisis de manchas occidentales confirma la presencia de marcadores de exosomas, incluidos CD63 y Tsg101.Se observa un área de edema translúcido después de la inyección intramiocardio en la pared anterior del ventrículo izquierdo de ratones mdx que indica que la inyección en el miocardio es exitosa. La tinción inmunofluorescente para la distrofina se realiza entonces para determinar si la entrega MPC-Exo cardíaca restaura la expresión de distrofina-proteína en corazones mdx. La restauración parcial de la expresión de distrofina se observa con la localización de la membrana en algunos de los cardiomiocitos.La función cardíaca se mide mediante ecocardiografía dos días después del parto intramiocardio para determinar si la translación de MPC-Exo mejora la función cardíaca en ratones mdx. El tratamiento MPC-Exo se ve para mejorar el movimiento de la pared interior en comparación con PBS, lo que sugiere que el trasplante MPC-Exo mejoró la función cardíaca en ratones mdx. El uso de una aguja de insulina de calibre 31 con la punta a unos 20 grados es fundamental para el éxito para la entrega de la mayoría de los exosomas en el miocardio y maximiza la exposición de exosomas inyectados para albergar cardiomiocitos.Después del procedimiento, la expresión de distrofina se puede detectar después de la inyección de exosoma derivada de MPC por tinción inmunofluorescente que indica que la administración de exosomas derivada de MPC cardíaco restaura la expresión de la proteína distrfina. Esta técnica allanará el camino para el tratamiento de la cardiomiopatía con materiales genéticos terapéuticos portadores de exosomas, incluyendo ADN, ARNm, lncRNA o microRNAs.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Células madre pluripotentes inducidas (iPSC)-progenitores miógenos derivados son candidatos prometedores para las estrategias de terapia celular para tratar las distrofias musculares. Este protocolo describe el trasplante y las medidas funcionales necesarias para evaluar el injerto y la diferenciación de mesoangioblastos derivados de iPSC (un tipo de progenitores musculares) en modelos de ratón de regeneración muscular aguda y crónica.

Trasplante De InducidaS Pluripotentes Derivadas De Células Madre Mesoangioblastos Como Progenitores Miógenos En Modelos De Ratón De La Regeneración Muscular

El aislamiento y cultivo de una población pura de células satélite quiescentes, una población de células madre de músculo, es esencial para la comprensión de la biología de células madre del músculo y la regeneración, así como el trasplante de células madre para terapias en la distrofia muscular y otras enfermedades degenerativas.

Aislamiento, cultivo y trasplante de células musculares satélite

Este protocolo implica procedimientos detallados para el aislamiento de células derivadas de la orina de pacientes con distrofia muscular; su reprogramación eficiente y rápida a través de la transducción del virus de Sendai.

Generación de pluripotentes inducidas Células Madre de la distrofia muscular pacientes: Eficiente Reprogramación-Integración libre de orina células derivadas

Presentamos tres protocolos nuevos y más eficientes para la diferenciación de células madre pluripotentes inducidos por el hombre en cardiomiocitos, células endoteliales, y células del músculo liso y un método de entrega que permite mejorar el injerto de las células transplantadas mediante la combinación de la inyección de células con la entrega de citoquinas parche mediada.

Pluripotentes células madre derivadas de células cardiacas para la reparación del miocardio

Aquí proporcionamos un protocolo detallado para llevar a cabo en vivo gene cardiaco edición en ratones usando Virus de Adeno-Associated recombinante (rAAV)-mediado entrega de CRISPR. Este protocolo ofrece una estrategia terapéutica prometedora para tratar cardiomiopatía distrófica en distrofia muscular de Duchenne y puede utilizarse para generar nocaut cardiaco específico en los ratones postnatales.

Entrega de mediada por Virus adeno-asociado de CRISPR para Gene cardiaco en ratones

Aquí, presentamos un protocolo de eliminación exon23 basado en Cas9 para restaurar la expresión de distrofina en iPSC a partir de fibroblastos cutáneos derivados del ratón Dmdmdx y diferenciar directamente los iPSC en células progenitoras miogénicas (MPC) utilizando el sistema de activación Tet-on MyoD.

Tecnología CRISPR/Cas9 en la restauración de la expresión de distrofina en progenitores musculares derivados de iPSC

Las enfermedades humanas complejas pueden ser difíciles de modelar en los sistemas de modelos de laboratorio tradicionales. Aquí, describimos un enfoque quirúrgico para modelar la enfermedad muscular humana a través del trasplante de biopsias musculares esqueléticas humanas en ratones inmunodeficientes.

Realización de Xenoinjertos musculares esqueléticos humanos en ratones inmunodeficientes

En este artículo, describimos un protocolo detallado para el modelado eficiente del músculo de la distrofia muscular de Duchenne usando células derivadas de orina convertidas MYOD1para evaluar la restauración de los niveles de ARNm de distrofina y proteína según el exon.

Exon Skiping en Miotubos Directamente Reprogramados obtenidos de Células Derivadas de orina humana

Este protocolo ilustra 1) el aislamiento y cultivo de fibroblastos primarios del músculo gastrocnemio de ratón adulto, así como 2) la purificación y caracterización de exosomas utilizando un método de ultracentrifugación diferencial combinado con gradientes de densidad de sacarosa seguidos de análisis de Western blot.

Aislamiento y caracterización de exosomas de fibroblastos del músculo esquelético

Este protocolo describe la conversión de fibroblastos de piel en mioblastos y su diferenciación en miotubes. Las líneas celulares se derivan de pacientes con trastornos neuromusculares y se pueden utilizar para investigar mecanismos patológicos y para probar estrategias terapéuticas.

Reprogramación directa de fibroblastos humanos en mioblastos para investigar terapias para trastornos neuromusculares

La administración de células guiadas por ultrasonido alrededor del sitio del infarto de miocardio en ratones es una forma segura, efectiva y conveniente de trasplante de células.

Implantación de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducida por ultrasonido en ratones con infartado de miocardio

Aprende a purificar y trasplantar exosomas derivados de células progenitoras miógenas para mejorar la función cardiaca en ratones con distrofia muscular de Duchenne mediante técnicas de ecocardiografía.

Purificación y trasplante de células progenitoras miógena derivan exosomas para mejorar la función cardiaca en ratones distróficos musculares de Duchenne (Video) | JoVE Journal

Purificación y trasplante de células progenitoras miógena derivan exosomas para mejorar la función cardiaca en ratones distróficos musculares de Duchenne

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