En Vivo inhibición de MicroRNA para disminuir el crecimiento tumoral en ratones

Realizamos la primera terapia, basada en un inhibidor de microARN en un modelo de cáncer de tiroides. Estas terapias en desarrollo son prometedoras para el tratamiento de esta enfermedad. Este tipo de modelo ortotópico, utilizando una vía sistémica de administración del tratamiento, facilita la validación de un nuevo fármaco a base de microARN.

Aunque usamos un modelo ortotópico para implantar células de cáncer de tiroides humano en tiroides de ratón, estos modelos podrían ser todos sistémicos para otros tipos de cáncer. Demostrando el procedimiento con Julia Ramírez-Moya y Adrian Acuña estará Raquel Arocha Riesco. Es una técnico de nuestro instituto.

Después de establecer un medio incompleto de la línea celular del cáncer de tiroides humano CAL-62, suspenda 1 por 10 a la 6a alícuota celular en 50 microlitros de PBS a 4 grados centígrados, y mezcle las células con un volumen igual de matriz de membrana del sótano. Cargue las células en una jeringa de 1 mililitro, equipada con una aguja de media pulgada de 27 medidores, e inyecte por vía subcutánea 100 microlitros de la muestra en el flanco izquierdo de un ratón desnudo de válvula inmunodeficient C de 6 semanas de edad. Dos semanas después de la inyección, añada la solución tótagiór o tampón de tratamiento controlado a 160 microlitros de reactivo de parto in vivo a temperatura ambiente en un tubo de 1 punto 5 mililitros.

Y vórtice inmediatamente la solución durante 10 segundos para asegurar la complejidad de la mezcla. Incubar la solución de tratamiento durante 30 minutos a 50 grados centígrados, seguido de una breve centrifugación en una micro centrífuga. A continuación, diluir el complejo de tratamiento sedimentado seis veces con PBS fresco y mezcla completa.

E inyecte todo el volumen de 200 microlitios del tratamiento directamente en el tumor. Inyectar 50 microlitros de una solución de sustrato de D-Luciferin de 40 miligramos por litro por vía subcutánea 2 veces a la semana, en cada animal experimental. Asegúrese de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo después de la anestesia con isoflurano.

Coloque el animal en la cámara de un sistema de imágenes de bioluminiscencia in vivo e imagine la señal de bioluminiscencia con el software de imágenes in vivo de acuerdo con los protocolos estándar. Luego analiza el crecimiento del tumor. Comparar ambos tratamientos y determinar la importancia y las diferencias de crecimiento mediante una prueba T.

Para la inoculación ortotópica de células tumorales tiroideas suspender una alícuota de CAL-62 células en 5 microlitros de PBS, e inyectar por vía subcutánea 100 microlitros de analgésico y 100 microlitros de antibiótico en una válvula de 7 semanas de edad ratón desnudo. Después de confirmar una falta de respuesta al pellizco del dedo del dedoque, coloque el animal bajo un microscopio diseccionador y desinfecte el cuello del animal con yodopoviona. A continuación, haga una incisión de aproximadamente 2 centímetros en la piel, y desplace el glande para exponer el cuello.

Utilice fórceps de disección, y/ o tijeras, para diseccionar los músculos de la correa para exponer la tráquea y la glándula tiroides, y utilice una jeringa de 10 microlitros, para inyectar el volumen de 5 microlitro de las células tumorales en el lóbulo tiroideo derecho, situado en el lado del cartílago cricoide. Cuando todas las células hayan sido entregadas, vuelva a colocar el glande salival y use suturas trenzadas, recubiertas y no absorbibles para cerrar la incisión. A continuación, aplique yodopoviviona en el área de la herida y coloque el ratón sobre una manta térmica con monitoreo hasta la recuperación completa.

dos a tres semanas después de la inyección de células intratiroideas, preparar la solución de tratamiento como se ha demostrado y administrar la solución por vía intravenosa mediante inyección retro-orbital del seno venoso del animal anestesado con tumor tiroideo. En este experimento representativo, el crecimiento de tumores inyectados por vía intratumoal sin inhibidor de microRNA 146B, fue suprimido significativamente con respecto al control negativo. También se observaron niveles de expresión intratumoral de algunos marcadores de proliferación en niveles bajos, en tumores tratados con antagomiR, en comparación con tumores de control.

Además, la recuperación de los objetivos de micro-ARN se puede estudiar a través del análisis de ARN extraído del tumor, o proteína. Revelar colectivamente que la inhibición in vivo de los micro ARN individuales es eficaz y puede ser explotada terapéuticamente para tratamientos de cáncer de tiroides. El análisis histológico de los tumores tiroideos establecidos en ratones como se ha demostrado, permite la tinción de las células epiteliales que rodean el tumor, revelando la arquitectura del folículo tiroideo del tejido tumoral.

En particular, la inyección intravenosa del inhibidor microRNA 146B en ratones, con un tumor establecido, da lugar a una disminución significativa del volumen tumoral en comparación con los animales tratados con control. Además, la expresión del nuevo microRNA 146B objetivo DICER1 en el tumor primario, aumenta después del tratamiento anti micro-ARN 146B, subrayando aún más el potencial de la inhibición de la expresión de micro-ARN indogéneo y por lo tanto la restauración de sus genes diana como terapia en el cáncer de tiroides. Esta técnica, y los resultados posteriores de la lipina, abren la posibilidad de explorar nuevas terapias basadas en ARN no curado para el tratamiento del cáncer de tiroides.