Un método automatizado para realizar el ensayo de micronúcleos In Vitro mediante citometría de flujo de imágenes multiespectral

El ensayo de micronúcleos basado en flujos de imágenes puede superar varias limitaciones de métodos como la microscopía automatizada y la citometría de flujo convencional, incluyendo un bajo rendimiento y la falta de confirmación visual de eventos. La principal ventaja de esta técnica es que todos los eventos necesarios para determinar la genotoxicidad y la citotoxicidad se pueden identificar, identificar y puntuar automáticamente sin necesidad de crear diapositivas de microscopio. Para la exposición celular a clastógenos y/o anéuticos, añada un milímetro del producto químico de interés a siete a ocho veces 10 a la quinta de las células experimentales en nueve mililitros del medio de cultivo celular apropiado en un matraz T25 y un mililitro de agua a los cultivos de control.

Incubar los matraces a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono durante tres horas antes de transferir las células a un tubo de polipropileno de 15 mililitros por matraz. Recoger las células por centrifugación y resuspender los pellets en 10 mililitros de medio de cultivo fresco por tubo para la siembra en nuevos matraces de cultivo T25. A continuación, añada 150 microlitros de la concentración en stock de citocaplasina B a cada matraz para lograr una concentración final de tres microgramos por mililitro.

Devolver los matraces a la incubadora para un tiempo de recuperación igual a 1,5 a dos tiempos duplicados, según lo recomendado por las directrices de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos. Al final del período de recuperación, transfiera los cultivos a tubos individuales de polipropileno de 15 mililitros para centrifugación y resuspend los pellets en cinco mililitros de cloruro de potasio milimiolar 75 mililitro. Mezclar suavemente por inversión tres veces e incubar las muestras a cuatro grados centígrados durante siete minutos.

Al final de la incubación, añadir dos mililitros de cuatro por ciento de formalina a cada muestra y mezclar suavemente con tres inversiones. Devuelva las muestras a cuatro grados centígrados durante 10 minutos antes de recoger las células por centrifugación. resuspender los pellets en 100 microlitros de formalina fresca del cuatro por ciento durante 20 minutos.

Al final de la incubación, lave las células fijas en cinco mililitros de tampón de lavado por tubo por centrifugación y resusppend los pellets en 100 microlitros de tampón de lavado por tubo. A continuación, transfiera las muestras a tubos individuales de microcentrífuga de 1,5 mililitros para contar con un hemocicómetro. Añadir cinco microlitros de 100 microgramos por mililitro Hoechst 33342 por 1,0 x 10 a las seis células por mililitro y 10 microlitros de 500 microgramos por mililitro de RNase por cada 100 microlitros de muestra por tubo.

Después de una incubación de 30 minutos a 37 grados Celsius y cinco por ciento de dióxido de carbono, centrifugar las muestras en una microcentrífuga y eliminar todos los microlitros de sobrenadante de cada tubo. A continuación, resuspender cuidadosamente las muestras, teniendo cuidado de no inducir la formación de burbujas. Si aparecen burbujas al resuspension, deslice suavemente el tubo para extraerlas.

Para ejecutar las muestras mediante citometría de flujo de imágenes multiespectral, primero encienda el láser de 405 nanómetros y ajuste la potencia del láser a 10 milivatios. Deshabilite todos los otros láseres, incluido el láser de dispersión lateral, y establezca el campo brillante en los canales uno y nueve. Confirme que el control deslizante de ampliación está establecido en 60x, que el modo de alta sensibilidad está seleccionado y que solo se muestran los canales uno, siete y nueve en la galería de imágenes.

Haga clic en Gráfica de dispersión y seleccione toda la población y el área M01 en el eje X. Seleccione la relación de aspecto M01 en el eje Y y haga clic en región cuadrada para dibujar una región alrededor de las celdas individuales. Asigne un nombre a esta región a las celdas individuales y haga clic con el botón derecho en el trazado para seleccionar regiones.

Resalte la región de celdas individuales y cambie las coordenadas X a 100 y 900 y las coordenadas Y a 0.75 y una. Establezca los parámetros de adquisición y especifique el nombre de archivo y la carpeta de destino. A continuación, cambie el número de eventos a 20.000, seleccione la población positiva de ADN y ejecute la primera muestra.

Para abrir un archivo de datos en IDEAS, haga clic en Iniciar análisis para iniciar el Asistente para abrir archivos y busque para seleccionar el archivo de imagen sin formato deseado. A continuación, haga clic en Siguiente y busque una celda binucleated en la galería de imágenes. Para crear una máscara, haga clic para seleccionar la imagen de interés y abrir la pestaña de análisis.

Haga clic en Máscaras, Nuevo y Función para seleccionar LevelSet. En Máscara, seleccione M07 y Máscara de nivel medio y establezca la escala de detalles del contorno en tres. A continuación, haga clic en Aceptar dos veces.

Para detectar operaciones de celda binucleadas de recuento, abra la pestaña Análisis y seleccione Características y Nuevo. En Tipo de operación, seleccione Recuento de puntos. En Máscara, seleccione la máscara binucleada final y establezca la conexión en cuatro, luego cambie el nombre a BNC de recuento de manchas y haga clic en Aceptar y cerrar para calcular los valores de entidad.

Para un histograma de celda binucleado de recuento de puntos, haga clic en histograma y seleccione no apoptopic como la población primaria. Para la operación Eje X, seleccione Recuento de manchas BNC y haga clic en Aceptar y región lineal, luego dibuje una región en Bim Two y asigne a esta región el nombre 2N. Para crear una máscara de micronúcleos, seleccione una celda binucleada que contenga un micronúcleo de la galería de imágenes y abra las máscaras en la pestaña Análisis.

Para crear una máscara de identificación de punto, haga clic en Nuevo y función y seleccione Spot. Confirme que el botón de opción Brillante está seleccionado y seleccione M07 bajo máscara. Establezca la relación de fondo de punto a celda y el radio mínimo en dos y establezca el Radio máximo en seis.

Haga clic en Aceptar y Aceptar para agregar la máscara a la lista de la izquierda y, a continuación, haga clic en Nuevo para crear otra máscara. Haga clic en el canal M07 de punto siete brillante dos seis dos máscara y haga clic en la flecha hacia abajo para agregarla a la definición de máscara y haga clic en los operadores Y y No. Haga clic en la flecha hacia abajo para agregar máscara de rango dilatado a la definición de máscara.

Para crear una máscara de población polinucleada, haga clic en Análisis, Máscaras, Nuevo y Función. En Función, seleccione Rango. En Máscara, seleccione Conjunto de dilatación de cuenca hidrográfica M07 Channel07, Medio, tres, dos y establezca la imagen para que se muestre en Canal 07.

Establezca los valores de área mínima y máxima en 135 y 5000, respectivamente, y establezca los valores de relación de aspecto mínimo y máximo en 0,4 y uno, respectivamente. Haga clic en Aceptar y, en el campo Nombre, cambie el texto para leer máscara POLY y, a continuación, haga clic en Aceptar y Cerrar. Para crear una vista personalizada, haga clic en el botón Propiedades de la Galería de imágenes, abra la pestaña Compuestos y haga clic en Nuevo.

En Nombre, ingrese Canal 01 al Canal 07. Haga clic en Agregar imagen y, en Imagen, seleccione Canal 01 y establezca el porcentaje en 100. Haga clic en Agregar imagen de nuevo y, en imagen, seleccione Canal 07 y establezca el porcentaje en 100.

Haga clic en la pestaña Ver, haga clic en Nuevo y, en Nombre, escriba Máscaras BNC y MN. A continuación, haga clic en Agregar columna y, en Tipo de imagen, seleccione Canal 01 y, en Máscara, seleccione Ninguno. Haga clic en Agregar columna y, en Tipo de imagen, seleccione Canal 07 y, en Máscara, seleccione Ninguno.

Haga clic en Agregar columna, haga clic en el botón de opción Compuesto y, a continuación, haga clic en Aceptar para completar la vista personalizada. Haga clic en el menú desplegable Ver y haga clic en la vista Máscaras BNC y MN. Haga clic en el botón Mostrar máscaras ocultas.

Para enumerar eventos clave, abra la pestaña Informes y haga clic en Definir informe de estadísticas y, a continuación, en la nueva ventana, haga clic en Agregar columnas. Para agregar la estadística de recuentos de celdas binucleadas, en Estadísticas, seleccione Recuento y, en Población seleccionada, seleccione la población de BNC y, a continuación, haga clic en Agregar estadísticas para agregar la estadística a la lista y guardar la plantilla. Una vez agregadas todas las estadísticas a la lista, haga clic en Cerrar, luego haga clic en Aceptar y, a continuación, guarde la plantilla de análisis de datos.

Para procesar por lotes los archivos experimentales, en el menú Herramientas, haga clic en Archivos de datos por lotes y haga clic en Agregar lote en la nueva ventana. Haga clic en Agregar archivos para seleccionar los archivos de experimento que desea agregar al lote y haga clic en el botón Abrir carpeta en la opción Seleccionar una plantilla o un archivo de análisis de datos. Vaya a la plantilla que se acaba de guardar y ábrala.

Haga clic en Aceptar para cerrar la ventana actual. A continuación, haga clic en Enviar lotes para iniciar el procesamiento por lotes de todos los archivos. Aquí se muestran cuatro paneles seleccionados para identificar celdas binucleateds.

Estas gráficas e histogramas bivariados permiten la selección de celdas binucleadas, así como la identificación de aquellas células que tienen dos núcleos con circularidad, áreas e intensidades similares y que están bien separadas unas de otras. Estas imágenes de Brightfield y Hoechst, así como las máscaras de célula binucleada y micronúcleos, facilitan la identificación y enumeración de células binucleadas y micronúcleos. La aplicación de la entidad de recuento de puntos utiliza la máscara polinucleada para identificar celdas mononucleares, trinucleares y cuadrúcleas.

El número de células tri y cuadrranucleares se puede sumar para obtener el número final de células polinucleadas necesarias para el cálculo de la citotoxicidad. Aquí, se muestran valores representativos de genotoxicidad y citotoxicidad para la colchicina endógeno, la mitomicina C clastágena y un control negativo, el manitol, para demostrar la validez del protocolo. Etiquetar las células con una concentración adecuada de la mancha de ADN es fundamental para garantizar la captura de imágenes de alta calidad, lo que permite identificar y puntuar fácilmente todos los eventos clave.

Estas técnicas también son aplicables al ensayo de micronúcleos para la biodosimetría de radiación, que permite la estimación de la dosis en individuos que pueden haber estado expuestos a la radiación.