Uso de la tinción de inmunofluorescencia en la cara para observar directamente las células endoteliales vasculares

Este protocolo ayuda a las personas a analizar la morfología celular endotelial, y la expresión de moléculas en regiones, bajo diferentes estrés de cizallamiento de fluidos. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una evaluación directa de las células endoteliales vasculares bajo diferentes tensiones de cizallamiento de fluidos. Al realizar este procedimiento, los pasos clave son utilizar paraformaldehído recién preparado y realizar una buena perfusión.

Comience este procedimiento con la anestesia de un ratón C57BL/6 de 12 semanas de edad, como se describe en el protocolo de texto. Confirme la anestesia adecuada pellizcando suavemente la cola. Pegue las patas del ratón en una pila de toallas de papel, con cinta adhesiva.

Sostenga la piel del ratón con fórceps, y corte la piel con un par de tijeras desde el abdomen hasta la parte superior del tórax. Abra la cavidad abdominal, debajo de la caja torácica, con un par de tijeras afiladas. Levante el esternón con fórceps y corte el diafragma.

Luego corte la caja torácica para exponer la cavidad torácica. Corta la vena cava justo encima del hígado con tijeras. Presión perfunde el árbol arterial durante cinco minutos, con solución salina normal pre-enfriada que contiene 40 unidades por mililitro de heparina, a través del ventrículo izquierdo, hasta que los pulmones y el hígado se vuelvan pálidos.

Luego perfunda con 4%paraformaldehído pre-enfriado en PBS durante cuatro minutos. Retire todos los músculos, órganos y grasa, hasta que la aorta esté expuesta. Coloque el ratón bajo un microscopio de disección.

Utilice fórceps delicados y un par de tijeras delicadas para exponer la aorta claramente bajo un microscopio diseccionador, y retire el tejido conectivo a lo largo de la aorta, de la manera más limpia posible. Diseccionar la aorta torácica del corazón al tronco celíaco con un par de tijeras delicadas. Coloque la aorta en un plato de cultivo celular de seis centímetros, con PBS.

Abra la aorta longitudinalmente, primero a lo largo de la curva menor, y luego utilice los microscisores para cortar las tres ramas del arco aórtico, incluyendo el innominado, la carótida común izquierda, y la arteria subclavia izquierda a lo largo de la curva mayor hasta que se cumpla el segmento recto. Permeabilizar la aorta con 1%éter de fenilo de octilo de polioxietileno, en PBS durante 10 minutos. A continuación, bloquee la aorta con un 10% de suero de cabra normal en solución salina tampón que contenga 2,5%polisorbato 20 durante una hora a temperatura ambiente, en una placa de cultivo celular de 12 pozos.

A continuación, incubar la aorta en el tampón de bloqueo que contiene cinco gramos por mililitro de conejo anti-VCAM1, y cinco gramos por mililitro rata anti-VE-Cadherin, durante la noche a cuatro grados Celsius. Después de enjuagar la muestra tres veces con solución de lavado, aplicar los anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia durante una hora a temperatura ambiente, manteniéndose en un lugar oscuro. Enjuague otras tres veces en la solución de lavado.

Contraataque la aorta con DAPI durante 10 minutos, manteniéndose en un lugar oscuro. A continuación, enjuague la aorta manchada tres veces en la solución de lavado. Coloque la aorta en un resbalón de cubierta con la superficie lumenal hacia abajo, y muévala lentamente a la solución de montaje antifada que se ha caído previamente en el resbalón de la cubierta.

Estire suavemente la aorta para mantener la muestra plana. Invierta el resbalón de la cubierta y colótelo en el portaobjetos de vidrio. Tenga cuidado de evitar cualquier burbuja de aire entre la muestra y el vidrio.

Examine la aorta con un microscopio confocal de escaneo láser. Analice las intensidades de color de diferentes canales de la región deseada en las imágenes en face, con el software Image-Pro Plus. En la cara se muestran imágenes de tinción de inmunofluorescencia de células endoteliales vasculares de la aorta del ratón.

En la inmunofluorescencia facial de la proteína de adhesión de células vasculares uno, y la expresión con VE-Cadherin como un marcador endotelial, se muestran bajo diferentes patrones de flujo de diferentes regiones de la aorta del ratón. DAPI también se contrarrestó para mostrar los núcleos celulares para una mejor visualización. Al mirar a través de las pilas Z bajo el microscopio, las células musculares endoteliales y lisas se pueden distinguir fácilmente por su morfología de núcleos celulares.

Los núcleos de células endoteliales tienen forma ovalada, y más grandes que los núcleos de células musculares lisas con forma de husillo. La expresión del VCAM-1 fue más abundante en regiones bajo flujo perturbado, con menor curvatura del arco de la aorta, en comparación con las regiones bajo flujo constante, con mayor curvatura del arco de la aorta, y en la aorta torácica. Aquí las áreas de menor curvatura de una aorta de ratón se indican como áreas de flujo d, y la mayor curvatura y torácica.

Con la modificación correcta, esta técnica también se puede aplicar al análisis de la permeabilidad vascular, y la posición de las macromoléculas en la célula endotelial intima.