Visualización de la estructura de los ganglios linfáticos y la localización celular mediante la microscopía confocal Ex-Vivo

Este protocolo reproducible y fácil de realizar utiliza una estrategia de imágenes de ganglios linfáticos ex-vivo para rastrear el drenaje de anticuerpos fluorescentes administrados in vivo etiquetados a órganos linfoides secundarios locales. La demostración de esta técnica permite una visualización específica del procedimiento, lo que puede facilitar una ejecución exitosa del protocolo. Esta es una técnica muy simple y directa que puede ser realizada por cualquier persona.

El único aspecto desafiante es el manejo del ratón, que requiere un poco de entrenamiento. Esta técnica tiene el beneficio de una mejor preservación del esfuerzo del tejido de velocidad y la viabilidad celular en comparación con los métodos de tinción fluorescente convencionales. El entrenamiento del procedimiento sería Bruna Tatematsu, una técnica del laboratorio.

Diluir los anticuerpos de interés, conjugados con los fluoróforos apropiados, en 100 microlitros de PBS para la toma de imágenes de ganglios linfáticos inguinales, o 50 microlitros de PBS para la toma de imágenes de ganglios linfáticos popliteales. Para la toma de imágenes de ganglios linfáticos inguinales, cargue 100 microlitros del cóctel de anticuerpos en una jeringa de insulina de un mililitro, equipada con una aguja de calibre 30 por media pulgada, e inyecte por vía subcutánea los anticuerpos en el muslo interno del ratón experimental. Para la toma de imágenes de ganglios linfáticos popliteales, inyecte 50 microlitros del cóctel de anticuerpos por vía subcutánea en una almohadilla de pata del animal experimental.

A continuación, devuelva el animal a su caja de origen. Para la recolección inguinal de los ganglios linfáticos drenantes, después de esperar al menos tres horas de la inyección, inmovilizar el ratón en la etapa acrílica con cinta adhesiva y aplicar aceite mineral sobre la piel abdominal. Utilice tijeras de microcirugía estándar y fórceps curvos de microcirugía para hacer una incisión de la piel de línea media en el abdomen desde el pubis hasta el proceso de xifoide, y disociar la musculatura abdominal de la piel.

Hacer incisiones horizontales de la piel en la parte superior e inferior de la línea de incisión vertical, para crear colgajos de la piel en el lado de la inyección, y retraer la piel para visualizar el ganglio linfático. Asegure el colgajo de la piel a la placa de acrílico, y utilice los fórceps para extraer el ganglio linfático de drenaje inguinal esférico translúcido, generalmente bilobular. Para la cosecha popliteal de ganglios linfáticos drenantes, al menos 12 horas después de la inyección, inmovilizar al ratón en la posición propensa en una etapa acrílica.

Aplicar aceite mineral sobre la pantorrilla y la rodilla en el lado inyectado del animal. A continuación, haz una incisión en la línea media en la pantorrilla desde el talón hasta la rodilla, y disocia la musculatura de la pantorrilla de la piel. Exponga a la fosa popliteal.

El ganglio linfático popliteal aparecerá como una esfera translúcida dentro de la fosa. A continuación, extrae el ganglio linfático con los fórceps curvos de microcirugía. Para preparar el ganglio linfático para la toma de imágenes, coloque los órganos enteros en un plato de cultivo de 35 por 10 milímetros con un fondo de vidrio, y use fórceps para eliminar cualquier grasa que lo rodea.

Centra el órgano en el centro del plato y cubre el tejido con un pedazo de limpiaparabrisas delicado empapado en solución salina. Para la toma de imágenes ex vivo, coloque el plato en la ranura del microscopio confocal invertido y utilice la luz convencional del microscopio confocal y el objetivo 4-10X para obtener el enfoque correcto. Cambie de la función de luz al modo láser y utilice una muestra de isótopo, no manchada o no fluorescente para ajustar la potencia, el desplazamiento y la ganancia del láser para eliminar la fluorescencia automática y cualquier tinción no especificada.

Adquiere imágenes bajo los objetivos 4, 10 y 20X centrándote en la estructura de los ganglios linfáticos y la distribución celular y usando una definición de 1024 por 1024 píxeles. A continuación, utilice un programa de software de análisis de imágenes adecuado para separar los canales, agregar la escala y los colores de interés y reconstruir la vista 3D. La poderosa combinación de inmunoetiquetado de células de ganglios linfáticos con anticuerpos anti-CD4 y anti-CD19 y análisis de imágenes confocales permite la localización de células T y B dentro de los ganglios linfáticos inguinales.

En los ganglios linfáticos popliteales, como en el tejido inguinal, los folículos de células B están rodeados por poblaciones de células T, un sello distintivo de la estructura de los ganglios linfáticos. Como se observa en estas imágenes, los fagocitos no internalizan los anticuerpos inyectados, lo que indica que la tinción de los células B y T es específica. Además, la re-reconstrucción del etiquetado indica que la tinción de las células T y B no se superpone, lo que confirma aún más la especificidad de la tinción.

Las células monocelulares se observan a lo largo del ganglio linfático inguinal, incluyendo el seno subcapsular. Con la mayoría de las células mononucleares que expresan CX3XR1, seguidas de las células doblemente positivas CCR2 y CXCR31CCR2. El mismo patrón de distribución celular y fenotipos celulares se observa en el ganglio linfático popliteal.

Ambos ganglios linfáticos también exhiben regiones oscuras sin expresión del receptor de células mononucleares que están ocupadas por linfocitos. Además, las células mononucleares son escasas dentro del área interna de los ganglios linfáticos, permaneciendo concentradas en las áreas externas del tejido, lo que indica que estas células ocupan principalmente el seno subcapsular del ganglio linfático. La mezcla de anticuerpos debe inyectarse con precisión en el tejido subcutáneo para que el sistema linfático drene adecuadamente los anticuerpos contra el ganglio linfático.

Este método se puede aplicar a la biodistribución de fármacos con etiqueta fluorescente y a los estudios de orientación celular de nanopartículas con etiqueta fluorescente.