Name: Visualización de la estructura de los ganglios linfáticos y la localización celular mediante la microscopía confocal Ex-Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Aprenda a visualizar la estructura de ganglios linfáticos y la localización celular mediante microscopía confocal ex-vivo en modelo murino. Esta técnica permite estudiar respuestas inmunitarias con preservación tisular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por el NIH (R01 AI43458 a H.L.W.).

El protocolo fue aprobado por el Comité Permanente de Animales de la Escuela de Medicina de Harvard y Brigham and Women's Hospital, protocolo 2016N000230.
1. Ratones utilizados para el experimento
<ol><li>Utilice ratones machos y hembras de 8 semanas de edad sobre el fondo B6 para administrar la mezcla de anticuerpos.</li>
	<li>Utilice ratones CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT para determinar si las imágenes de LN enteras ex vivo también se pueden aplicar a ratones reportero sin administrar mezcla de anticuerpos, así como para investigar la presencia de células mononucleares, incluida la presentación de antígenos células y fagocitos, y su distribución en el LN. NOTA: Los ratones reportero CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT tienen proteína fluorescente verde (GFP) y proteína fluorescente roja (RFP) insertadas bajo el control de los promotores CX3CR1 y CCR2, respectivamente. Los ratones Reportero se pueden utilizar con o sin la inyección de la mezcla de anticuerpos. Consulte la referencia4 para la inyección de mezcla de anticuerpos en un ratón de reportero. Proceda a la cirugía si no se inyectará ningún anticuerpo.</li>
</ol>2. Preparación e inyección de mezcla de anticuerpos
NOTA: Realice estos pasos en ratones descritos en el paso 1.1.
<ol><li>Diluir 1:10 de violeta brillante (BV) 421 anti-CD4 (GK1.5; 0,2 mg/ml), 1:10 de azul brillante (BB) 515 anti-CD19 (1D3; 0,2 mg/ml) y 1:20 de fiesteesterina (PE) anti-F4/80 (T45-2342; 0,2 mg/ml) en PBS con el volumen final adecuado para inyectar en el muslo interno (a imagen inguinal) o en la pata (a la imagen popliteal) linfa. NOTA: Uso como isotipos: BV421 Ratón IgG2b, k Control de isotipo (R35-38; 0,2 mg/mL); PE Rat IgG2a, Control de Isotipo (R35-95; 0,2 mg/mL); BB515 Rata IgG2a, Control de Isotipos (R35-95; 0,2 mg/ml). Si cambia el anticuerpo de tinción, utilice el isotipo correcto.</li>
	<li>Para la imagen de LN inguinal, inyecte 100 ml de la mezcla de anticuerpos por vía subcutánea en el muslo interno (Figura1A). Alternativamente, inyectar por vía subcutánea de 50 l de mezcla de anticuerpos en la almohadilla de la pata para crear una imagen de LN popal (Figura2A). Utilice delicadas jeringas de insulina de 1 ml (Insulina U-100) con la aguja de 0,30 mm a 13 mm (30 de calibre a 1 x 2 pulgadas). NOTA: Asegúrese de que la inyección para la tinción LN inguinal es subcutánea y no intramuscular (es decir), la mezcla de anticuerpos no se drenará correctamente si se realiza la administración de i.m.</li>
	<li>No anestesiar a los animales antes de la inyección de mezcla de anticuerpos.</li>
	<li>Espere un mínimo de 3 h (dLN inguinal) y 12 h (dLN popliteal) después de la inyección para extraer los órganos.</li>
	<li>Si el etiquetado de células LN no se observa completamente utilizando grandes tintes fluorescentes de polímero como violeta brillante o azul brillante, utilice fluoróforos más pequeños, incluyendo isotiocianato de fluoresceína (FITC), PE y aloficocyanina (APC) como alternativa.</li>
</ol>3. Procedimiento de cirugía para extirpar el ganglio linfático drenante inguinal
<ol><li>Ratones euthanizales utilizando asfixia porCO2 seguida de luxación cervical.</li>
	<li>Inmovilizar ratones en la etapa acrílica con cinta adhesiva y aplicar aceite mineral con un hisopo de algodón en la piel abdominal para evitar la deposición de piel alrededor de la incisión (Figura1B). La eliminación de la piel no es necesaria.</li>
	<li>Realizar una incisión de línea media utilizando tijeras curvas de microcirugía (11,5 cm) y fórceps curvos de microcirugía (12,5 cm) en el abdomen desde el pubis hasta el proceso de xifoide (Figura1C).</li>
	<li>Disociar la musculatura abdominal de la piel (Figura 1D).</li>
	<li>Realice incisiones horizontales de la piel en la parte superior e inferior de la línea de incisión vertical para crear colgajos de piel en el lado de interés (según el lado de la inyección de mezcla de anticuerpos) y agitar la piel para visualizar el ganglio linfático (Figura1E).</li>
	<li>Tape el cierre de la piel en la placa de acrílico (Figura1F).</li>
	<li>Retire el ganglio linfático drenante inguinal utilizando fórceps curvos de microcirugía (Figura1F). El ganglio linfático aparecerá como una esfera translúcida, generalmente bilobular, debajo de la piel.</li>
</ol>4. Procedimiento de cirugía para extirpar el ganglio linfático de drenaje popliteal
<ol><li>Ratones euthanizales utilizando asfixia porCO2 seguida de luxación cervical.</li>
	<li>Inmovilizar ratones en una posición propensa en la etapa acrílica con cinta adhesiva y aplicar aceite mineral con un hisopo de algodón en la pantorrilla y la rodilla (Figura2A-D).</li>
	<li>Realice una incisión de línea media en la pantorrilla desde el talón hasta la rodilla (Figura2E,F).</li>
	<li>Disociar la musculatura de la pantorrilla de la piel (Figura2F,G).</li>
	<li>Exponer la fosa popliteal (Figura2G). El ganglio linfático popliteal aparecerá como una esfera translúcida en la fosa popliteal.</li>
	<li>Retire el ganglio linfático popliteal utilizando fórceps curvos de microcirugía (Figura2G).</li>
	<li>Alternativamente, gire el ratón sobre la posición supina, y acérquese a la fosa popliteal entre el bíceps femoris y semitendinosus para la extirpación del LN popliteal realizando una incisión de línea media en el talón desde el talón hasta la rodilla seguida de la disociación de la pantorrilla musculatura de la piel. NOTA: La fosa popliteal es una depresión poco profunda situada en la parte posterior de la articulación de la rodilla. Abra cuidadosamente para ver el ganglio linfático popliteal.</li>
</ol>5. Preparación de los ganglios linfáticos
<ol><li>Coloque todo el órgano en un recipiente de cultivo con fondo de vidrio (35 mm x 10 mm) y retire la grasa que rodea el órgano utilizando fórceps curvos de microcirugía (Figura1G-I y Figura 2H).</li>
	<li>Centralice el órgano en el centro del plato (Figura1J y Figura 2H).</li>
	<li>Cubra el órgano con un fragmento de delicados limpiaparabrisas de tareas y manténgalo empapado con solución salina a temperatura ambiente 0,9% o solución de tampón de fosfato (Figura1K-M y Figura 2H). NOTA: No es necesario lavar los ganglios linfáticos después de la extracción o realizar la extracción de los ganglios linfáticos en la campana.</li>
</ol>6. Microscopía confocal ex-vivo (Imágenes)
<ol><li>Coloque la placa Petri en la ranura del microscopio confocal invertido (Figura1N y Figura 2H).</li>
	<li>LNdes de imagen bajo un microscopio confocal (Figura1O y Figura 2H).</li>
	<li>En primer lugar, obtener el enfoque correcto utilizando la luz convencional del microscopio confocal con objetivo 4x o 10x. A continuación, cambie de la función de luz al modo láser. NOTA: Si el microscopio confocal no contiene un objetivo 4x, el enfoque se puede obtener perfectamente utilizando el objetivo 10x.</li>
	<li>Ajustar la potencia del láser, el desplazamiento y la ganancia utilizando una muestra de isotipo manchada, no manchada o no fluorescente (Tabla 1) para eliminar la autofluorescencia y las manchas inespecíficas de anticuerpos con etiqueta fluorescente como los utilizados en las imágenes mostradas en este manuscrito (BV-421 anti-CD4, BB515 anti-CD19 y PE anti-F4/80).</li>
	<li>Ajuste las posiciones Z y XY, utilizando el micrométrico y el carro, respectivamente, en el área de interés en el ganglio linfático.</li>
	<li>Adquirir imágenes bajo objetivos 4x, 10x y 20x centrándose en la estructura LN y la distribución celular. Utilice la definición de 1024 x 1024 píxeles. NOTA: Adquirir un mínimo de cinco imágenes en diferentes campos por objetivo por animal.</li>
	<li>Analice imágenes utilizando un software de imagen para separar canales, añadir escala y colores de interés, y reconstruir la vista 3D.</li>
</ol>

<ol><li>Willard-Mack, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+structure%2C+function%2C+and+histology+of+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Normal structure, function, and histology of lymph nodes.</a> Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).</li>
<li>Tas, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antibody+affinity+maturation+in+germinal+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers.</a> Science. 351, 1048-1054 (2016).</li>
<li>David, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Mass+Cytometry+and+Imaging+Analysis+Reveals+Origin%2C+Location%2C+and+Functional+Repopulation+of+Liver+Myeloid+Cells+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Combination of Mass Cytometry and Imaging Analysis Reveals Origin, Location, and Functional Repopulation of Liver Myeloid Cells in Mice.</a> Gastroenterology. 151, 1176-1191 (2016).</li>
<li>Rezende, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gammadelta+T+cells+control+humoral+immune+response+by+inducing+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">gammadelta T cells control humoral immune response by inducing T follicular helper cell differentiation.</a> Nature Communications. 9, 3151(2018).</li>
<li>Nakagaki, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+triple-fluorescent+mouse+strain+allows+a+dynamic+and+spatial+visualization+of+different+liver+phagocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Anais+da+Academia+Brasileira+de+Ciencias%22%5BJournal%5D)">Generation of a triple-fluorescent mouse strain allows a dynamic and spatial visualization of different liver phagocytes in vivo.</a> Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 91 (suppl 1), e20170317(2019).</li>
<li>Ajami, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+reveals+distinct+populations+of+brain+myeloid+cells+in+mouse+neuroinflammation+and+neurodegeneration+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models.</a> Nature Neuroscience. 21, 541-551 (2018).</li>
<li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li>
<li>McElroy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+LYVE-1+antibody+to+image+dynamically+lymphatic+trafficking+of+cancer+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Fluorescent LYVE-1 antibody to image dynamically lymphatic trafficking of cancer cells in vivo.</a> Journal of Surgical Research. 151, 68-73 (2009).</li>
<li>Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+and+antigen+dispersal+landscapes+regulate+T+cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).</li>
<li>Hauser, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+germinal-center+B+cell+migration+in+vivo+reveals+predominant+intrazonal+circulation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns.</a> Immunity. 26, 655-667 (2007).</li>
<li>Allen, C. D., Okada, T., Tang, H. L., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+germinal+center+selection+events+during+affinity+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging of germinal center selection events during affinity maturation.</a> Science. 315, 528-531 (2007).</li>
<li>Arnon, T. I., Horton, R. M., Grigorova, I. L., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+splenic+marginal+zone+B-cell+shuttling+and+follicular+B-cell+egress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualization of splenic marginal zone B-cell shuttling and follicular B-cell egress.</a> Nature. 493, 684-688 (2013).</li>
<li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435, 969-973 (2005).</li>
<li>Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W. Jr, Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+shuttling+of+marginal+zone+B+cells+facilitates+antigen+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport.</a> Nature Immunology. 9, 54-62 (2008).</li>
<li>Pereira, J. P., An, J., Xu, Y., Huang, Y., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoid+receptor+2+mediates+the+retention+of+immature+B+cells+in+bone+marrow+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cannabinoid receptor 2 mediates the retention of immature B cells in bone marrow sinusoids.</a> Nature Immunology. 10, 403-411 (2009).</li>
<li>Nakagaki, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+and+metabolic+shifts+during+neonatal+development+reprogram+liver+identity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Immune and metabolic shifts during neonatal development reprogram liver identity and function.</a> Journal of Hepatology. (6), 1294-1307 (2018).</li>
<li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+Genome+Editing+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li>
<li>Roozendaal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conduits+mediate+transport+of+low-molecular-weight+antigen+to+lymph+node+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles.</a> Immunity. 30, 264-276 (2009).</li>
<li>Sarder, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-near-infrared+multiphoton+microscopy+interrogates+intact+tissues+at+deeper+imaging+depths+than+conventional+single-+and+two-photon+near-infrared+excitation+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">All-near-infrared multiphoton microscopy interrogates intact tissues at deeper imaging depths than conventional single- and two-photon near-infrared excitation microscopes.</a> Journal of Biomedical Optics. 18, 106012(2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La combinación de imágenes con otras técnicas, incluida la biología molecular y el inmunofenotipado en alta dimensión, ha mejorado nuestra capacidad de investigar las células inmunitarias en su contexto nativo. De hecho, mientras que otros enfoques pueden requerir la digestión de los tejidos y el aislamiento celular, lo que puede conducir a la pérdida de la integridad del tejido, el uso de imágenes in vivo o ex vivo otorga una gran ventaja en la investigación de diferentes subtipos celulares de forma geográfica<sup class...

Los ganglios linfáticos (LN) son órganos en forma de ovoide ampliamente presentes en todo el cuerpo con la función crucial de puentear las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas. Los LN filtran la linfa con el fin de identificar partículas extrañas y células cancerosas para montar una respuesta inmune contra ellos1. Las células que presentan antígenos (AAP), las células T y las células B trabajan junto con la generación de anticuerpos específicosde antígenos (inmunidad humoral) y linfocitos citotóxicos (inmunidad celular) para eliminar las partículas extrañas y las células cancerosas 2. Por lo tanto, comprender la dinámica de las células inmunitarias presentes en el sistema linfático tendrá importantes implicaciones para el desarrollo de la vacuna y la inmunoterapia contra el cáncer.
La llegada de poderosos microscopios -incluyendo nuevos microscopios confocales y de superresolución- ha permitido un avance extraordinario en la comprensión de cómo se comportan las diferentes poblaciones de células inmunitarias en su entorno nativo3. Ahora es posible crear una imagen de varios subtipos celulares simultáneos utilizando unacombinación de sondas con ratones modificados genéticamente que expresan proteínas fluorescentes bajo el control de objetivos específicos 4,5. De hecho, las técnicas de alta dimensión, incluida la citometría de masas y el análisis de flujo multiparamétrico han sido cruciales para ampliar nuestros conocimientos sobre la compartimentación y funcionalidad de diferentes células inmunitarias en la salud y la enfermedad6, 7. Sin embargo, para preparar muestras para estas técnicas, los tejidos necesitan digestión y las células se separan de su entorno natural para ser analizadas en suspensiones celulares. Para superar estas limitaciones y permitir una mejor traducción en biología, el objetivo del protocolo propuesto aquí es aplicar una metodología sencilla para la imagen de ganglios linfáticos enteros ex vivo utilizando microscopios confocales con el beneficio de la mejora de la velocidad, el tejido conservación de la estructura y viabilidad celular en comparación con la tinción de inmunofluorescencia convencional. Mediante el uso de este enfoque, pudimos demostrar que los ratones deficientes para las células T,un subtipo de linfocitos T involucrados en la defensa temprana del huésped contra patógenos 4, han comprometido folículos y zonas de células T en comparación con ratones de tipo salvaje. Estos hallazgos nos permitieron realizar un estudio en el que demostramos que las células T desempeñan un papel fundamental en la homeostasis de los órganos linfoides y la respuesta inmune humoral4. Además, este protocolo proporciona una vía fisiológica para que las sondas y los anticuerpos lleguen al ganglio linfático, ya que se administran por vía subcutánea y se disipan a través de la circulación linfática tisular, basándose en informes anteriores que se utilizan en el etiquetado in situ con anticuerpos para visualizar estructuras asociadas a linfáticos8,9, dinámica central germinal10,11,12, y objetivos fácilmente accesibles para el flujo sanguíneo13 ,14,15.

<table><tbody><tr><td>BV421 anti-CD4</td><td>BD Horizon</td><td>562891</td><td>GK1.5; 0.2 mg mL-1</td></tr><tr><td>BB515 anti-CD19</td><td>BD Horizon</td><td>564509</td><td>1D3; 0.2 mg mL-1</td></tr><tr><td>BB515 Rat IgG2a, &kappa; Control de Isotipo</td><td>BD Horizon</td><td>564418</td><td>R35-95; 0,2 mg mL-1</td></tr><tr><td>BV421 Ratón IgG2b, K Control de Isotipo</td><td>BD Horizon</td><td>562603</td><td>R35-38 0,2 mg mL-1</td></tr><tr><td>Cellview placa de cultivo</td><td>Greiner-Bio</td><td></td><td>627861 35x10 mm con fondo de cristal</td></tr><tr><td>Jeringas de insulina</td><td>BD Plastipak-Insulina</td><td></td> <td>U-100</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech Science Brand</td><td>7557</td><td>tamaño 21 x 20 cm / 100 hojas por caja</td></tr><tr><td>Pinzas curvas para microcirugía</td><td>WEP Instrumentos quirúrgicos</td><td>hechos a medida</td><td>12,5 cm</td></tr><tr><td>Tijeras curvas para microcirugía</td><td>WEP Instrumentos quirúrgicos</td><td>a medida</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Aguja BD PrecisionGlide-30</td><td></td> de 11,5 cm calibre y <td>tiempos; &frac12; pulgadas</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Te + cabeza confocal A1R</td><td>Nikon</td><td>-</td><td>cargado con 4 líneas láser principales (405, 488, 543 y 647 nm)</td></tr><tr><td>PE anti-F4/80</td><td>BD Pharmigen</td><td>565410</td><td>T45-2342; 0,2 mg mL-1</td></tr><tr><td>PE Rata IgG2a, &kappa; Control de isotipo</td><td>BD Pharmigen</td><td>553930</td><td>R35-95; 0,2 mg mL-1</td></tr><tr><td>Microscopio confocal Zeiss LSM 710</td><td>Zeiss-cargado</td><td></td> <td>con 4 líneas láser principales (405, 488, 543 y 647 nm)</td></tr></tbody></table>

visualización de la estructura de los ganglios linfáticos y la localización celular mediante la microscopía confocal ex-vivo

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Los ganglios linfáticos (LN) son órganos diseminados dentro del cuerpo, donde las respuestas inmunitarias innatas pueden conectarse con la inmunidad adaptativa. De hecho, los LN están estratégicamente interpuestos en la trayectoria de los vasos linfáticos, permitiendo el contacto íntimo de antígenos tisulares con todas las células inmunitarias residentes en el LN. Por lo tanto, la comprensión de la composición celular, distribución, ubicación e interacción utilizando imágenes LN enteras ex vivo saque a la forma en que el cuerpo coordina las respuestas inmunitarias locales y sistémicas. Este protocolo muestra una estrategia de imagen ex vivo después de una administración in vivo de anticuerpos con etiqueta fluorescente que permite una metodología muy reproducible y fácil de realizar mediante el uso de microscopios confocales convencionales y reactivos de stock. A través de la inyección subcutánea de anticuerpos, es posible etiquetar diferentes poblaciones celulares en lNes drenantes sin afectar a las estructuras tisulares que pueden ser potencialmente dañadas por una técnica de microscopía de inmunofluorescencia convencional.

Este manuscrito muestra técnicas para eliminar los ganglios linfáticos inguinales y popliteales sin dañar su estructura después de la inyección de anticuerpos con etiqueta fluorescente para manchar poblaciones celulares específicas en estos órganos (Figura1 y Figura 2 ).
La poderosa combinación de inmunoetiquetado de células LN con BV421 anti-CD4 y BB515 anti-CD19 y análisis de imágenes confocales definió la localización de células T ...

Este protocolo describe una técnica para tomar imágenes de diferentes poblaciones celulares en el drenaje de los ganglios linfáticos sin alteraciones en la estructura del órgano.

Visualización de la estructura de los ganglios linfáticos y la localización celular mediante la microscopía confocal Ex-Vivo

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Este protocolo reproducible y fácil de realizar utiliza una estrategia de imágenes de ganglios linfáticos ex-vivo para rastrear el drenaje de anticuerpos fluorescentes administrados in vivo etiquetados a órganos linfoides secundarios locales. La demostración de esta técnica permite una visualización específica del procedimiento, lo que puede facilitar una ejecución exitosa del protocolo. Esta es una técnica muy simple y directa que puede ser realizada por cualquier persona.El único aspecto desafiante es el manejo del ratón, que requiere un poco de entrenamiento. Esta técnica tiene el beneficio de una mejor preservación del esfuerzo del tejido de velocidad y la viabilidad celular en comparación con los métodos de tinción fluorescente convencionales. El entrenamiento del procedimiento sería Bruna Tatematsu, una técnica del laboratorio.Diluir los anticuerpos de interés, conjugados con los fluoróforos apropiados, en 100 microlitros de PBS para la toma de imágenes de ganglios linfáticos inguinales, o 50 microlitros de PBS para la toma de imágenes de ganglios linfáticos popliteales. Para la toma de imágenes de ganglios linfáticos inguinales, cargue 100 microlitros del cóctel de anticuerpos en una jeringa de insulina de un mililitro, equipada con una aguja de calibre 30 por media pulgada, e inyecte por vía subcutánea los anticuerpos en el muslo interno del ratón experimental. Para la toma de imágenes de ganglios linfáticos popliteales, inyecte 50 microlitros del cóctel de anticuerpos por vía subcutánea en una almohadilla de pata del animal experimental.A continuación, devuelva el animal a su caja de origen. Para la recolección inguinal de los ganglios linfáticos drenantes, después de esperar al menos tres horas de la inyección, inmovilizar el ratón en la etapa acrílica con cinta adhesiva y aplicar aceite mineral sobre la piel abdominal. Utilice tijeras de microcirugía estándar y fórceps curvos de microcirugía para hacer una incisión de la piel de línea media en el abdomen desde el pubis hasta el proceso de xifoide, y disociar la musculatura abdominal de la piel.Hacer incisiones horizontales de la piel en la parte superior e inferior de la línea de incisión vertical, para crear colgajos de la piel en el lado de la inyección, y retraer la piel para visualizar el ganglio linfático. Asegure el colgajo de la piel a la placa de acrílico, y utilice los fórceps para extraer el ganglio linfático de drenaje inguinal esférico translúcido, generalmente bilobular. Para la cosecha popliteal de ganglios linfáticos drenantes, al menos 12 horas después de la inyección, inmovilizar al ratón en la posición propensa en una etapa acrílica.Aplicar aceite mineral sobre la pantorrilla y la rodilla en el lado inyectado del animal. A continuación, haz una incisión en la línea media en la pantorrilla desde el talón hasta la rodilla, y disocia la musculatura de la pantorrilla de la piel. Exponga a la fosa popliteal.El ganglio linfático popliteal aparecerá como una esfera translúcida dentro de la fosa. A continuación, extrae el ganglio linfático con los fórceps curvos de microcirugía. Para preparar el ganglio linfático para la toma de imágenes, coloque los órganos enteros en un plato de cultivo de 35 por 10 milímetros con un fondo de vidrio, y use fórceps para eliminar cualquier grasa que lo rodea.Centra el órgano en el centro del plato y cubre el tejido con un pedazo de limpiaparabrisas delicado empapado en solución salina. Para la toma de imágenes ex vivo, coloque el plato en la ranura del microscopio confocal invertido y utilice la luz convencional del microscopio confocal y el objetivo 4-10X para obtener el enfoque correcto. Cambie de la función de luz al modo láser y utilice una muestra de isótopo, no manchada o no fluorescente para ajustar la potencia, el desplazamiento y la ganancia del láser para eliminar la fluorescencia automática y cualquier tinción no especificada.Adquiere imágenes bajo los objetivos 4, 10 y 20X centrándote en la estructura de los ganglios linfáticos y la distribución celular y usando una definición de 1024 por 1024 píxeles. A continuación, utilice un programa de software de análisis de imágenes adecuado para separar los canales, agregar la escala y los colores de interés y reconstruir la vista 3D. La poderosa combinación de inmunoetiquetado de células de ganglios linfáticos con anticuerpos anti-CD4 y anti-CD19 y análisis de imágenes confocales permite la localización de células T y B dentro de los ganglios linfáticos inguinales.En los ganglios linfáticos popliteales, como en el tejido inguinal, los folículos de células B están rodeados por poblaciones de células T, un sello distintivo de la estructura de los ganglios linfáticos. Como se observa en estas imágenes, los fagocitos no internalizan los anticuerpos inyectados, lo que indica que la tinción de los células B y T es específica. Además, la re-reconstrucción del etiquetado indica que la tinción de las células T y B no se superpone, lo que confirma aún más la especificidad de la tinción.Las células monocelulares se observan a lo largo del ganglio linfático inguinal, incluyendo el seno subcapsular. Con la mayoría de las células mononucleares que expresan CX3XR1, seguidas de las células doblemente positivas CCR2 y CXCR31CCR2. El mismo patrón de distribución celular y fenotipos celulares se observa en el ganglio linfático popliteal.Ambos ganglios linfáticos también exhiben regiones oscuras sin expresión del receptor de células mononucleares que están ocupadas por linfocitos. Además, las células mononucleares son escasas dentro del área interna de los ganglios linfáticos, permaneciendo concentradas en las áreas externas del tejido, lo que indica que estas células ocupan principalmente el seno subcapsular del ganglio linfático. La mezcla de anticuerpos debe inyectarse con precisión en el tejido subcutáneo para que el sistema linfático drene adecuadamente los anticuerpos contra el ganglio linfático.Este método se puede aplicar a la biodistribución de fármacos con etiqueta fluorescente y a los estudios de orientación celular de nanopartículas con etiqueta fluorescente.

visualizing-lymph-node-structure-cellular-localization-using-ex-vivo

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

De dos fotones de imágenes ha descubierto la motilidad de linfocitos y las interacciones celulares en el ganglio linfático en condiciones basales y durante una respuesta inmune 1. En este caso, se demuestra la transferencia adoptiva de células T, el aislamiento de los ganglios linfáticos, y la motilidad de imágenes de células CD4 + T en los ganglios linfáticos explantados.

La disección y 2-Photon imagen de los ganglios linfáticos periféricos en ratones

Este protocolo describe un método para células T de imagen fluorescente introducido en rodajas los ganglios linfáticos. La técnica permite en tiempo real, análisis de la migración de las células T con las tradicionales de fluorescencia de campo amplio o microscopios confocal.

Ex vivo de imágenes de células T en los ganglios linfáticos murino Rebanadas con campo amplio y microscopios confocal

Los recientes avances en microscopía de dos fotones han permitido en tiempo...

Imagen intravital del nodo linfático poplíteo ratón

Recientemente desarrollados utilizando técnicas de imagen de fluorescencia en el infrarrojo cercano (NIRF) puede ayudar a dilucidar el papel del sistema linfático juega en la metástasis del cáncer, la respuesta inmune, la reparación de heridas, y otras enfermedades asociadas linfático.

No invasiva imágenes ópticas de la vasculatura linfática de un ratón

Este video muestra una técnica de disección para recolectar ganglios linfáticos poplíteos drenantes de las patas traseras del ratón. Los ganglios linfáticos desempeñan un papel fundamental en la creación de puentes entre la inmunidad innata y la adaptativa, y la recolección de ganglios linfáticos intactos, con una estructura de tejido preservada y viabilidad celular, puede ayudar a estudiar las respuestas inmunitarias locales y sistémicas.

Un método de disección para recolectar ganglios linfáticos de drenaje poplíteo murino para obtener imágenes ex vivo

De alta resolución de imagen intravital con mejor contraste de hasta 120 m de profundidad en los ganglios linfáticos de ratones adultos se consigue modular espacialmente el patrón de excitación de un multi-focal del microscopio de dos fotones. En 100 m de profundidad se midió resoluciones de 487 nm (laterales) y 551 nm (axial), eludiendo así los límites de dispersión y difracción.

Muy resuelto Microscopía intravital rayas-iluminación de centros germinales

La matriz extracelular se somete a la remodelación sustancial durante la cicatrización de heridas, la inflamación y la tumorigénesis. Se presenta un novedoso enfoque de inmunofluorescencia microscopía intravital de visualizar la dinámica de fibrilar, así como componentes de la matriz de tipo malla con una alta resolución espacial y temporal mediante epifluorescencia o microscopía de dos fotones.

A largo plazo intravital Inmunofluorescencia imágenes de tejido Componentes de Matriz con epifluorescencia y microscopía de dos fotones

Este protocolo describe un método de imagen residente tumor-infiltración T CD8 células con anticuerpos fluorescente acoplados dentro de rebanadas de tumor de pulmón humano. Esta técnica permite el análisis en tiempo real de la migración de células T CD8 usando microscopia confocal.

Ex Vivo Proyección de imagen de los linfocitos de T CD8 residente en Tumor de pulmón humano rebanadas utilizando Microscopía Confocal

Se presenta un protocolo que combina la limpieza de tejidos con la microscopía de fluorescencia de láminas de luz (LSFM) para obtener imágenes tridimensionales y de resolución celular de los vasos linfáticos y ganglios linfáticos (LN) que recogen el líquido cefalorraquídeo (LC) y el líquido epidural espinal.

Imágenes tridimensionales de la vasculatura y el drenaje linfáticos vertebrales utilizando iDISCO+ y microscopía de fluorescencia de láminas de luz

Aquí se presenta un protocolo para evaluar los vasos linfáticos meníngeos (MLVs) de ratón, que desempeñan un papel importante en múltiples enfermedades neurológicas. El objetivo de este protocolo es proporcionar un método integrado que permita tanto la evaluación funcional del drenaje de trazadores como la caracterización morfológica detallada de la red de MLVs dorsales.

Protocolo integrado para la evaluación de linfáticos meníngeos: inyección de cisterna magna, imagen de ganglios linfáticos, disección meníngea y tinción de montaje completo

Aprenda a visualizar la estructura de ganglios linfáticos y la localización celular mediante microscopía confocal ex-vivo en modelo murino. Esta técnica permite estudiar respuestas inmunitarias con preservación tisular.

Visualización de la estructura de los ganglios linfáticos y la localización celular mediante la microscopía confocal Ex-Vivo

Explorar más videos