Name: Biosíntesis de un Flavonol de un Flavanone estableciendo una cascada bienimática de un solo pozo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Aprende la biosíntesis de flavonoles a partir de flavanonas mediante una cascada bienimática de un solo pozo. Este método eficiente y rentable ofrece gran potencial industrial para la producción de metabolitos secundarios.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue financiado por los Fondos de Start-up de Profesores Especialmente Nombrados de la Universidad de Yangzhou, los Fondos de Start-up del Profesor Especialmente Nombrado de Jiangsu, el Proyecto Six Talent Peaks en la Provincia de Jiangsu (Grant No. 2014-SWYY-016) y un Proyecto financiado por el Programa Académico Prioritario Desarrollo de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu (Medicina Veterinaria). Agradecemos al Centro de Pruebas de la Universidad de Yangzhou para los análisis HPLC y MS de flavonoides.

<ol><li>Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavonoids%3A+biosynthesis%2C+biological+functions%2C+and+biotechnological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications.</a> Frontiers in Plant Science. 3, 222(2012).</li>
<li>Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+of+flavonol+synthase+and+flavonol+contents+during+grape+berry+development%5BTitle%5D)+AND+%22European+Food+Research+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Changes of flavonol synthase and flavonol contents during grape berry development.</a> European Food Research and Technology. 237 (4), 529-540 (2013).</li>
<li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthocyanins+and+flavonols+are+responsible+for+purple+color+of+Lablab+purpureus+%28L.%29+sweet+pods%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Anthocyanins and flavonols are responsible for purple color of Lablab purpureus (L.) sweet pods.</a> Plant Physiology and Biochemistry. 103, 183-190 (2016).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+class+of+flavonol-based+anti-prostate+cancer+agents%3A+Design%2C+synthesis%2C+and+evaluation+in+cell+models%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">A new class of flavonol-based anti-prostate cancer agents: Design, synthesis, and evaluation in cell models.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (17), 4241-4245 (2016).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Wnt+signaling+activity+for+growth+suppression+induced+by+quercetin+in+4T1+murine+mammary+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Regulation of Wnt signaling activity for growth suppression induced by quercetin in 4T1 murine mammary cancer cells.</a> International Journal of Oncology. 43 (4), 1319-1325 (2013).</li>
<li>Kimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant+activities+and+structural+characterization+of+flavonol+O-glycosides+from+seeds+of+Japanese+horse+chestnut+%28Aesculus+turbinata+BLUME%29%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Antioxidant activities and structural characterization of flavonol O-glycosides from seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME).</a> Food Chemistry. 228, 348-355 (2017).</li>
<li>Cassidy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+dietary+anthocyanin+and+flavonol+intakes+are+associated+with+anti-inflammatory+effects+in+a+population+of+US+adults%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Higher dietary anthocyanin and flavonol intakes are associated with anti-inflammatory effects in a population of US adults.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 102 (1), 172-181 (2015).</li>
<li>Chao, H. C., Tsai, P. F., Lee, S. C., Lin, Y. S., Wu, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Myricetin-Containing+Ethanol+Solution+on+High-Fat+Diet+Induced+Obese+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">Effects of Myricetin-Containing Ethanol Solution on High-Fat Diet Induced Obese Rats.</a> Journal of Food Science. 82 (8), 1947-1952 (2017).</li>
<li>Serban, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Quercetin+on+Blood+Pressure%3A+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis+of+Randomized+Controlled+Trials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Effects of Quercetin on Blood Pressure: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials.</a> Journal of the American Heart Association. 5 (7), (2016).</li>
<li>Nakagawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+memory+recall+by+quercetin+in+rodent+contextual+fear+conditioning+and+human+early-stage+Alzheimer%27s+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Improvement of memory recall by quercetin in rodent contextual fear conditioning and human early-stage Alzheimer's disease patients.</a> Neuroreport. 27 (9), 671-676 (2016).</li>
<li>Muthukrishnan, S. D., Kaliyaperumal, A., Subramaniyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+determination+of+flavonoids%2C+carotenoids+and+chlorophyll+concentration+in+Cynodon+dactylon+%28L.%29+by+HPLC+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Product+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and determination of flavonoids, carotenoids and chlorophyll concentration in Cynodon dactylon (L.) by HPLC analysis.</a> Natural Product Research. 29 (8), 785-790 (2015).</li>
<li>Agar, O. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Studies+on+Phenolic+Composition%2C+Antioxidant%2C+Wound+Healing+and+Cytotoxic+Activities+of+Selected+Achillea+L.+Species+Growing+in+Turkey%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Comparative Studies on Phenolic Composition, Antioxidant, Wound Healing and Cytotoxic Activities of Selected Achillea L. Species Growing in Turkey.</a> Molecules. 20 (10), 17976-18000 (2015).</li>
<li>Yang, R. Y., Lin, S., Kuo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Content+and+distribution+of+flavonoids+among+91+edible+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22Asia+Pacific+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Content and distribution of flavonoids among 91 edible plant species.</a> Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. 17, 275-279 (2008).</li>
<li>Tang, L. J., Zhang, S. F., Yang, J. Z., Gao, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Synthetic+Methods+of+Flavones%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">New Synthetic Methods of Flavones.</a> Chinese Journal of Organic Chemistry. 24 (8), 882-889 (2004).</li>
<li>Lu, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+luteolin+and+kaempferol+%28author%27s+transl%29%5BTitle%5D)+AND+%22Yao+Xue+Xue+Bao%22%5BJournal%5D)">Synthesis of luteolin and kaempferol (author's transl).</a> Yao Xue Xue Bao. 15 (8), 477-481 (1980).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Optimization+of+an+In+vitro+Multienzyme+Synthetic+System+for+Production+of+Kaempferol+from+Naringenin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development and Optimization of an In vitro Multienzyme Synthetic System for Production of Kaempferol from Naringenin.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (31), 8272-8279 (2018).</li>
<li>Malla, S., Pandey, R. P., Kim, B. G., Sohng, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regiospecific+modifications+of+naringenin+for+astragalin+production+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (9), 2525-2535 (2013).</li>
<li>Zhu, S., Wu, J., Du, G., Zhou, J., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+synthesis+of+eriodictyol+from+L-tyrosine+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 3072-3080 (2014).</li>
<li>Trantas, E., Panopoulos, N., Ververidis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+of+the+complete+pathway+leading+to+heterologous+biosynthesis+of+various+flavonoids+and+stilbenoids+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering of the complete pathway leading to heterologous biosynthesis of various flavonoids and stilbenoids in Saccharomyces cerevisiae.</a> Metabolic Engineering. 11 (6), 355-366 (2009).</li>
<li>Miyahisa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+biosynthesis+of+flavones+and+flavonols+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Combinatorial biosynthesis of flavones and flavonols in Escherichia coli.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 71 (1), 53-58 (2006).</li>
<li>Leonard, E., Yan, Y., Koffas, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+a+P450+flavonoid+hydroxylase+for+the+biosynthesis+of+plant-specific+hydroxylated+flavonols+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli.</a> Metabolic Engineering. 8 (2), 172-181 (2006).</li>
<li>Koopman, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+production+of+the+flavonoid+naringenin+in+engineered+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">De novo production of the flavonoid naringenin in engineered Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 11, 155(2012).</li>
<li>Winkel-Shirley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavonoid+biosynthesis.+A+colorful+model+for+genetics%2C+biochemistry%2C+cell+biology%2C+and+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology.</a> Plant Physiology. 126 (2), 485-493 (2001).</li>
<li>Duan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+and+engineering+of+kaempferol+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis and engineering of kaempferol in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 165(2017).</li>
<li>Cheng, Q., Xiang, L., Izumikawa, M., Meluzzi, D., Moore, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+total+synthesis+of+enterocin+polyketides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic total synthesis of enterocin polyketides.</a> Nature Chemical Biology. 3 (9), 557-558 (2007).</li>
<li>Connolly, M. A., Clausen, P. A., Lazar, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+RNA+from+plant+tissue+using+trizol%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of RNA from plant tissue using trizol.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+RNA+from+cells+and+tissues+by+Acid+phenol-guanidinium+thiocyanate-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Purification of RNA from cells and tissues by Acid phenol-guanidinium thiocyanate-chloroform extraction.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+cDNA+Libraries+Stage+1%3A+Synthesis+of+First-strand+cDNA+Catalyzed+by+Reverse+Transcriptase%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Construction of cDNA Libraries Stage 1: Synthesis of First-strand cDNA Catalyzed by Reverse Transcriptase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+cloning+into+plasmid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directional cloning into plasmid vectors.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Cloned+Genes+in+E.+coli+Using+IPTG-inducible+Promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Expression of Cloned Genes in E. coli Using IPTG-inducible Promoters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Histidine-tagged+Proteins+by+Immobilized+Ni2%2B+Absorption+Chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Purification of Histidine-tagged Proteins by Immobilized Ni2+ Absorption Chromatography.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li>
<li>Halbwirth, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+flavonoid+enzyme+activities+in+tissues+of+fruit+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Measuring flavonoid enzyme activities in tissues of fruit species.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 4983-4987 (2009).</li>
<li>Prescott, A. G., Stamford, N. P., Wheeler, G., Firmin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+properties+of+a+recombinant+flavonol+synthase+from+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">In vitro properties of a recombinant flavonol synthase from Arabidopsis thaliana.</a> Phytochemistry. 60 (6), 589-593 (2002).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Un buen número de estudios se centran en la derivación de flavonols debido a su posible aplicación en la atención de la salud y la industria alimentaria. Sin embargo, la extracción tradicional de plantas utilizando disolventes orgánicos y síntesis química poseen desventajas intrínsecas, que restringen su uso en la producción de flavonols. Aquí, informamos de un método detallado para producir un flavonol a partir de una flavanona en una olla estableciendo una cascada bienimática in vitro. Los pasos críticos de este protoc...

Los flavonols son una subclase importante de flavonoides vegetales y participan en el desarrollo de plantas y pigmentación1,2,3. Más importante aún, estos compuestos poseen una amplia gama de actividades beneficiosas para la salud, tales como contraelcancero4,5, antioxidante6, antiinflamatorio7, antiobesidad8, antihipertensivo9 , y las propiedades de memoria10,lo que conduce a un gran número de estudios sobre estos metabolitos secundarios derivados de plantas. Tradicionalmente, estos compuestos se derivan principalmente de la extracción de plantas utilizando disolventes orgánicos. Sin embargo, debido a su muy bajo contenido en plantas11,12,13, el costo de producción para la mayoría de los flavonols sigue siendo alto, lo que impone grandes restricciones a su aplicación en la salud y los alimentos Industria.
Durante las últimas décadas, los científicos han desarrollado un buen número de métodos para derivar flavonoides14,15. Sin embargo, la síntesis química de estas moléculas complicadas posee una variedad de desventajas intrínsecas16. Requiere no sólo reactivos tóxicos y condiciones de reacción extremas, sino también muchos pasos para producir un compuesto flavonoides objetivo14,17. Además, otro desafío importante en esta estrategia es la síntesis quiral de moléculas flavonoides activas. Por lo tanto, no es una estrategia ideal para producir flavonoides a escala comercial a través de la síntesis química16,17.
Recientemente, los científicos han desarrollado una estrategia alternativa prometedora para producir estos complicados compuestos naturales mediante la ingeniería de microbios con una vía para la biosíntesis de flavonoides18,19,20, 21 , 22, que ha sido descifrado con éxito en las plantas23. Por ejemplo, Duan y otros introdujeron una vía biosintética en la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae para producir kaempferol (KMF)24. Malla et al. produjeron astracpuedeína, un flavonol glucosilado, mediante la introducción deflavanona 3-hidroxilasa (f3h), flavonol sintasa (fls1), y UDP-glucosa:flavonoide 3-O-glucosidasa UGT78K1 genes en Escherichia coliBL21(DE3)17. A pesar de que hay bastantes paradigmas, no todos los microbios genéticamente modificados producen los productos de interés debido a la complejidad de una plataforma celular, la incompatibilidad entre los elementos genéticos sintetizados artificialmente y los anfitriones, el efecto de los productos objetivo contra las células huésped, y la inestabilidad de un sistema celular de ingeniería en sí16.
Otra estrategia alternativa prometedora para la producción de flavonoides es establecer una cascada multienzimática in vitro. Cheng y otros. han informado de que los policítlos de enterocina se pueden sintetizar con éxito mediante el montaje de una vía enzimática completa en una olla25. Esta estrategia sintética sin células elude las restricciones de una fábrica de producción microbiana y por lo tanto es factible para producir algunos flavonoides en gran cantidad16.
Recientemente, hemos desarrollado con éxito un sistema sintético de bienzima para convertir la naringenina (NRN) en KMF en una olla16. Aquí, describimos este sistema con grandes detalles y los métodos involucrados en el análisis de los productos. También presentamos dos ejemplos que utilizan este sistema para producir KMF a partir de NRN y quercetina (QRC) de eriodictyol (ERD). Además, discutimos los pasos cruciales de este método y las futuras direcciones de investigación en la biosíntesis de flavonoides.

<table><tbody><tr><td>2&veces; Pfu MasterMix</td><td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td><td>CW0717A</td><td>amplificación de genes por PCR con alta fidelidad</td></tr><tr><td>Agilent 1200 Series RRLC system con un sistema Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS</td><td>Agilent Technologies, Inc</td><td>N/A</td><td>un equipo para el análisis de flavonoides por HPLC/MS</td></tr><tr><td>Agilent MassHunter Workstation (versión B.03.01)</td><td>Agilent Technologies, Inc</td><td>N/A</td><td>un software para la recopilación de datos del sistema RRLC de la serie Agilent 1200 con un sistema Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS</td></tr><tr><td>dihidrokaempferol</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td><td>91216</td><td>producto intermedio para producir kaempferol a partir de naringenina</td></tr><tr><td>dihidroquercetina</td><td>Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine</td><td>PCS0371</td><td>producto intermedio para producir quercetina a partir de eriodictyol</td></tr><tr><td>Kit de limpieza de ADN</td><td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td><td>CW2301</td><td>purificación de ADN eriodictyol amplificado por PCR o purificado en gel</td></tr><tr><td></td><td>Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd.</td><td>B21160</td><td>sustrato para la producción de quercetina</td></tr><tr><td>Escherichia coli BL21(DE3)</td><td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td><td>CW0809</td><td>cepa de bacterias para expresar genes diana</td></tr><tr><td>Escherichia coli DH5&alpha;</td><td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td><td>CW0808</td><td>cepa de bacterias para la proliferación de plásmidos</td></tr><tr><td>FreeZone 1 Liter Benchtop Sheetze-dry</td><td>Labconco Corporation 7740020</td><td></td><td>un equipo para la liofilización de flavonoides disueltos en solvente orgánico</td></tr><tr><td>Kit de extracción de gel</td><td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td><td>CW2302</td><td>purificación de una banda de ADN de un sistema</td></tr> <tr><td></td><td>de imágenes en gel de agarosaShanghái Tanon Ciencia & Tecnología Co. Ltd.</td><td>Tanon- 2500</td><td>un equipo para la visualización de la banda de ADN en un gel de agarosa o una mancha de flavonoide en una placa TLC de poliamida</td></tr><tr><td>GenElute Plasmid Miniprep Kit</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td><td>PLN350-1KT</td><td>minipreparación de plásmidos</td></tr><tr><td>kaempferol</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td><td>60010</td><td>producto de reacción final y sustancia estándar</td></tr><tr><td>Análisis cuantitativo, MassHunter (versión B.01.04)</td><td>Agilent Technologies, Inc</td><td>N/A</td><td>un software para el análisis de datos de HPLC/LC/MS</td></tr><tr><td>NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-8000-GL</td><td>un equipo para la determinación de la concentración de ADN/</td></tr><tr><td>ARN naringenina</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td><td>N5893</td><td>sustrato para la producción de kaempferol</td></tr><tr><td>Ni-IDA Agarose Resin</td><td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td><td>CW0010</td><td>purificación de proteínas de fusión marcadas con His</td></tr><tr><td>pET-32a(+)</td><td>Novagen</td><td>69015-3</td><td>plásmido para clonación y expresión de genes diana</td></tr><tr><td>secuenciación de plásmidos</td><td>GENEWIZ Suzhou</td><td>N/A</td><td>secuenciación de plásmidos recombinantes</td></tr><tr><td>síntesis de cebadores</td><td>GENEWIZ Suzhou</td><td>N/A</td><td>síntesis de cebadores de PCR</td></tr><tr><td>quercetina</td><td>Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.</td><td>Q111273</td><td>producto final de la reacción y sustancia estándar</td></tr><tr><td>Kit de síntesis de ADNc</td><td>SuperRT Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td><td>CW0741</td><td>síntesis de la primera hebra de ADNc a partir de ARN</td></tr><tr><td>total ADN T4 Ligasa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EL0016</td><td>ligadura de un inserto en un vector linealizado ADN</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td>aislamiento de ARN total</td></tr><tr><td>Vector NTI Advance</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605099</td><td>un software para el diseño de cebadores de PCR y el análisis de secuencias de ADN</td></tr><tr><td>Xcalibur v2.0.7</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td>un software para el análisis de datos de HPLC</td></tr></tbody></table>

biosíntesis de un flavonol de un flavanone estableciendo una cascada bienimática de un solo pozo

Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade

Los flavonols son una subclase importante de flavonoides con una variedad de actividades biológicas y farmacológicas. Aquí, proporcionamos un método para la síntesis enzimática in vitro de un flavonol. En este método, Atf3h y Atfls1, dos genes clave en la vía biosintética de los flavonols, se clonan y se sobreexpresan en Escherichiacoli. Las enzimas recombinantes se purifican a través de una columna de afinidad y luego se establece una cascada bienimática en un tampón sintético específico. Dos flavonols se sintetizan en este sistema como ejemplos y se determinan mediante análisis TLC y HPLC/LC/MS. El método muestra ventajas obvias en la derivación de flavonols sobre otros enfoques. Es ahorro de tiempo y mano de obra y altamente rentable. La reacción es fácil de controlar con precisión y, por lo tanto, se amplía para la producción en masa. El producto objetivo se puede purificar fácilmente debido a los componentes simples en el sistema. Sin embargo, este sistema se limita generalmente a la producción de un flavonol a partir de una flavanona.

F3H y FLS1 son dos enzimas clave importantes en la conversión de una flavanona en un flavonol en plantas como se muestra en la Figura1. Para desarrollar un sistema biosintético in vitro para producir un flavonol a partir de una flavanona, Atf3h (No de adhesión a GenBank. NM_114983.3) y Atfls1 (no de adhesión de GenBank. NM_120951.3) los genes fueron clonados de las plántulas de A. thaliana de 4 semanas de edad en una expresión proca...

La derivación de un flavonol es crucial para su aplicación en la salud y la industria alimentaria. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para la biosíntesis de un flavonol de una flavanona y discutimos los pasos cruciales y sus ventajas sobre otros enfoques.

Biosíntesis de un Flavonol de un Flavanone estableciendo una cascada bienimática de un solo pozo

Flavonols are a major subclass of flavonoids with a variety of biological and pharmacological activities. Here, we provide a method for the in vitro ...

Usando este protocolo, podemos producir fácilmente un buen número de flavonols de flavanones en una olla. Esta técnica ahorra mano de obra y tiempo, es altamente rentable y fácil de controlar, por lo que tiene un enorme potencial de industrialización. Sí, este método puede proporcionar información sobre la producción económica de otros metabolitos secundarios, pero necesita algunas modificaciones cuando se aplica a él.Por lo general, no obtendrá nada o muy bajo rendimiento. Mi consejo es manejar enzimas recombinantes en hielo y añadir 10%glicerina a la solución de stock de enzimas. Esto se debe a que sólo a través de la demostración visual una nueva mano puede comprender los detalles importantes y la verdad que afectan a la ejecución exitosa del experimento.Primero prepare los buffers. Hacer dos veces tampón sintético disolviendo la cantidad adecuada de base TRIS, ascorbato de sodio, ácido alfa cetoglutárico en agua desiminada, y pipeta cantidad adecuada de glicerol a la solución. Utilice una pipeta para añadir ácido clorhídrico para ajustar el pH a 7.2, y ajuste el volumen añadiendo agua desionizada.Almacene el búfer sintético dos veces a cuatro grados centígrados para su uso futuro. A continuación, haga una solución de 100 veces el stock disolviendo sulfato ferroso heptahidrato en agua desionizada. Haga una solución de 25 flavonoide milimolar disolviendo el flavonoide en metanol, y almacene la solución a menos 20 grados centígrados.El paso más crítico es configurar un sistema sintético. Para configurar un sistema sintético para producir un flavanol a partir de una flavanona, primero prepare el sistema sintético en un tubo de dos mililitros de acuerdo con los reactivos enumerados en esta tabla. Coloque el tubo abierto en un bloque de calor de agitación a 40 grados centígrados, a 600 rpm durante cuarenta minutos.Después de eso, terminar la reacción mediante la adición de 10 microlitros de ácido acético, y 100 microlitros de acetato de etilo. Dos horas más tarde, utilice una pipeta para transfiar la fase orgánica superior a un tubo de 1,5 mililitros, y coloque el tubo en una capucha para secar al aire a temperatura ambiente. Para realizar el análisis TLC, primero recupere los tubos de la campana, y vuelva a rediscer el polvo flavanoid en 160 microlitros de metanol en un tubo.Preparar muestras de flavonoide auténticos con concentraciones en serie, diluyendo la solución de material flavonoide de 25 milimolares en metanol. Cargue un microlitro de la muestra de reacción redisuelta y un microlitro de la muestra de flavonoide auténtico en una placa de poliamida. Haga lo mismo para las otras concentraciones de flavonoide auténtico en la misma placa.A continuación, en una campana de humo, coloque la placa cargada de muestra en un cilindro de cromatografía lleno de un sistema de disolvente. Fije la placa a la parte inferior del cilindro y ejecute la placa en el sistema de disolvente durante 20 minutos. Seque al aire las placas a temperatura ambiente.Con una botella de pulverizador, rocíe las placas con una solución etanólica al 1%de cloruro de aluminio, seguida de un secado al aire de nuevo a temperatura ambiente durante 30 minutos. Visualice los puntos en las placas bajo una luz UV a 254 nanómetros, y tome imágenes, luego en el ordenador, abra el software ImageJ. Haga clic en archivo, abrir, para abrir la imagen que se va a analizar.Haga clic en la herramienta de selección más rectangular izquierda en la interfaz de usuario de ImageJ. Delinee el ROI de la imagen con el ratón y pulse uno para etiquetar el primer ROI. Mueva la selección rectangular con el ratón a la derecha al siguiente ROI y presione dos para etiquetar el segundo ROI.Repita para etiquetar todos los demás ROI presionando dos. Pulse tres para generar trazados de perfil para todos los ROI, en una ventana emergente. A continuación, utilice la herramienta de selección de línea recta para soltar líneas base con el fin de definir un área cerrada para cada pico de interés.Active la herramienta de varita, haciendo clic en el icono correspondiente en la interfaz de usuario de ImageJ. Haga clic dentro del pico para mostrar los resultados de todos los picos en una ventana emergente. A continuación, en Excel, trace los valores grises de la ventana emergente contra las concentraciones de flavonoide correspondientes, para crear una curva estándar basada en TLC del flavonoide auténtico.A continuación, calcule el rendimiento del flavonoide de interés producido en este protocolo, de acuerdo con la fórmula resultante. Utilice una jeringa para procesar cada muestra secuencialmente a través de filtros de 0,45 micrómetros y 0,22 micrómetros. Cargue las muestras en un sistema HPLC-MS a través de la boquilla de succión y separe las muestras a 30 grados celsius utilizando una columna C18.Eluda la columna a un mililitro por minuto por un gradiente de 10 a 85 volumen por ciento de acetil nitrilo en agua, y monitorear la absorbancia del eluido de 200 a 800 nanómetros. Realice el análisis LC-MS en un modo iónico negativo, con un flujo de nitrógeno de secado de 10 litros por minuto a 300 grados Celsius, en un flujo de gas de vaina de siete litros por minuto a 250 grados celsius, y recopile datos utilizando un software incorporado. Para extraer cromatógrafos de longitud de onda única, abra el programa de análisis cualitativo y haga clic en file, abra datafile.Seleccione el archivo que desea analizar en la ventana del archivo de datos abierto y haga clic en Abrir para abrir el archivo. Haga clic con el botón derecho del ratón en la ventana de resultados del cromatograma y, a continuación, extraiga cromatogramas en un menú emergente. En la lista de tipos, haga clic en otros cromatogramas.En el cuadro combinado del detector, seleccione DAD1 y, a continuación, haga clic en Aceptar para mostrar los resultados de HPLC en la ventana de resultados del cromatograma. Haga clic en el icono de integración manual acoplado en la parte superior de la ventana de resultados del cromatograma. Dibuje la línea base para el pico necesario para el análisis de integración manual con el ratón.Haga clic en vista, lista de picos de integración, para mostrar los resultados. Copie los resultados de las áreas de pico en Excel y trace una curva estándar basada en HPLC del flavonoide auténtico contra las concentraciones de flavonoide correspondientes y, a continuación, calcule el rendimiento del flavonoide de interés producido en este protocolo de acuerdo con la fórmula resultante. A continuación, repita los mismos procedimientos para extraer cromatogramas de longitud de onda única para analizar los datos de la MS para la masa exacta de compuestos flavonoideos.Haga clic en el icono de selección de rango en la barra de herramientas de resultados del cromatograma. Seleccione el pico de interés. Haga clic con el botón derecho del ratón en el rango seleccionado y haga clic en el espectro de MS de extracción en el menú emergente para mostrar los resultados en la ventana de resultados del espectro de MS.Para determinar si este sistema in vitro se puede utilizar para la conversión de una flavanona en un flavonol, NRN se añadió en el sistema. Hubo dos nuevas manchas surgidas en una placa TLC de poliamida. Un punto mostró una distancia de migración similar a la de DHK, y los otros similares a la de KMF.Un análisis posterior de HPLC y LC-MS demostró que el nuevo producto químico mostraba un tiempo de retención de 12 minutos y 20 minutos respectivamente, en un pico de iones cuasi moleculares M sobre Z a 287 y 285 que eran idénticos a los de DHK y KMF. Para determinar si el sistema se puede utilizar para la conversión de otros flavanones en sus flavonoles correspondientes, SE añadió ERD en el sistema. Dos nuevos puntos en una placa TLC de poliamida mostraron una distancia de migración similar a la de DHQ y QRC respectivamente.Los análisis de HPLC y LC-MS demostraron que estos nuevos productos químicos revelaron un tiempo de retención de 10 minutos y 16 minutos respectivamente, y un pico de iones cuasi moleculares M sobre Z en 303 y 301, que correspondía exactamente a los de DHQ y QRC. Al preparar el sistema sintético, debe agregar la enzima por último, y añadir el sulfato ferroso insuperable. Sí, proporciona una guía para la producción económica de otros metabolitos secundarios.

biosynthesis-flavonol-from-flavanone-establishing-one-pot-bienzymatic

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

La síntesis de especies asimétricas de ferroceno es un desafío utilizando técnicas de solución.  Este informe se centra en los métodos llevados a cabo para producir un bioconjugado de ferroceno-biotina utilizando reacciones fáciles y limpias realizadas mediante síntesis en fase sólida.  Se ha demostrado que la incorporación de una fracción tiolato imparte la capacidad de inmovilización en superficies de oro.

Metodología sintética para asimétrica Ferroceno derivados Sistemas de Bio-conjugadas vía sólida metodología a base de resina de fase

Los líquidos iónicos (ILs) median el acceso rápido, sencillo y barato a los 1,6-ceoesteres en altas diastereoselectividades y buenos rendimientos. El protocolo de reacción es robusto y los 1,6-cetoésteres se pueden obtener en escala de gramos después de un protocolo de filtración simple. Además, los 1,6-ceoesters son potentes gelificantes en disolventes de hidrocarburos.

Síntesis altamente estereoselectiva de 1,6-cetoésteres Mediada por líquidos iónicos: una reacción de tres componentes Habilitación de acceso rápido a una nueva clase de bajo peso molecular gelificantes

Aminoalcoholes quirales son moléculas versátiles para el uso como andamios en síntesis orgánica. A partir de L-lisina, sintetizar alcoholes aminos por una reacción de cascada enzimática combinando diastereoselectiva H C oxidación catalizada por dioxygenase seguido por clivaje de la molécula de ácido carboxílico del aminoácido del hidróxido correspondiente por un decarboxilasa.

Reacciones de la cascada enzimática para la síntesis de aminoalcoholes quirales de L-lisina

Esqueletos bispiro enantioméricamente enriquecido [γ-butirolactona-pyrrolidin-4, 4'-pirazolona] asimétrico se sintetizan a través de una reacción de cicloadición 1, 3-dipolar del organocatalytic simple.

Técnicas de construcción de andamios Bispirocyclic de droga-, como a través de la actividad del Organocatalytic de γ-lactonas α-Imino y Alkylidene pirazolonas

Aquí presentamos protocolos fáciles de usar para producir y purificar metabolitos diterpenoides a través de la expresión combinatoria de enzimas biosintéticas en Escherichia coli o Nicotiana benthamiana,seguido según el producto cromatográfico Purificación. Los metabolitos resultantes son adecuados para diversos estudios, incluyendo caracterización de la estructura molecular, estudios funcionales enzimáticos y ensayos de bioactividad.

Un enfoque personalizable para la producción enzimática y la purificación de productos naturales diterpenoides

Las transformaciones deCO2 se llevan a cabo en un procedimiento de dos pasos de una olla para la síntesis de moléculas complejas. La reducción selectiva 4 e- de CO2 con un reductante hidroborano ofrece un intermedio de bis(boryl)acetal reactivo y versátil que posteriormente participa en la reacción de condensación o en la generación de acoplamiento C-C mediada por carbebero.

Transformaciones versátiles de CO2 en productos complejos: una estrategia de dos pasos de un solo precio

Se desarrollaron nuevas rutas para la síntesis de heterociclos que contienen nitrógeno utilizando cercosporina como fotocatalista libre de metales.

Cercosporina-Fotocatalizado [4+1]- y [4+2]-Anulaciones de Azoalkenes bajo condiciones leves

La reacción de condensación de Claisen-Schmidt es una metodología importante para la generación de compuestos aromáticos bicíclicos conjugados puenteados con metina. A través de la utilización de una variante mediada por la base de la reacción aldólica, se puede acceder a una gama de moléculas fluorescentes y / o biológicamente relevantes a través de un enfoque sintético generalmente económico y operativamente simple.

Síntesis De Pirazol Dependiente De pH, Imidazol, Y Fluoróforos De Isoindolona Dipirorina Usando Un Enfoque De Condensación De Claisen-Schmidt

Describimos metodologías novedosas y sencillas de síntesis y caracterización de micro y submicrónicas de lignina biocompatibles. Estas formulaciones proporcionan un enfoque fácil para la utilización del heteropolímero, así como una alternativa para el diseño racional de matrices portadoras multifuncionales con potencial aplicabilidad en biomedicina, tecnología farmacéutica e industria alimentaria.

Síntesis, caracterización, encapsulación y medición del potencial de liberación de nuevas partículas micro/submicrónicas de lignina alcalina

En el presente trabajo, dilucidamos la síntesis verde de líquido iónico (IL) a base de quinoleína, a saber, bromuro de 1-hexadecilquinolina-1-io {[C16quin]Br} mediante la mezcla de quinolina con un exceso de 1-bromohexadecano, junto con su caracterización detallada mediante resonancia magnética nuclear y mediciones espectroscópicas infrarrojas.

Síntesis verde de líquido iónico a base de quinolina

Aprende la biosíntesis de flavonoles a partir de flavanonas mediante una cascada bienimática de un solo pozo. Este método eficiente y rentable ofrece gran potencial industrial para la producción de metabolitos secundarios.

Biosíntesis de un Flavonol de un Flavanone estableciendo una cascada bienimática de un solo pozo

Explorar más videos