Name: Electroforesis de DNA utilizando naranja de tiazol en lugar de bromuro de etidio o tintes alternativos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 18 s
Description: Aprende a realizar electroforesis de ADN utilizando naranja de tiazol como alternativa segura al bromuro de etidio. Este método económico permite la detección con luz azul sin dañar el ADN, mejorando los resultados en experimentos posteriores de biología molecular.

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Este trabajo fue apoyado por fondos de arranque a TDG de Christopher Newport University.

1. preparar el gel
Nota: Para los protocolos de la electroforesis del gel general, ver también P.Y. Lee, et al. 14.
<ol><li>Mezcla de agarosa (~ 1% w/v, porcentaje puede ser variado para separaciones de tamaño) en tampón (aproximadamente 70 mL para un gel mini (8 x 7 cm)). Tampones son comúnmente TAE (pH de tris-acetato-EDTA, 40 mM Tris, acetato de 20 mM, 1 mM EDTA, aproximadamente 8.6) o TBE (pH de tris-borato-EDTA, 90 mM Tris, borato de 90 mM, EDTA 2 mM, aproximadamente 8.3)).</li>
	<li>Añadir naranja de tiazol a una concentración final de 1.3 μg/mL.<ol>
<li>Disolver el tiazol naranja en DMSO para hacer una solución stock de 10.000 x (13 mg/mL). Mientras que no particularmente fotosensible, almacenar a en el oscuro cuando no esté en uso. Esta solución es estable a temperatura ambiente durante ~ meses; almacenamiento a largo plazo puede lograr congelar alícuotas (DMSO se congela en una nevera estándar). No olvide totalmente derretir y resuspender una solución congelada antes de su uso. Nota: El gel puede también ser manchado con a después de la electroforesis (ver paso 2.6). Si bien tiene un perfil de seguridad mejorado sobre el bromuro de etidio, seguridad en el laboratorio biología molecular estándar deben mantenerse las precauciones.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Microondas la mezcla de agarosa, buffer y tiazol naranja para disolver la agarosa (aproximadamente 60 s). Este paso se conoce comúnmente como "fusión". Remolino (5 s) para facilitar la disolución si es necesario. Nota: Para también se puede añadir después de microondas si se prefiere.</li>
	<li>Deje que la solución de agarosa enfriar brevemente antes de verter en gel aparato de fundición que contiene un peine adecuado.</li>
	<li>Deje que la solución de agarosa solidifique en un gel.</li>
</ol>2. carga y ejecuta el gel
<ol><li>Coloque el gel en el aparato de electroforesis si no está ya presente.</li>
	<li>Añadir el buffer corriente (TAE o TBE como arriba) para cubrir la superficie del gel.</li>
	<li>Carga de muestras de ADN (comúnmente de 10 μL) usando un colorante de carga. Incluir una escala de tamaño de DNA para referencia.</li>
	<li>Coloque la tapa y electrodos (se debe ejecutar el gel hacia el ánodo rojo (positivo)).</li>
	<li>Aplique tensión (típicamente ~ 100V para un mini-gel, aunque el tamaño del gel puede requerir una tensión modificada para no dañar el gel) hasta que carga el tinte ha viajado una distancia apropiada (aproximadamente 4-7 cm para un mini-gel, aunque la distancia puede variar dependiendo aplicación precisa). Nota: Como muchos otros tintes de DNA-que atan y bromuro de etidio, naranja de tiazol se carga positivamente. En consecuencia, estos tintes se migran en la dirección opuesta de electrophoresing ADN. Para las muestras que se bajan mucho el gel de separación mayor, finalmente el tinte se separará de los pequeños fragmentos de DNA, dando por resultado la coloración débil. En estos casos, el gel debe ser teñido como en el paso 2.6. Esta situación no es exclusiva de a, cualquier carga positiva tinte que interactúa reversiblemente con la DNA exhibe este comportamiento (incluyendo a bromuro de etidio y otros).</li>
	<li>Si a no fue agregado antes de gel casting (paso 1.2), sumergiendo el gel en el búfer que contiene naranja de tiazol de la mancha.<ol>
<li>Preparar suficiente buffer (TAE o TBE) que contiene 1,3 tiazol μg/mL naranja cubre el gel y remojar el gel con agitación suave hasta que las bandas son totalmente detectado (aproximadamente 20 min).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. visualización del gel de agarosa naranja de tiazol (transiluminador de UV)
<ol><li>Retirar el gel desde el aparato de electroforesis y el lugar en un transiluminador UV. PRECAUCIÓN: La luz UV es dañina para la piel y los ojos. Asegúrese de usar la adecuada protección de ojos (gafas) y cara (careta). Las manos deben tener guantes y se debe usar manga larga.</li>
	<li>Si lo desea, recorte había deseado bandas de ADN desde el gel (para la digestión posterior o ligadura, por ejemplo). Exponer el gel a luz UV para tan brevemente un período de tiempo posible durante la supresión. (Independientemente del tinte de ADN) luz UV daña DNA.</li>
	<li>Extraer el ADN de la rebanada de gel usando un kit o protocolo disponible15.</li>
</ol>4. visualización del gel de agarosa naranja de tiazol (luz azul transiluminador o linterna)
<ol><li>Retirar el gel desde el aparato de electroforesis y el lugar en un transiluminador de luz azul (~ 470 nm emisión máxima longitud de onda). Alternativamente, un LED azul (~ 470 nm) linterna puede orientarse en gel (ya sea desde arriba o abajo). Nota: Mientras que la sensibilidad es menor utilizando un transiluminador de luz azul con bromuro de etidio, ADN teñida con bromuro de etidio puede ser detectada mediante este protocolo de luz azul.</li>
	<li>Utilice un filtro de emisión ámbar (~ 560 nm longpass, gafas o cuadrado) para filtrar la luz azul, lo que permite la visualización de la fluorescencia de complejos de ADN: tiazol naranja. Nota: Sin el filtro de emisión ámbar, es muy difícil detectar bandas de ADN debido a la intensidad de la fuente de excitación de luz azul. PRECAUCIÓN: Aunque luz azul carece de la capacidad de agudo dañar los tejidos (contrastado UV), prolongados exposición a la luz azul intensa puede dañar los ojos y se debe usar gafas ámbar emisión o filtro.</li>
	<li>Si lo desea, recorte deseadas bandas de ADN desde el gel para más aplicaciones. Nota: Puesto que la luz azul no daña el ADN, no es necesario cortar rápidamente las bandas (como por ejemplo al usar excitación UV en el paso 3.2).</li>
	<li>Extraer el ADN de la rebanada de gel usando un kit o protocolo disponible15.</li>
</ol>5. captura de la imagen
<ol><li>Seleccione ajustes apropiados de excitación y emisión en aparato de proyección de imagen de gel. La excitación y emisión de la naranja de tiazol (λex, max = 510 nm (488 nm y 470 nm también muestran fuerte excitación, además de fuerte excitación en longitudes de onda de UV); λem = 527 nm) son casi idénticos a los comun comercial azul-luz-perceptible colorantes, por lo que instrumentos pueden tener programadas configuración del filtro que puede ser utilizado. Nota: Algunas configuraciones de filtro azul luz – detectables colorantes comerciales realmente usar luz perjudicial UV para la excitación, así que tenga cuidado si la proyección de imagen antes del corte de bandas. Usar una fuente de excitación de luz azul si es posible, cuando bandas de ADN serán suprimidos después de la proyección de imagen.</li>
	<li>En la ausencia de un sistema de imágenes con filtros adecuados, colocar un filtro ámbar entre la cámara y la fuente de excitación de luz azul/gel.</li>
</ol>

<ol><li>O'Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazole+orange+as+an+everyday+replacement+for+ethidium+bromide+and+costly+DNA+dyes+for+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).</li>
<li>McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+carcinogens+as+mutagens+in+the+Salmonella%2Fmicrosome+test%3A+assay+of+300+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 5135-5139 (1975).</li>
<li>Evenson, W. E., Boden, L. M., Muzikar, K. A., O’Leary, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1H+and+13C+NMR+Assignments+for+the+Cyanine+Dyes+SYBR+Safe+and+Thiazole+Orange%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">1H and 13C NMR Assignments for the Cyanine Dyes SYBR Safe and Thiazole Orange.</a> The Journal of Organic Chemistry. 77 (23), 10967-10971 (2012).</li>
<li>Beaudet, M., Cox, G., Yue, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeaudet%2C+M+%22Molecular+Probes%2C+Inc%22">Molecular Probes, Inc</a>. , USA. WO/2005/0333342 (2005).</li>
<li>Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+induced+by+ultraviolet+light%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Mutations induced by ultraviolet light.</a> Mutation Research. 571 (1-2), 19-31 (2005).</li>
<li>Cariello, N. F., Keohavong, P., Sanderson, B. J., Thilly, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+produced+by+ethidium+bromide+staining+and+exposure+to+ultraviolet+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNA damage produced by ethidium bromide staining and exposure to ultraviolet light.</a> Nucleic Acids Research. 16 (9), 4157(1988).</li>
<li>Hartman, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transillumination+can+profoundly+reduce+transformation+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Transillumination can profoundly reduce transformation frequencies.</a> BioTechniques. 11 (6), 747-748 (1991).</li>
<li>Lee, L. G., Chen, C. H., Chiu, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazole+orange%3A+a+new+dye+for+reticulocyte+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Thiazole orange: a new dye for reticulocyte analysis.</a> Cytometry. 7 (6), 508-517 (1986).</li>
<li>Nygren, J., Svanvik, N., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Interactions+Between+the+Fluorescent+Dye+Thiazole+Orange+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">The Interactions Between the Fluorescent Dye Thiazole Orange and DNA.</a> Biopolymers. , 1-13 (1998).</li>
<li>Svanvik, N., Westman, G., Wang, D., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Up+Probes%3A+Thiazole+Orange-Conjugated+Peptide+Nucleic+Acid+for+Detection+of+Target+Nucleic+Acid+in+Homogeneous+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Light-Up Probes: Thiazole Orange-Conjugated Peptide Nucleic Acid for Detection of Target Nucleic Acid in Homogeneous Solution.</a> Analytical Biochemistry. 281 (1), 26-35 (2000).</li>
<li>Yang, P., De Cian, A., Teulade-Fichou, M. P., Mergny, J. L., Monchaud, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Bisquinolinium%2FThiazole+Orange+Conjugates+for+Fluorescent+Sensing+of+G-Quadruplex+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Engineering Bisquinolinium/Thiazole Orange Conjugates for Fluorescent Sensing of G-Quadruplex DNA.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48 (12), 2188-2191 (2009).</li>
<li>Fang, G. M., Chamiolo, J., Kankowski, S., Hovelmann, F., Friedrich, D., Lower, A., Meier, J. C., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+FIT-PNA+hybridization+probe+for+the+hybridization+state+specific+analysis+of+a+C+%E2%86%92+U+RNA+edit+via+FRET+in+a+binary+system%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">A bright FIT-PNA hybridization probe for the hybridization state specific analysis of a C → U RNA edit via FRET in a binary system.</a> Chemical Science. 9 (21), 4794-4800 (2018).</li>
<li>Pei, R., Rothman, J., Xie, Y., Stojanovic, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-up+properties+of+complexes+between+thiazole+orange-small+molecule+conjugates+and+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Light-up properties of complexes between thiazole orange-small molecule conjugates and aptamers.</a> Nucleic Acids Research. 37 (8), e59-e59 (2009).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), 1-5 (2012).</li>
<li>Vogelstein, B., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparative+and+analytical+purification+of+DNA+from+agarose%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Preparative and analytical purification of DNA from agarose.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Bromuro de etidio durante mucho tiempo ha sido una herramienta estándar en el laboratorio de biología molecular, a pesar de toxicidad conocido. Padece también requieren luz ultravioleta, que daña el ADN que se está detectando. Thiazole orange ofrece una alternativa económica a bromuro de etidio, así como tintes comerciales útiles pero costosos.
Los beneficios de la naranja de tiazol son así dos veces. En primer lugar, naranja de tiazol simplemente puede utilizarse como sustitución de bromuro d...

El propósito de este método es identificar ADN en geles de agarosa utilizando tiazol naranja (a) para la detección de fluorescencia. Debido a su perfil de seguridad favorable y bajo costo, naranja de tiazol puede ver beneficio particular en los laboratorios de docencia de pregrado y laboratorios de investigación realizar biología molecular, especialmente trompas y clonación.
Bromuro de etidio queda el tinte más común para la detección de ADN en geles de agarosa. Esto es principalmente porque se puede obtener muy poco costosa y sólo requiere excitación con luz UV para la detección. Ambos etidio bromuro y tiazol naranja son baratos, con baja detección de límites (1-2 ng/carril)1. Hay dos principales inconvenientes a bromuro de etidio naranja de tiazol mejora.
En primer lugar, bromuro de etidio es un mutágeno2 especiales de manejo, envío y requisitos de la disposición, mientras que el naranja de tiazol es menos mutagénico (3 – 4 x menos mutagénicos en la prueba de Ames)3,4 y pueden eliminarse generalmente de con residuos químicos comunes.
En segundo lugar, bromuro de etidio requiere luz UV para la detección. Naranja de tiazol semejantemente puede usar luz UV si se desea, pero también puede ser detectada con luz azul. Luz UV, mientras que comúnmente utilizado, tiene algunas desventajas salientes. En primer lugar, es dañino a los ojos y la piel humana. Mientras que la luz UV puede ser utilizada con seguridad por profesionales capacitados, piel o los ojos daños accidentales (funcionalmente similar a las quemaduras de sol) de la luz UV de laboratorio no son infrecuentes particularmente con científicos inexpertos. En segundo lugar, la luz UV es extremadamente perjudicial para el DNA muestras5, que reduce el éxito de posteriores experimentos (como la ligadura y transformación)1,6,7. A permite la detección con luz azul (λex, max = 510 nm (488 nm y 470 nm también muestran excitación fuerte)), que no causa daño a la piel o daño de ADN (aunque cualquier luz intensa todavía puede ser dañoso a los ojos), disminuyendo enormemente los riesgos para ambos el científico y la muestra.
No es la alternativa de colorante fluorescente sólo a bromuro de etidio; su ventaja es el costo. A fue descubierto en la década de 1980 como una mancha de reticulocitos8y ha encontrado utilidad en un número de fluorescencia basada en ADN experimentos9,10,11,12,13. Actualmente se vende por varios proveedores. A es el compuesto original de adicional, más caro, azul-luz – detectable tintes comerciales y se comporta de manera similar durante la electroforesis, utilizando luz azul o UV para detección1. Además, mientras que otros tintes son más sensibles a concentraciones muy bajas de ADN que EtBr o a, para los experimentos de electroforesis genérico, estos tintes son prohibitivos en muchos contextos.

<table><tbody><tr><td>Escalera de ADN de 2 troncos</td><td>New England Biolabs</td><td>N0469S</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa (grado de análisis genético)</td><td>Fisher</td><td>BP1356-100</td><td></td></tr><tr><td>Linterna de luz azul</td><td>WAYLLSHINE (Amazon)</td><td>WAYLLSHINE LED</td><td></td>azul escalable</tr><tr><td>ChemiDoc MP</td><td>Biorad</td><td>1708280</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>etidio bromuro Fisher</td><td></td><td>BP1302-10</td><td>A modo de comparación, no es necesario para el protocolo</td></tr><tr><td>Aparato de gel (Owl Easy Cast)</td><td>Thermo Scientific</td><td>B1A</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Qiaquick Kit de extracción de gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager Viewing Glasses</td><td>Invitrogen</td><td>S37103</td><td>Necesario para usar la linterna de luz azul.*</td></tr><tr><td>SafeImager 2.0 (Transiluminador de luz azul)</td><td>Invitrogen</td><td>G6600</td><td>Linterna de luz azul se puede utilizar como alternativa</td></tr><tr><td>SYBR Safe</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>A modo de comparación, no es necesario para el protocolo</td></tr><tr><td>TAE (Tris-Acetate-EDTA)</td><td>Corning</td><td>46-010-CM</td><td></td></tr><tr><td>Thiazol orange</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>390062</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">*Las gafas también se incluyen con Invitrogen G6600</td></tr></tbody></table>

electroforesis de dna utilizando naranja de tiazol en lugar de bromuro de etidio o tintes alternativos

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

Electroforesis en gel de DNA utilizando agarosa es una herramienta común en laboratorios de biología molecular, permitiendo la separación de fragmentos de ADN por tamaño. Después de la separación, ADN es visualizado por la coloración. Este artículo muestra cómo utilizar tiazol naranja para teñir ADN. Naranja de tiazol compara favorablemente a los métodos de tinción común, que es sensible, barato, excitable con UV o luz azul (para evitar el daño de la muestra) y más seguro que el bromuro de etidio. Laboratorios equipados ya para ejecutar experimentos de electroforesis de ADN con bromuro de etidio pueden cambiar generalmente tintes sin cambios adicionales a los protocolos existentes, utilizando luz ultravioleta para la detección. Además, detección de luz azul para evitar el daño de la muestra se logra con un filtro de la fuente y emisión de luz azul. Laboratorios ya equipados para la detección de luz azul pueden cambiar simplemente tintes sin cambios adicionales a los protocolos existentes.

Naranja de tiazol permite la detección de ADN, sin utilizar bromuro de etidio y sin necesidad de utilizar luz UV dañan el ADN. Bromuro de etidio es bien sabido ser mutagénico, para eliminar del laboratorio puede ser ventajoso. La luz UV daña el ADN y disminuye la eficiencia de transformación, mientras que la luz azul no daña el ADN. Límites de detección son similares entre el bromuro de etidio, naranja de tiazol y un tinte de ADN comercial común, azul-luz – detectable (figura 1, véase <stron...

Aquí, presentamos un protocolo para utilizar tiazol naranja para la detección de ADN en experimentos de electroforesis de gel. El uso de naranja de tiazol permite eliminación de bromuro de etidio, y se logra la detección de la fluorescencia con luz azul o UV.

Electroforesis de DNA utilizando naranja de tiazol en lugar de bromuro de etidio o tintes alternativos

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Este protocolo es una alternativa fácil y económica al uso de bromuro de etidio para la detección de ADN durante la electroforesis. Mediante la eliminación del bromuro de etidio, se puede utilizar luz UV o luz azul para la detección. La luz azul no es perjudicial para el ADN, lo que mejora la posibilidad de éxito para experimentos posteriores.Es muy fácil probar esto. Sólo tienes que reemplazar el bromuro de etidio en tus geles por naranja tiazole. Para empezar, preparar 1%mini-gels mezclando aproximadamente 0,7 gramos de agarosa en 70 mililitros de tris-acetato-EDTA o tampones de tris-borato.A continuación, disuelva la naranja tiazole en DMSO para hacer una solución de 10.000X. Aunque no es particularmente sensible a la luz, almacene el tiazole naranja en la oscuridad cuando no esté en uso. Para el almacenamiento a largo plazo, haga alícuotas de la mezcla de tiazole naranja-DMSO y congénalas.A continuación, añadir tiazole naranja a una concentración final de 1,3 microgramos por mililitro, y microondas la mezcla de tampón de agarosa y naranja tiazole para disolver la agarosa durante aproximadamente 60 segundos. Vierta la mezcla de agarosa en un aparato de fundición de gel que contenga un peine adecuado, y permita que la solución de agarosa se solidifique en un gel. Para cargar el gel, primero coloque el gel en el aparato de electroforesis, si no está ya presente.A continuación, agregue el tampón de funcionamiento TAE o TBE para cubrir la superficie del gel. A continuación, con un tinte de carga, cargue 10 microlitros de una muestra de ADN. Incluya una escalera de tamaño de ADN como referencia.Coloque la cubierta y los electrodos, y ejecute el minigel a 100 voltios hasta que el tinte de carga viaje aproximadamente de cuatro a siete centímetros para un mini-gel. Si no se aplicó tiazole naranja antes de la fundición del gel, manche el gel sumergiéndolo en el tampón que contiene tiazole naranja con agitación suave durante unos 20 minutos o hasta que las bandas se detecten completamente. Para visualizar el gel con un transilluminador UV, retire el gel del aparato de electroforesis y colóquelo en el transilluminador UV.Para visualizar el gel utilizando un transilluminador de luz azul o una linterna, coloque el gel en el transilluminador de luz azul o dirija la linterna LED azul al gel desde arriba o abajo. Utilice un filtro de emisión de ámbar para filtrar la luz azul, permitiendo la visualización de la fluorescencia de los complejos de naranja tiazole de ADN y para proteger los tintes. Para una mayor digestión o ligadura, corte las bandas de ADN deseadas del gel y proceda a extraer ADN utilizando un kit o protocolo fácilmente disponible.Seleccione los ajustes de excitación y emisión adecuados en el aparato de imagen de gel. En ausencia de un sistema de imágenes con filtros apropiados, coloque un filtro ámbar entre la cámara y la fuente de excitación de luz azul de gel. Los límites de detección son similares entre el bromuro de etidio, el tiazole naranja y un tinte de ADN comercial común detectable con luz azul, con el límite de detección de los tres tintes de uno a dos nanogramos por carril en un minigel.El gel de agarosa teñido de naranja tiazole de un resumen de restricción es detectable cuando se excita con un UV o un transilluminador de luz azul o con una linterna de luz azul. Mientras que el tiazole naranja parece ser menos peligroso que el bromuro de etidio, todavía se debe usar un equipo de protección personal estándar, como guantes y gafas.

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Investigación

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Biochemistry

Bioquímica

Un protocolo básico para la separación de fragmentos de ADN usando electroforesis en gel de agarosa se describe.

Electroforesis en gel de agarosa para la separación de los fragmentos de ADN

Recientemente hemos informado de un nuevo enfoque para la generación de sondas fluorogénicos DNAzyme que se pueden aplicar para crear un simple, "mezclar y leer" ensayo de inmunofluorescencia para la detección de bacterias. Estas sondas de ADN especiales catalizar la escisión de un cromóforo modificado con ADN-ARN sustrato quimérico en la presencia de la mezcla bruta extracelular (CEM), producida por una bacteria específica, con lo que la traducción de detección de bacterias en la generación de...

La detección de bacterias mediante ADNzimas fluorogénicos

En este video, demostramos el ensayo de cambio de movilidad electroforética para detectar interacciones proteína-ADN utilizando sondas de ADN marcadas con fluorescentes infrarrojos. Cuando la proteína se une a la sonda de ADN, forma un gran complejo que migra lentamente y aparece como una banda desplazada en el gel.

Ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética para la detección de complejos de factor de transcripción-ADN

Se describe un montaje de todo el hibridación in situ procedimiento multi-objetivo cromogénico (MC-DESEO) en embriones de Drosophila intactos permitiendo la detección simultánea y específica de tres patrones de distribución de ARNm diferentes contrastando precipitados de color.

Multi-objetivo Cromogénico Todo el montaje<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación para comparar dominios de expresión génica en<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

Presentamos un plan estratégico y un protocolo para identificar variantes genéticas no codificantes que afectan la unión al ADN del factor de transcripción (TF). Se proporciona un protocolo experimental detallado para el análisis del ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) y el ensayo de precipitación de afinidad del ADN (DAPA) de la unión al ADN TF dependiente del genotipo.

La detección de funcional no codificante-variantes genéticas Uso de movilidad electroforética Shift ensayo (EMSA) y el ADN afinidad Precipitación Ensayo (DAPA)

Describimos un protocolo para la detección colorimétrica de E. coli utilizando una prueba de fuego modificada que aprovecha una DNAzima que escinde el ARN, ureasa y perlas magnéticas.

La detección colorimétrica de bacterias mediante prueba de fuego

Se describe aquí un protocolo optimizado de ensayos fluorescentes cambio de movilidad electroforética (FEMSA) utilizando purificados Sox-2 proteínas, junto con sondas fluorescentes infrarrojos marcado tinte de ADN como un estudio de caso para hacer frente a una importante cuestión biológica.

Un protocolo optimizado para el ensayo de cambio de movilidad electroforética utilizando oligonucleótidos marcados con colorante fluorescente infrarrojo

Este protocolo describe la caracterización de ADN polimerasa síntesis de ADN modificado a través de la observación de los cambios en el ADN fluorescente etiquetado infrarroja usando proyección de imagen de gel y electroforesis en gel. Geles de acrilamida se usan para obtener imágenes de alta resolución de la separación de los ácidos nucleicos cortos, que migran a distintas velocidades dependiendo del tamaño.

Ensayo de actividad polimerasa de la DNA usando la DNA etiquetado fluorescente infrarroja visualizado por electroforesis en Gel de acrilamida

Este método permite la coloración selectiva y cuantificación de DNA en geles sumergiendo el gel en un SYBR Green I / solución Nitro azul de tetrazolio y luego exponerlo a la luz del sol o una fuente de luz azul. Esto produce un precipitado visible y no requiere casi ningún equipo, haciéndolo ideal para uso de campo.

Método basado en la precipitación de formazán inducida por exposición a la luz azul de la tinción de ADN

Las moléculas de ADN para microscopía de fluorescencia de la tinción permite ver durante un experimento científico. En el método presentado aquí, las moléculas de ADN son previamente teñidas con colorantes fluorescentes y digeridas con metilación y enzimas de restricción sensibles no metilación.

Determinar si el ADN teñido con un Cianina tinte puede ser digerido con enzimas de restricción

Aquí presentamos un método de tinción post-gel sensible, rápido y discriminatorio para la imagen de ARN etiquetados con aptámeros de mango de ARN I, II, III o IV, utilizando geles de electroforesis de gel de poliacrilamida (PAGE) nativos o desnaturalizantes. Después de ejecutar geles PAGE estándar, el ARN con etiqueta Mango se puede teñir fácilmente con TO1-Biotin y luego analizarse utilizando lectores de fluorescencia comúnmente disponibles.

Visualización fluorescente de ARN etiquetado con Mango en geles de poliacrilamida a través de un método de postmancha

Aprende a realizar electroforesis de ADN utilizando naranja de tiazol como alternativa segura al bromuro de etidio. Este método económico permite la detección con luz azul sin dañar el ADN, mejorando los resultados en experimentos posteriores de biología molecular.

Electroforesis de DNA utilizando naranja de tiazol en lugar de bromuro de etidio o tintes alternativos

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