Name: Monocapas de Colonoid humano para estudiar las interacciones entre patógenos, comensales y epitelio Intestinal Host (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Aprende a cultivar monocapas de colonoides humanos para estudiar interacciones entre patógenos, comensales y epitelio intestinal. Este método permite analizar la biología de la mucosa y las primeras etapas de infección.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de NIH P01 AI125181 K01 DK106323 (JGI) y K01 DK113043 (JFA). Agradecemos a James Kaper (Universidad de Maryland, Baltimore, MD, USA) para proporcionar e. coli cepa HS y EHEC. También reconocemos el integrado de la fisiología y núcleos de proyección de imagen de Hopkins Conte digestivo enfermedad básica centro de núcleo de investigación traslacional (P30 DK089502) y Johns Hopkins espectrometría de masas y proteómica base.

Este protocolo se basa en estudios previamente publicados por los autores. 6 , 7 , 14 , 15 , 16 los pasos siguientes deben realizarse en un gabinete de bioseguridad estéril utilizando técnicas asépticas adecuadas. Todos los métodos que implican a muestras humanas han sido aprobados por el institucional de Junta de Johns Hopkins University School of Medicine (IRB NA_00038329).
1. capa de la célula cultura insertos con matriz extracelular
<ol><li>Preparar 5 mL de solución stock colágeno IV (1 mg/mL) en 100 mM de ácido acético. Dejar reposar a 4 ° C aproximadamente 4 h a hidrato/disolver completamente.</li>
	<li>Alícuota del colágeno IV solución de stock y almacenar a 4 ° C (inferior a 1 mes) o a-20 ° C (> 1 mes).</li>
	<li>Inmediatamente antes de la capa, diluya la solución stock de colágeno IV en agua de calidad de cultivo de tejido estéril a una concentración final de 34 μg/mL. Para la placa de 24 pocillos insertos para cultivo celular, capa cada uno Inserte con 100 μL de solución, que corresponde a 10 μg/cm2.</li>
	<li>Incube la placa en un estándar CO2 cultivo de tejidos incubadora a 37 ° C durante ≥ 2 h, o para mayor comodidad, sellar los bordes de la placa con la película de parafina e incubar a 4 ° C durante la noche o hasta 1 semana.</li>
</ol>2. aislar enteroids/colonoids de cultura 3D
Nota: Enteroids o colonoids son elaboradas de las biopsias del donante y mantenidas en 3D cultura según protocolos estándar descrito anteriormente. 14 , 18 brevemente, las criptas se cosechan de biopsias intestinales o resecciones por quelación y agitación mecánica. Las criptas son lavadas, cosechadas y plateadas en el BMM. Expansión media (descrito en el paso 4.2) es agregado a la cultura y reemplazado cada 2 días. Formación de cultura 3D es visible dentro de horas después de la galjanoplastia.
<ol><li>Aspirar el medio de cultivo de la placa de 24 pocillos y reemplazar con 1 mL de solución de cosecha fría (véase Tabla de materiales) por pozo.</li>
	<li>Use un raspador celular mini para desalojar y romper la pelotilla de matriz de la membrana del sótano, prestando especial atención a cualquier material cerca de los bordes bien.</li>
	<li>Agitar la placa en un agitador orbital a aproximadamente 200 rpm, 4 ° C durante 30-45 minutos.</li>
</ol>3. disociar 3D enteroids/colonoids
<ol><li>Utilice una pipeta monocanal de P200 o una pipeta de varios canales con puntas de filtro estériles para triturate la suspensión de células.</li>
	<li>Piscina de la suspension(s) de células en un frasco cónico de 15 mL. Utilizar los múltiples frascos si el volumen de suspensión total es > 6 mL.</li>
	<li>Añadir un volumen igual de medio DMEM/F12 avanzado que contiene 10 mM HEPES, dipéptido L-Alanil-L-glutamina (1 x) y penicilina-estreptomicina (1 x) (lavado mediano). Invertir el tubo 3 ó 4 veces para mezclar. Centrifugar a 300 x g, 10 min, 4 ° C.<ol>
<li>Opcionalmente, aspirar el medio de lavado y reemplazar con 0,5 mL/pocillo tripsina (véase Tabla de materiales). Suspender colonoids con una pipeta de P200, cerrar el tubo y colocar en un baño de agua de 37 ° C por aproximadamente 2 minutos inmediatamente retire el tubo, añada medio lavado a un volumen final de 10 mL y repita la centrifugación como paso 3.3. Nota: Este paso puede ser preferible si trituración no resulta en fragmentos de tamaños uniforme.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. la suspensión enteroide/colonoid de la galjanoplastia
<ol><li>Si insertos recubiertos se almacenaron a 4 ° C, equilibrar en una incubadora de cultivo de tejidos de2 °C/5% CO 37 por al menos 30 min antes de la galjanoplastia de la célula.</li>
	<li>Para cada inserción para platear, prepara medio cálido (entre 25 y 37 ° C) extensión de 1 mL (EM) y añade 10 μM μM 10 y Y-27632 CHIR 99021. Nota: EM se compone de avanzados DMEM/F12 con B27 (1 x), 50% WNT3A acondicionado medio, 15% RSPO1 acondicionado medio, 10% medio de Noggin acondicionado, EGF humano de 50 ng/mL, 500 nM A-83-01, 10 μM SB 202190, antibiótico/antimicótico cóctel (1 x), 10 mM HEPES, Dipéptido L-Alanil-L-glutamina (1 x) y penicilina-estreptomicina (1 x) (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Aspirar el medio de lavado del tubo que contiene el precipitado de células y resuspender en un volumen de EM suficiente para producir al menos 100 μL/insertar.</li>
	<li>Aspire la solución de colágeno IV de cada inserción y lavar dos veces con 150 μL de medio de lavado por insertar.</li>
	<li>Pipeta 600 μL de EM en el espacio debajo de cada inserto.</li>
	<li>Pipetee 100 μL de la suspensión celular en cada inserto.</li>
	<li>Devolver la placa a la incubadora de cultivo de tejidos y deje reposar durante al menos 12 h. Nota: Evite la agitación o inclinación bruscamente la placa para evitar la distribución desigual de los fragmentos colonoid en la membrana de insertar.</li>
	<li>Supervisar el accesorio de celular y separarse para formar una monocapa confluente colocando la placa en un microscopio óptico de contraste de fase bajo 2.5 x-10 x objetivo.</li>
	<li>Después de 1-2 días, más fragmentos deben adherirse a la matriz de colágeno. Refrescar el medio de cultivo y descontinuar el tratamiento con Y-27632 y CHIR 99021. Seguir actualizar el medio cada 2-3 días hasta confluentes. Generalmente se llega a confluencia en 7-10 días.</li>
</ol>5. Mida la resistencia eléctrica de transepithelial
<ol><li>Conecte los cables de los electrodos y encender el voltohmmeter epitelial (EVOM). Verificar que la función de medición se establece en ohmios.</li>
	<li>Sumergir las puntas de los electrodos brevemente en etanol al 70% y secar con un pañuelo de laboratorio. Equilibrar el electrodo en 5 mL de medio de lavado por aproximadamente 5 minutos.</li>
	<li>Sumerja la punta del electrodo más corta en el medio de inserción y Oriente la punta del electrodo más larga en la placa inferior bien. Mantener el electrodo en posición vertical completa hasta que la lectura de EVOM es relativamente estable, o por no más de 60 s. Nota: Si el conjunto de electrodos está inclinado lejos de vertical, o la altura de la punta se ajusta incorrectamente, la punta más corta puede entren en contacto con y alterar la monocapa celular.</li>
	<li>Comparar mediciones de EVOM hasta el valor obtenido de una inserción sin células sumergida en medio de cultivo para evaluar los progresos hacia la confluencia o diferenciación.</li>
</ol>6. diferenciación de las monocapas confluentes de enteroide/colonoid
<ol><li>Intercambio de EM por medio de la diferenciación (DM) y continuar actualizar los medios de comunicación cada dos días hasta el día 5. DM está EM que carece de WNT3A, RSPO1, A-83-01 y 202190 SB.</li>
	<li>Continuar seguimiento TER para verificar que la diferenciación es proceder como se esperaba. TER seguirá aumentando durante los días 1-5 de la diferenciación. Las monocapas pueden continuar aumentar TER y conservar la viabilidad más allá del día 5-6 pero exhibir resultados más reproducibles y máximos cuando se utiliza al día 5-6.</li>
</ol>7. bacteriana infección con patógenos o comensales e. coli
<ol><li>Un día antes de llevar a cabo la infección, lavado y alimentación monocapas con antibióticos EM o DM.</li>
	<li>Utilizar un bucle de Microbiología estéril suavemente raspar la superficie de un stock congelado glicerol bacteriana y inocular 2 mL de caldo LB. Transferir el tubo a un estándar que sacude la incubadora a 37 ° C durante 12-16 h.</li>
	<li>Diluir 50 μL de la cultura de arrancador en caldo fresco de LB de 5 mL (1: 100) y continuar la incubación con agitación durante 90 minutos. Esto producirá una cultura de la fase de registro con una densidad de 105-106 unidades formadoras de colonias (UFC) / mL.<ol>
<li>Opcionalmente, confirmar la concentración bacteriana por la medida de la densidad óptica a 600 nm (OD600) en un espectrofotómetro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Girar por el cultivo bacteriano a 12.000 x g durante 10 minutos, retirar el sobrenadante y resuspender las bacterias antibióticos EM o DM a una concentración final de 107 UFC/mL.</li>
	<li>Añadir 10 μL de la suspensión bacteriana a la inserción (concentración final 106 UFC/mL). Pipeta lentamente a la mezcla y evitar perturbar la capa de moco extracelular.</li>
	<li>Devolver la placa a una incubadora de cultivo de tejidos durante la infección deseada.</li>
</ol>8. fijación para preservar y immunostain moco
<ol><li>Elevación insertos para el cultivo de células de la placa de 24 pocillos, invertir con cuidado sobre un papel laboratorio para eliminar el medio apical y limpie el líquido externo a aferrarse a la inserción.</li>
	<li>En una nueva placa de 24 pocillos, sumerja el inserto en una solución 1:3 de ácido acético glacial en etanol absoluto (solución de Clarke) por 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Invierta el inserto para eliminar el fijador y rehidratar las células de 1 x PBS durante 10 minutos proceder con los protocolos estándar de la inmunotinción.</li>
	<li>Utilice una cuchilla de afeitar para cortar alrededor del perímetro de la membrana de la inserción. Transferir la membrana a un portaobjetos de vidrio con unas pinzas y colocar un cubreobjetos con medio de montaje.</li>
</ol>9. preparación de lysates de la célula para immunoblotting
Nota: Realice los siguientes pasos en el hielo o en un cuarto frío.
<ol><li>Medio de aspirado y lavado el inserto una vez con PBS.</li>
	<li>Añadir 150 μL lysis buffer que contiene inhibidores de la proteasa (véase tabla de materiales) el prospecto y dejar reposar 5-10 minutos contiene tampón de lisis 50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 1% IGEPAL CA-630, desoxicolato de sodio 0,5%, 0,1% SDS, Cóctel de inhibidor de la proteasa de 1: 100.</li>
	<li>Use un raspador celular mini para eliminar las células de la tuerca, luego utilice una pipeta P200 para triturate brevemente la suspensión y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Someter a ultrasonidos la suspensión con 5 x 1 pulsos de s en el 20% de amplitud con una micropunta punta de prueba (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Añadir tampón de carga SDS-PAGE si inmediatamente realizando electroforesis o alícuota y almacenar lisados a-20 ° C.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Parámetros críticos para el éxito formación de monocapas enteroide/colonoid incluyen 1) sano, proliferando 3D culturas a partir de material; 2) cubriendo la superficie de inserción de cultura celular con colágeno humano IV antes de la siembra de monocapa; 3) fragmentación de 3D las culturas ya sea mecánicamente o enzimático, pero no al nivel de célula.
Durante el aislamiento de 3D enteroids/colonoids, la velocidad óptima de agitación puede variar dependiendo del diámetro de giro de un modelo dado de la coctelera. La intención es no sólo agitar la placa por una mezcla eficiente, pero también evitar salpicar la suspensión de células en la tapa de la placa o en pozos adyacentes. Períodos de incubación de 30 min de < pueden producir BMM residual a las células, que pueden dificultar el apego y la formación de monocapas de células uniformes cuando plateado en partes movibles. Amplia incubación (≥ 1 h) dará viabilidad celular significativamente disminuida.
Puede variar el grado de trituración necesario disociar 3D enteroids/colonoids con pistón rigidez y usuario destreza. Examen periódico de los contenidos bien de un microscopio óptico de contraste de fase se recomienda para determinar la uniformidad del fragmento durante la trituración, con el objetivo de aproximadamente 30 células por fragmento. En lugar de, o además de trituración, la suspensión puede ser digerida brevemente con tripsina para obtener pequeños fragmentos de uniforme. Digestión de la tripsina puede ser deseable si monocapas contienen una gran proporción de estructuras 3D-like entre una otra manera sola capa epitelial. Sin embargo, la disociación de las células no es deseable como esto disminuye significativamente la viabilidad celular. Un pozo de enteroids/colonoids en una gotita BMM 35 μL cultivada generalmente será suficiente para llenar 2-3 inserciones, pero este factor puede variar dependiendo del número y tamaño medio de la enteroids/colonoids.
Colonoid monocapas pueden absorber un volumen sustancial del medio apical como se diferencian. Esto puede eludirse mediante la aplicación de DM adicional a la cámara de relleno superior (150-200 μL), aunque secado parcial de la cámara alta parece no afectar la viabilidad de monocapa o función en ensayos posteriores. Después de aproximadamente 4-5 días de diferenciación, las monocapas de colonoid desarrollan moco extracelular que puede ser visible como material grueso/gelatinosa en la superficie de la célula después de la aspiración cuidadosa de DM.
Interacción de EHEC con la capa exterior mucosa, utilizamos habitualmente el período de titulación e incubación bacteriano especificado en el protocolo. Sin embargo, cepas bacterianas únicas deben ensayarse inicialmente en varias concentraciones y períodos de incubación para determinar los parámetros adecuados para el efecto deseado.
Durante la fijación de la mucosa, aspirando el medio apical probablemente se eliminará la mayor parte de la capa de moco suelto extracelular. Por lo tanto, es importante vaciar cuidadosamente el medio. Si el medio se mantiene en el inserto por tensión superficial, use la esquina de un pañuelo doblado laboratorio para romper la tensión superficial y más lejos del medio del fieltro. Después de la fijación y tinción, la capa de moco puede desalojar sin querer o aplanada mientras que montar un cubreobjetos sobre el filtro de inserción. Para conservar la altura de la mucosa, colocar el filtro en una gota de medio de montaje y coloque cuidadosamente el cubreobjetos sobre el filtro. No toque ni presione sobre el cubreobjetos como esto puede aplanar considerablemente la capa de moco.
Para formar una monocapa polarizada de las células en cultivo 3D, es necesario para reproducir la interacción entre las proteínas de matriz extracelular (ECM) y las integrinas de la membrana basolateral de células epiteliales intestinales. Laminina, colágeno IV, fibronectina y una matriz de proteoglicanos constituyen el ECM epitelial intestinal. 21 , 22 comparamos humana mástil-célula-derivados laminina, fibronectina, colágeno IV y BMM murino-derivadas como capas de relleno. Sólo colágeno IV apoyó la formación de estable, a largo plazo (4 semanas) monocapas confluentes de enteroide/colonoid (figuras 1-2). Pequeños parches de crecimiento similar a la monocapa se obtuvieron en cada una de las otras matrices de prueba, pero estas regiones no ha podido progresar a confluencia. El uso de colágeno humano IV como el suplente de ECM tiene un número de ventajas. BMM deriva de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), las células del sarcoma murino no son de origen humano, mientras que el colágeno humano IV está disponible en el mercado y generalmente más rentable. Además, el BMM es una mezcla compleja de proteínas con variabilidad inherente y puede contener factores de crecimiento secretados por el sarcoma que afectan la expresión génica. 23
Las interacciones entre las células epiteliales intestinales y el ECM subyacente en restitución epitelial intestinal aún incompleto se entiende. La importancia del colágeno IV y laminina no, como un ligando de adherencia para colonocytes humano24 y potenciador de la cripta intestinal células epiteliales restitución25 ha sugerido usando los anticuerpos contra el colágeno IV que impedía accesorio . Β1-integrina expresadas epitelial parece ser importante para la interacción del ECM, como un anticuerpo específico para la integrina β1 bloqueados significativamente la adherencia de colonocytes al tipo colágeno de IV. 24 mientras que el colágeno IV proporciona una confiable ECM para monocapa enteroide/colonoid formación en inserciones epiteliales remodelado de la MEC con el tiempo no ha sido evaluada todavía en este modelo, ni tiene la influencia de las mezclas de ECM más complejas y definidas de colágeno IV, laminina y fibronectina.
Enteroids/colonoids humanas en formato de monocapa (figuras 1-4) permiten manipulaciones y muestreo sería engorroso o imposible de lograr utilizando 3D embebido en matriz de culturas. Enteroids/colonoids 3D varían en tamaño, complejidad estructural y volumen luminal, y así microinyección de microbios o moléculas pequeñas son difíciles de cuantificar con precisión. Además, en contraste con las monocapas (tabla 1), 3D culturas impiden el acceso directo a las superficies luminales y basolateral para medir iones, nutrientes, citoquinas o factores secretados asociadas a procesos fisiológicos o fisiopatológicos . Confluencia (figuras 1-2) es una de las principales propiedades de la monocapa enteroide/colonoid necesaria establecer no sólo los gradientes fisiológicos de los nutrientes, iones y macromoléculas,16 pero también creando la barrera apropiada entre la microbiota luminal y mesenquimales inmune poblada de células serosas ambientes estériles. Estas facetas son importantes a tener en cuenta para futuros estudios que incorporan enteroide/colonoid monocapas con tipos de células mesenquimales, inmune y neuronal para construir modelos fisiológicos más complejos.
Señaló las limitaciones de la célula cultura insertar modelo descrito aquí incluyen la falta de fuerzas físicas como la tensión de esquileo líquido y estiramiento/compresión mecánica (peristalsis) y ausencia de un medio ambiente anaeróbico apical normalmente experimentado por intestinal epitelios en vivo. Estos elementos tienen el potencial para ser abordada con más sofisticadas plataformas de microphysiological,26 pero también requieren de gastos adicionales, equipos y conocimientos para poner en práctica. Las culturas 3D y monocapa son también sin interacciones con o las contribuciones de microbioma intestinal, las poblaciones de células estromales y el sistema inmune a no ser que estos componentes se agregan útil.
Futuras aplicaciones de la monocapa enteroide/colonoid en colágeno IV-revestida de la célula cultura insertos pueden incluir otros estudios de interacción microbiana patógena o comensal, absorción de nutrientes o drogas, toxicidad, metabolismo, función de la barrera y funcional mejora catalizada por co-cultivo con tipos de la célula intestinal adicional. Las evaluaciones pueden realizarse no sólo dentro de los epitelios de donantes sanos, sino también de individuos con mutaciones genéticas o trastornos intestinales, siempre los fenotipos en vivo se establecen para ser preservado en ex vivo enteroide/colonoid cultura.

Colonoids, enteroids y organitas intestinal han llevado a muchos avances en la comprensión de comportamiento de la célula de vástago, el desarrollo intestinal, función de barrera y transporte y diferenciación celular. 1 sin embargo, cultura 3D limita el estudio de la interacción patógeno epitelial de host porque la luz no es directamente accesible a las bacterias o factores de virulencia a menos que las estructuras cerradas se someten a la microinyección. 2 , 3 además, secretan materiales como pequeñas moléculas, proteínas, o moco no puede probarse fácilmente de cultura 3D para el análisis posterior. El impacto de agentes patógenos en la barrera epitelial función4 y ion transporte5 ha sido evaluado en cultura 3D usando colorantes fluorescentes y microscopía de Time-lapse, pero crecidas en soportes de cultivo de tejidos permeables las monocapas son susceptibles de técnicas adicionales como medición de TER y usar cámara/voltaje abrazadera de grabación. 6 , 7
Numerosas publicaciones han descrito protocolos de cultura 2D o monocapa de enteroids/colonoids. Materiales para promover la fijación de la célula epitelial incluyen hidrogeles de colágeno,8,9 0.1% gelatina,10 matriz de capa fina membrana del sótano derivados del sarcoma murino (BMM),11,12, 13 y el colágeno humano IV. 6 , 7 , 14 , 15 , 16 , 17 métodos de siembra incluyen fragmentación mecánica mediante pipeteo6,14,15 o disociación de factores de adherencia celular mediante tripsina,10,11 dispase,13 o EDTA. 9 algunos protocolos utilizan recipientes de plástico no poroso de cultivo de tejidos para la siembra, pero esto restringe el acceso de basolateral, por lo que mayoría de las aplicaciones depende de insertos de cultivo de tejidos permeables. Documentación de mantenimiento y formación de la monocapa confluente estable varía ampliamente entre las publicaciones. Además, composiciones de medios de crecimiento y la diferenciación de las culturas humanas difieren entre los diferentes grupos y seguirán evolucionando como más investigadores adoptan y ajustan la metodología para su aplicación y a los recursos disponibles.
Para hacer frente a las limitaciones de la cultura epitelial intestinal 3D en estudios de interacción huésped-patógeno, presentamos un protocolo modificado para convertir enteroids humano 3D o colonoids a una monocapa. Después de alcanzar la confluencia en un estado inmaduro de la cripta-como, retirada de los factores de crecimiento WNT3A, RSPO1 y los inhibidores de la A-83-01 y SB 202190 conduce a la diferenciación de pequeñas vellosidades intestinales o epitelio superficial del colon. Describimos la matriz ideal, humano colágeno tipo IV, para cubrir los insertos y obtener fragmentos enteroide o colonoid uniforme para la galjanoplastia. Demostramos que este protocolo produce una monocapa confluente con una alta Colonoid ter monocapas secretan una capa de mucosidad espesa apical, permitiendo estudios ex vivo de la interacción patógeno-moco mediante immunoblotting o immunostaining. También se describe un procedimiento de fijación modificado para preservar la capa de moco colónico de inmunotinción. Este método tiene como objetivo proporcionar un modelo manejable para estudiar lo primeros intestinal huésped-patógeno en infección.

<table><tbody><tr><td>2-Amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol</td><td>Sigma</td><td>T4661</td><td>Tris base, Componente del tampón de lisis</td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>Inhibidor de ALK4/5/7</td></tr><tr><td>Ácido acético, glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td>Componente del medio de crecimiento</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 faloidina</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td>Sonda fluorescente para F-actina</td></tr><tr><td>Cóctel antibiótico/antimicótico</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-2</td><td>Primocin (100x)</td></tr><tr><td>B27, 50x</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>Componente del medio de crecimiento</td></tr><tr><td>Insertos de cultivo celular</td><td>Corning</td><td>3470</td><td>Transwell, membrana PET, 0,4 &mu; poro m, placa de 24 pocillos</td></tr><tr><td>CHIR 99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td>GSK3&beta; inhibidor</td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Kit de imagen</td><td>Life Technologies</td><td>C10639</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno IV, de placenta humana</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Solución de recolección de organoides</td><td>Trevigen</td><td>3700-100-01</td><td>Despolimeriza la matriz</td></tr> <tr><td>de la membrana basalEnterohemorrágico Escherichia coli (EHEC)</td><td>Laboratorio de Kaper, Universidad de Maryland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Voltohmímetro epitelial</td><td>de World Precision Instruments</td><td>EVOM2</td><td></td></tr><tr><td>Electrodo de voltohmetro epitelial</td><td>de World Precision Instruments</td><td>STX3</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli cepa HS</td><td>Kaper, Universidad de Maryland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol, absoluto</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>FluorSave medio de montaje</td><td>Millipore</td><td>345789</td><td>Para el montaje de membrana de inserción en portaobjetos de microscopio</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>Dipéptido de L-alanil-L-glutamina, línea celular de 200 mM</td></tr><tr><td>HEK293T/Noggin-Fc</td><td>van den Brink lab, Instituto Tytgat de Investigación</td><td></td> Hepática e Intestinal <td>Para la producción de Medio acondicionado Noggin</td></tr><tr><td>HEK293T/RSPO1-Fc-HA línea celular</td><td>Trevigen</td><td>3710-001-K</td><td>Para la producción de medio acondicionado Rspondin-1</td></tr><tr><td>HEPES, 1 M</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>Componente del medio de crecimiento</td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X1R Centrífuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004250</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>Fluorescente colorante nuclear</td></tr><tr><td>Factor de crecimiento epidérmico humano (EGF)</td><td>R& D Systems</td><td>236-EG-01M</td><td>Componente del medio de crecimiento</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td>Componente del tampón de lisis</td></tr><tr><td>Microscopio óptico de cultivo celular invertido</td><td>Olympus</td><td>Caldo CKX51</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>EMD Millipore</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>L-WNT3A línea celular</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td>Para la producción de medio acondicionado Wnt3a</td></tr><tr><td>Matrigel, factor de crecimiento reducido</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Matriz de membrana basal para cultivo 3D</td></tr><tr><td>Mini raspador de células</td><td>United BioSystems</td><td>MCS-200</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo MUC2, monoclonal de ratón</td><td>Abcam</td><td>ab11197</td><td>Úselo a 1:100 para inmunotinción, 1:500 para inmunotransferencia</td></tr><tr><td>Partículas lentivirales de shRNA MUC2</td><td>GE Dharmacon</td><td>RHS4531</td><td>GIPZ shRNA lentiviral, ID: 4583</td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>Grant Instruments</td><td>PSU-10i</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina, 100x</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Componente del medio de crecimiento</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Corning</td><td>21-031</td><td></td></tr><tr><td>Sonicador de sonda con micropunta</td><td>Branson Ultrasonics</td><td>450</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasa para células de mamíferos</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td>Componente del tampón de lisis</td></tr><tr><td>SB 202190</td><td>Tocris</td><td>1264</td><td>p38 Inhibidor de MAPK</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>Componente del tampón de lisis</td></tr><tr><td>Dexoilolato de sodio</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td>Componente del tampón de</td></tr><tr><td>lisis Dodecil sulfato de sodio</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>Componente del tampón de lisis</td></tr><tr><td>TrypLE Express, 1x</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td>Tripsina, para la digestión de fragmentos de enteroides/colonoides</td></tr><tr><td>Anticuerpo Vinculina, monoclonal de conejo</td><td>Abcam</td><td>ab129002</td><td>Uso a 1:1000 para inmunotransferencia</td></tr><tr><td>Agua, grado de cultivo de tejidos, filtrada estéril</td><td>Corning</td><td>25-055</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>Inhibidor de RhoA/ROCK</td></tr></tbody></table>

monocapas de colonoid humano para estudiar las interacciones entre patógenos, comensales y epitelio intestinal host

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

3 dimensiones (3D) enteroide o colonoid culturas humanas derivadas de células base de la cripta son actualmente el más avanzado modelo ex vivo del epitelio intestinal. Debido a sus estructuras cerradas y matriz extracelular apoyo significativo, culturas 3D no son ideales para estudios de huésped-patógeno. Enteroids o colonoids puede ser cultivado como monocapas epiteliales en cultivo de tejidos permeables las membranas para permitir la manipulación de ambos luminal y basolateral de la célula superficies y fluidos acompañamiento. Esta mayor accesibilidad superficie luminal facilita modelar interacciones epiteliales bacteriana-host como la capacidad de degradar moco de enterohemorrágica e. coli (EHEC) en el epitelio colónico. Se describe un método para la fragmentación de la cultura 3D, monocapa siembra y mediciones de resistencia eléctrica (TER) de transepithelial para monitorear el progreso hacia la confluencia y la diferenciación. Diferenciación de monocapa de Colonoid produce moco secretado que puede ser estudiada por las técnicas de inmunofluorescencia o immunoblotting. Más generalmente, monocapas enteroide o colonoid permiten una plataforma fisiológicamente relevante evaluar las poblaciones celulares específicas que pueden ser objetivo de microbiota comensal o patógeno.

Las culturas humanas enteroide y colonoid crecidas como estructuras 3D, entonces disociadas y fragmentadas para placas de colágeno humano IV-revestida de la célula cultura insertos. El progreso de la formación de la monocapa se controla fácilmente diariamente mediante microscopía de campo brillante, inmunofluorescencia, tinción (figura 1) y un aumento constante en la resistencia eléctrica transepitelial (TER) (figura 2), que refleja la permeabilidad de las ensambladuras apretadas a los iones y se correlaciona con la confluencia de la monocapa. TER de un inserto de 24 pocillos vacío es aproximadamente 50-100 Ω·cm2y al llegar a la confluencia aumenta a aproximadamente 400-500 Ω·cm2. Todas las células epiteliales en monocapas confluentes son conectadas por junctional complejos detectados por el anillo de F-actina en el perímetro de la célula (Figura 1). Monocapas en medios de todo el factor de crecimiento representan el epitelio proliferativo de cripta-como compuesto principalmente de activamente dividir las células que incorporan el nucleósido análogo EdU (figura 2). Retirada de los factores de crecimiento WNT3A y RSPO1 promueve la diferenciación, hacia la vellosidad como culturas que carecen de células proliferantes. Monocapas diferenciadas contienen enterocitos (enteroids) o colonocytes (colonoids) y desarrollan las células epiteliales intestinales especializadas como se ha demostrado en cultivos 3D,18 incluyendo las células caliciformes y enteroendocrinas. 15 monocapas diferenciados también demostraron un aumento significativo en TER (&gt; 1000 Ω·cm2) (figura 2), que indica madurez ensambladuras apretadas.
En fisiología humana normal, la capa epitelial intestinal separa nutrientes y el espacio luminal microbio enriquece el ambiente estéril de serosal. El epitelio regula estrechamente la diafonía entre estos dos compartimientos. Monocapas enteroide y colonoid preservar esta propiedad de compartimentalización importante como lo demuestra el análisis proteómico en tabla 1. Hay diferencias sustanciales entre la composición de la proteína en apical y basolateral acondicionado medios de monocapas enteroide diferenciados. Acceso a ambos lados de la apicales y basolateral permite colección de ambos sobrenadantes en una manera dependiente del tiempo para la medición de la secreción diferencial de otras moléculas tales como citocinas y quimiocinas. 15 , 17
Las monocapas son modelos convenientes y altamente reproducibles para detectar los cambios en la expresión de la proteína mediante immunoblotting y el immunostaining. Así, los cambios en mucina 2 (MUC2) expresión por shRNA caída (KD) puede ser detectado usando ambas técnicas (figura 3). La transducción shRNA fue realizada en 3D colonoids y mantenida en los medios de selección antibiótica. Después de verificar el KD, colonoids puede mantiene culturas 3D continuamente o plateado como monocapas para fines experimentales. Por otra parte, MUC2 KD no afecta la eficacia de la formación de la monocapa en comparación con la línea de los padres colonoid de tipo salvaje. Colección de monocapas de immunoblotting es simple y similar a los protocolos descritos para las líneas de células humanas de adenocarcinoma derivado epitelial. Por lo general, aproximadamente 50 μg o más de proteínas totales pueden ser extraído de una monocapa de insertar crecido solo 0,33 cm2 . Como se muestra en la figura 3, MUC2 es apenas perceptible en monocapas de colonoid (UD) peso indiferenciadas pero es altamente expresada en monocapas WT (DF) distinguidas. Muc2 está por debajo del nivel de detección en monocapas colonoid UD y DF transduced con shRNAs MUC2.
Lo importante, monocapas son un modelo adecuado para estudiar las interacciones huésped-microbianas en la superficie apical de los epitelios. Las monocapas de Colonoid forman una gruesa capa de moco MUC2-positivo unida a la diferenciación que no es fácilmente penetrada por comensal bacteria e. coli HS (figura 4), similar a lo que se ha sugerido en el colon humano normal. 19 sin embargo, enterohemorrágica e. coli (EHEC), un patógeno humano de colon, ha demostrado tener la capacidad de destruir la capa de moco adjunto MUC2 enriquecido para llegar a la superficie apical del epitelio (figura 4). 14 , 20 MUC2 restantes sólo está presente en las células caliciformes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59357/59357fig1.jpg"> Figura 1: Establecimiento de humanas monocapas enteroide/colonoid. (A) ejemplo de colonoid fragmentos después de la disolución de BMM y trituración. (B) ejemplo de inserción inmediatamente después de la galjanoplastia colonoid fragmentos. Escala de la barra (A-B) = 200 μm. Representante de proyección de máxima intensidad (C) y (D) confocal óptica Z sección con las correspondientes proyecciones ortogonales muestran que colonoid fragmentos sembrados en forma de colágeno humano revestido IV filtros múltiples islas de monocapa 2-4 días post siembra. Zonas libres de células (asterisco) son identificables por la ausencia de ambos nucleares (Hoechst 33342, azul) y la coloración de la F-actina apical (phalloidin verde) en proyección de máxima intensidad de C y D. representante (E) y (F) confocal óptica Sección con las correspondientes proyecciones ortogonales muestran una monocapa confluente colonoid con superficie apical continua detectada por la F-actina immunostaining aproximadamente 1 semana post siembra. (G) alta magnificación de una proyección de intensidad máxima representante y sección de óptica confocal (H) con las correspondientes proyecciones ortogonales muestran que las células en monocapas confluentes de colonoid forma la perijunctional de la F-actina anillos (flecha blanca) y un borde en cepillo apical inmaduro (cabezas de flecha). Escala (C-H) de la barra = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59357/59357fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59357/59357fig2.jpg"> Figura 2: evaluación de diferenciación enteroide/colonoid monocapa. (A) incorporación de EdU (rojo) demuestra una pérdida progresiva de la proliferación durante la diferenciación de monocapa yeyunal. Mediciones de TER promedio (B) en monocapas confluentes yeyunal en medio de expansión o de diferenciación. Barras de error representan SEM. UD, Indiferenciado; DF, distinguido. Los números corresponden a días en virtud de la condición especificada; UD1 fue el primer día de confluencia, aproximadamente 1 semana después de la siembra. (C) las monocapas yeyunal UD tienen células amplias, más cortas y un borde en cepillo de menos maduros de la actinia-basado apical de monocapas de DF día 5 yeyunal. Escala (A, C) de la barra = 50 μm. Todas las monocapas fueron representados por lo menos 1 semana posterior siembra y eran confluentes antes de comenzar la diferenciación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59357/59357fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59357/59357fig3.jpg"> Figura 3: Colonoids de tipo salvaje y shRNA transduced caída (KD) colonoids las monocapas confluentes de cada forma. (A) imágenes representativas de tipo salvaje (WT) humano colonoid confluente monocapa distinguen por 5 días y (B) aumentado semejantemente monocapas derivados de culturas colonoid de MUC2 KD. Escala (A-B) de la barra = 50 μm (C) representante immunoblot de culturas colonoid transduced con revuelto shRNA o shRNA MUC2 demuestra que los cambios en la expresión de la proteína debido a KD pueden cuantificarse por el immunoblot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59357/59357fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59357/59357fig4.jpg"> Figura 4: monocapas enteroide/colonoid son modelos adecuados para el estudio de las interacciones luminales microbio-host. Proyección de intensidad máxima representante (A) y sección óptica ortogonal de una monocapa de colonoid muestra la gruesa capa de moco positivo MUC2 apical que no es permeable a e. coli capítulo (flecha negra) en el moco apical superficie. La monocapa fue infectada durante 6 horas con 106 UFC/mL HS. (B) proyección de intensidad máxima representante de monocapa de colonoid humano apicalmente infectado con ECEH (106 UFC/mL, 6 horas). Escala (A-B) de la barra = 50 μm. (C) mediciones de intensidad de MUC2 inmunofluorescencia muestran una disminución significativa de MUC2 en monocapas colonoid infectados por EHEC en comparación con controles no infectados. Barras de error representan SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59357/59357fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Proteína</td>
			<td>Número de</td>
			<td>Abundancia de péptido</td>
		</tr>
<tr>
<td>Medios de comunicación basolateral</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>proteína de unión a ácidos grasos, hígada [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_001434.1</td>
			<td>1299</td>
		</tr>
<tr>
<td>Profilin-1 [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_005013.1</td>
			<td>797</td>
		</tr>
<tr>
<td>Apolipoproteína A-IV precursor [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_000473.2</td>
			<td>744</td>
		</tr>
<tr>
<td>precursor de ecto-ADP-ribosyltransferase 4 [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_066549.2</td>
			<td>633</td>
		</tr>
<tr>
<td>isoforma de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa 1 [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_002037.2 (+ 1)</td>
			<td>616</td>
		</tr>
<tr>
<td>serotransferrin precursor [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_001054.1 (+ 1)</td>
			<td>572</td>
		</tr>
<tr>
<td>precursor de isoforma 3 de proteína de unión a vitamina D [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_001191236.1 (+ 2)</td>
			<td>567</td>
		</tr>
<tr>
<td>catalasa [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_001743.1</td>
			<td>427</td>
		</tr>
<tr>
<td>precursor de la isoforma 1 de agrin [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_940978.2 (+ 1)</td>
			<td>377</td>
		</tr>
<tr>
<td>precursor de la isoforma 1 de lactotransferrina [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_002334.2 (+ 1)</td>
			<td>262</td>
		</tr>
<tr>
<td>Los medios de comunicación apical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>precursor del factor 3 de trébol [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_003217.3</td>
			<td>326</td>
		</tr>
<tr>
<td>precursor del factor 1 de trébol [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_003216.1</td>
			<td>304</td>
		</tr>
<tr>
<td>específicos de la membrana del sótano heparán sulfato proteoglicanos núcleo proteína isoforma precursor [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_001278789.1 (+ 3)</td>
			<td>303</td>
		</tr>
<tr>
<td>B filamin isoforma 1 [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_001157789.1 (+ 2)</td>
			<td>240</td>
		</tr>
<tr>
<td>precursor del factor 2 de trébol [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_005414.1</td>
			<td>182</td>
		</tr>
<tr>
<td>eliminado en precursor de b isoforma cerebral maligno tumores 1 proteína [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_015568.2 (+ 3)</td>
			<td>169</td>
		</tr>
<tr>
<td>queratina, tipo II 1 citoesqueleto [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_006112.3</td>
			<td>157</td>
		</tr>
<tr>
<td>miosina-9 [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_002464.1</td>
			<td>150</td>
		</tr>
<tr>
<td>precursor de la aminopeptidasa N [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_001141.2 (+ 1)</td>
			<td>145</td>
		</tr>
<tr>
<td>Agrin precursor [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_940978.2 (+ 1)</td>
			<td>112</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1. Una lista parcial de péptidos identificados por espectrometría de masa de cromatografía/tándem líquido en apical y basolateral fluidos muestreados de distinguido yeyunal monocapas.

Aquí, presentamos un protocolo cultura humana enteroide o monocapas de colonoid que tienen la función de la barrera intacta para estudiar las interacciones epiteliales microbiota de host a nivel celular y bioquímico.

Monocapas de Colonoid humano para estudiar las interacciones entre patógenos, comensales y epitelio Intestinal Host

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

El cultivo organoide intestinal 3D limita el estudio de la interacción epitelial-patógeno del huésped porque el lumen no es directamente accesible a las bacterias o factores de virulencia. Además, los materiales secretados como moléculas pequeñas, proteínas o moco no se pueden muestrear fácilmente del cultivo 3D para el análisis posterior. Para abordar estas limitaciones, presentamos un protocolo modificado para convertir enteroides o colonoides humanos 3D en monocapa.Las monocapas colonoides secretan una capa de moco espesa y apical, lo que permite estudios ex vivos de la interacción patógeno-moco. Este método tiene como objetivo proporcionar un modelo manejable para estudiar las primeras interacciones huésped-patógeno intestinal tras la infección. Las monocapas colonoides permitirán una nueva forma de estudiar la biología del moco, que es importante en la interacción huésped-patógeno, estudios de microbioma y enfermedad inflamatoria intestinal.Este método se puede aplicar a otros órganos secretores de moco como el tracto gastrointestinal superior, el sistema respiratorio y el sistema reproductivo femenino. La demostración visual ayudará al usuario con la preservación de la mucosidad durante el crecimiento monocapa y durante la fijación para inmunosu manchado. Demostrando el procedimiento estará Karol Dokladny, un científico del personal de nuestro laboratorio.Después de incubar el cultivo celular recubierto, aspirar el medio de cultivo de la placa de 24 pozos y reemplazar con una solución de cosecha helada de un mililitro por pozo. Utilice un rascador de mini células para desalojar y romper el pellet de matriz de membrana del sótano. Preste especial atención a cualquier material cerca de los bordes del pozo.Luego, agitar la placa en un agitador orbital a aproximadamente 200 revoluciones por minuto a cuatro grados Celsius durante 30 a 45 minutos. Utilice una pipeta de canal único P200 equipada con puntas de filtro estériles para triturar la suspensión celular. Entregue la suspensión celular en un vial cónico de 15 mililitros.Utilice varios viales si el volumen total de la suspensión es superior a seis mililitros. Después de eso, añadir en el vial un volumen igual de advanced DMEM/F12 medio que contiene 10 HEPES milimétricos, dipéptido de L-alanil-L-glutamina, y penicilina-estreptomicina. Este es el medio de lavado.Invierta el vial de tres a cuatro veces para mezclar. Centrifugar a 300 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Antes de la enrojección celular, equilibre las inserciones recubiertas en una incubadora de cultivo de tejido durante al menos 30 minutos.Para cada plaquita a planchar, caliente un mililitro de medio de expansión en un baño de agua de 37 grados Celsius y agregue dos inhibidores. A continuación, agregue la mezcla a los pozos. Aspirar el medio de lavado del tubo que contiene el pellet celular y reemplazarlo por medio de expansión con un volumen suficiente para producir al menos 100 microlitros por plaquita y resuspend.A continuación, aspirar la solución de colágeno IV de cada plaquita y lavar dos veces con 150 microlitros del medio de lavado por plaquita. Pipetear 600 microlitros de medio de expansión en el espacio debajo de cada plaquita. Pipetear 100 microlitros de suspensión celular del vial en cada plaquita.Devuelva la placa a la incubadora de cultivo de tejidos y deje sin perturbaciones durante al menos 12 horas. Evite agitar o inclinar bruscamente la placa. Después de la incubación, coloque la placa sobre un microscopio de luz de contraste de fase con una lente objetivo de 2,5 a 10 veces.Refrescar con medio de cultivo sin inhibidores para interrumpir el tratamiento de inhibición. Continúe actualizando el medio cada dos o tres días hasta que sea confluente. Levante los insertos de cultivo celular de la placa de 24 pocillos con fórceps o pinzas de punta fina.Invierta cuidadosamente en un papel tisú de laboratorio para extraer el medio apical y limpie el líquido externo que se adhiere al inserto. En una nueva placa de 24 pozos, sumerja las plaquitas en una solución de uno a tres de ácido acético glacial y etanol absoluto durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, en el banco, invierta la plaquita en papel tisú para extraer el fijador.Coloque las plaquitas en un recipiente de plástico lleno de 1X PBS durante 10 minutos para rehidratar las células antes de proceder con los protocolos de inmunosutención estándar. Para conservarlo, utilice una cuchilla de afeitar para cortar alrededor del perímetro de la membrana de inserción. Usando fórceps, transfiera la membrana a un portaobjetos de microscopio de vidrio.A continuación, agregue el medio de montaje y coloque un cristal de cubierta. En este experimento, los cultivos enteroides y colonoides humanos se cultivan como estructuras 3D, luego se disoccian y se fragmentan para enchapar en inserciones de cultivo celular recubiertas de colágeno-IV. El progreso de la formación de monocapas se controla diariamente mediante microscopía de campo brillante y tinción de inmunofluorescencia.Fragmentos colonoides sembrados en filtros recubiertos de humano-colágeno-IV forman múltiples islas monocapa de dos a cuatro días después de la siembra. Tanto la proyección de intensidad máxima como la sección Z óptica confocal con las proyecciones ortogonales correspondientes muestran que las áreas libres de células son identificables por la ausencia de tinción nuclear y apical de F-actina. Una monocapa colonoide confluente con superficie apical continua fue detectada por inmunostaining F-actin aproximadamente una semana después de la siembra.El aumento elevado de una proyección de intensidad máxima representativa y una sección óptica confocal con las proyecciones ortogonales correspondientes muestran que las células en monocapas colonoides confluentes forman los anillos perijuncionales F-actin y un borde de pincel apical inmaduro. La incorporación de EdU demuestra una pérdida progresiva de proliferación durante la diferenciación monocapa de jejunal. Las monocapas jejunales indiferenciadas tienen células más anchas y más cortas, y un borde de maleza apical menos maduro en comparación con las monocapas de jejunal después de cinco días de diferenciación.Fragmentar los colonoides es fundamental. Si los fragmentos son demasiado grandes, no se unirán al filtro recubierto, sino que se reformarán en un colonoide 3D. Presentamos un método modificado para estudiar la biología mucosa en monocapas colonoides.Se pueden realizar otros estudios patógenos del huésped para examinar la interacción entre el patógeno y la superficie apical intestinal.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este protocolo describe un co-cultivo de microfluidos modelo de cultivo simultáneo y localizada de células epiteliales y bacterias. Este modelo se puede utilizar para investigar el papel de las diferentes señales moleculares solubles en la patogénesis, así como la pantalla de la supuesta eficacia de cepas de bacterias probióticas.

Microfluidos Co-cultivo de células epiteliales y bacterias para la Investigación de la señal mediada Soluble Interacciones

Fuente: In, J. G., et al. Monagocapas colonoides humanas para estudiar las interacciones entre patógenos, comensales y el epitelio intestinal del huésped. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo muestra el procedimiento para cultivar células epiteliales derivadas del colon en un sistema Transwell recubierto de colágeno para generar una monocapa productora de moco que modela la barrera intestinal y permite estudios de interacción huésped-patógeno.

Generación de una monocapa colonoide humana con función barrera para estudiar las interacciones huésped-patógeno

El cultivo de órganos ex vivo permite la investigación de procesos biológicos en el contexto de la arquitectura de tejidos intactos. Aquí, presentamos un método de cultivo ex vivo del colon de ratón, que se puede utilizar para estudiar la inmunidad innata y la defensa antimicrobiana del huésped en el intestino.

los<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Colon Organo cultura y su uso en estudios de defensa antimicrobiana de host

Este protocolo describe la medición de la permeabilidad de la barrera epitelial en el tratamiento farmacológico siguiente en tiempo real en humanos organitas intestinal mediante microscopía fluorescente y vivo microscopia celular.

Medición en tiempo real de la permeabilidad de la barrera epitelial en organoides Intestinal humano

Aquí, describimos la preparación de monocapas epiteliales intestinales derivadas de organoides humanos para estudiar la función de barrera intestinal, la permeabilidad y el transporte. Como los organoides representan la respuesta original del tejido epitelial a los estímulos externos, estos modelos combinan las ventajas de la capacidad de expansión de las líneas celulares y la relevancia y complejidad del tejido primario.

Monocapa epitelial derivada de organoides: un modelo in vitro clínicamente relevante para la función de barrera intestinal

En este protocolo, describimos cómo generar monocapas epiteliales primarias murine de los dos puntos directamente de criptas intestinales. Proporcionamos enfoques experimentales para generar monocapas confluentes en filtros permeables, monocapas confluentes para la cicatrización de heridas de arañazos y estudios bioquímicos, y monocapas dispersas y confluentes para análisis de inmunofluorescencia.

Generación De Monocapas Epiteliales Murinas Primarias De Colon De Criptas Intestinales

Aquí presentamos dos protocolos que permiten el modelado de interacciones intestinales apical-específicas. las monocapas intestinales Organoide-derivadas y las culturas de la interfaz aire-líquido (ALI) facilitan la generación de epitelios bien diferenciados accesibles de lados luminales y basolaterales, mientras que los organoids intestinales polaridad-invertidos exponen su lado apical y son susceptibles a los análisis de alto rendimiento.

Métodos de cultivo para estudiar las interacciones apicales específicas utilizando modelos organoides intestinales

Describimos un protocolo que detalla el aislamiento de criptas colónicas murinas para el desarrollo de colonoides tridimensionales. Los colonoides establecidos se pueden diferenciar terminalmente para reflejar la composición celular del epitelio del huésped antes de recibir un desafío inflamatorio o ser dirigidos a establecer una monocapa epitelial.

Estudio de los efectos epiteliales de la inflamación intestinal in vitro en colonoides murinos establecidos

El presente protocolo describe ensayos de infección para interrogar la adherencia, invasión y replicación intracelular de Shigella utilizando líneas celulares epiteliales in vitro .

Análisis de Infección de Células Epiteliales con Shigella

El estudio presenta un método para la investigación in vitro de infecciones bacterianas utilizando organoides intestinales derivados de células madre tisulares. El protocolo describe cómo cultivar y diferenciar organoides en dos dimensiones, infectarlos con Escherichia coli invasiva adherente y evaluar indicadores clave, incluyendo la ruptura de la barrera epitelial, la imagen de infecciones y la respuesta del ARN epitelial.

Un cultivo de organoides bidimensional sobre una invasina o extracto de membrana basal para estudiar las interacciones huésped-bacteria

Aprende a cultivar monocapas de colonoides humanos para estudiar interacciones entre patógenos, comensales y epitelio intestinal. Este método permite analizar la biología de la mucosa y las primeras etapas de infección.

Monocapas de Colonoid humano para estudiar las interacciones entre patógenos, comensales y epitelio Intestinal Host

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