Microscopía de fuerza de tracción de alto rendimiento Mediante PDMS revela efectos dependientes de la dosis de transformar el factor de crecimiento en la transición epitelial a mesenquimal
1 de junio de 2019
Presentamos un ensayo de fuerza de tracción de alto rendimiento fabricado con caucho de silicona (PDMS). Este novedoso ensayo es adecuado para estudiar los cambios físicos en la contractilidad celular durante diversos procesos y enfermedades biológicas y biomédicas. Demostramos la utilidad de este método midiendo un aumento dependiente de la contractilidad durante la transición epitelial a mesenquimal.
Mi laboratorio está interesado en la mecanobiología, que examina cómo las células ejercen y están influenciadas por fuerzas mecánicas. Una forma de cuantificar la mecanobiología es midiendo la contractilidad celular. En las células adherentes, la contractilidad se manifiesta en las fuerzas de tracción ejercidas sobre el sustrato celular. Cuantificamos estas fuerzas utilizando una metodología generalmente conocida como microscopía de fuerza de tracción o MFT. Y TFM se implementa en una amplia variedad de métodos diferentes, pero un aspecto común es que es una técnica de laboratorio bastante serial y lenta hecha típicamente en un solo plato como este aquí. Esto nos limita a evaluar una población o condición a la vez. A lo largo del cultivo celular se mejoró hace algún tiempo, pero la creación de platos multipocilnos y pensamos, ¿no sería genial que pudiéramos TFM con el mismo mayor rendimiento y la misma eficiencia de tiempo y reactivos? Y esta fue nuestra solución. Así que creamos un plato de fuerza de tracción de 96 pozos. Y se ve muy similar a un plato convencional de cultivo de tejido de 96 pozos, sin embargo con este plato no sólo podemos examinar 96 condiciones diferentes de cultivo celular, sino también cuantificar su contractilidad celular. Esto presenta una solución de rendimiento mucho más alta que los enfoques de un solo plato, lo que nos permite examinar diversas condiciones celulares y respuestas contráctiles. Durante la metástasis del cáncer, las células cancerosas viajan desde su sitio primario a sitios secundarios, propagando la enfermedad en nuestro cuerpo. Este comportamiento metastásico de las células cancerosas representa el 90% de la muerte relacionada con el cáncer. Uno de los mecanismos propuestos para que las células cancerosas epiteliales adquieran un fenotipo más migratorio e invasivo es la transición epitelial-mesenquimal, EMT. Durante la EMT, se vuelven más migratorios e invasivos, cambiando su comportamiento físico. Para entender mejor estos cambios en el comportamiento físico, utilizamos nuestro sustrato de silicio blando para medir los cambios en la contractilidad de las células de la glándula mamaria de ratón con inducción EMT por TGF-En este estudio, investigamos cómo diferentes concentraciones y tiempo de incubación del comportamiento físico de las células afecta a TGF. El polidimetilsiloxano es un caucho muy compatible con el módulo más bajo de Young de aproximadamente 0,6 kilopascales. La rigidez de este material también puede ser sintonizable utilizando diferentes concentraciones de agente de reticulación incluyendo SYLGARD 184.To medir las propiedades mecánicas de PDMS utilizamos un reómetro. Después de mezclar la parte A y la parte B del PDMS, en una relación de peso de uno a uno y agregar el agente de curado con el porcentaje de peso especificado, cargue el lote preparado en la placa del reómetro. Asegúrese de cargar lo suficiente de la muestra para cubrir completamente el área del husillo. Es importante asegurarse de que el husillo toca la muestra completamente sin espacio libre en su borde. Cualquier muestra adicional debe ser cuidadosamente recortada y limpiada de la placa. Mida el módulo de almacenamiento final y la dependencia de tiempo de la viscoelasticidad de cada muestra haciendo barridos de tiempo y frecuencia a una cepa de cizallamiento oscilatoria de 0.5%Newsha]Este gráfico es un ejemplo de prueba de tiempo seq, habiendo hecho para medir el comportamiento reológico de polidimetilsiloxano con tensión de cizallamiento oscilatoria aplicada de 0.5% y temperatura de 1000
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Descripción general
Este estudio presenta un ensayo de fuerza de tracción de alto rendimiento fabricado con caucho de silicona (PDMS), diseñado para investigar cambios físicos en la contractilidad celular durante diversos procesos biológicos. La utilidad del método se demuestra mediante la medición de aumentos dependientes de TGF-β en la contractilidad durante la transición epitelial a mesenquimal.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología celular
- Biomecánica
- Ingeniería biomédica
Antecedentes
- La contractilidad celular es crucial en diversos procesos biológicos.
- Comprender los cambios en la contractilidad puede proporcionar información sobre las enfermedades.
- Los métodos tradicionales pueden carecer de capacidad de procesamiento y sensibilidad.
- El PDMS es un material versátil para la creación de ensayos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un ensayo de alto rendimiento para medir la contractilidad celular.
- Evaluar el impacto del TGF-β en la contractilidad durante la transición epitelial a mesenquimal.
- Proporcionar un método confiable para estudiar el comportamiento celular en diversas condiciones.
Métodos Utilizados
- Elaboración de un ensayo de fuerza de tracción utilizando PDMS.
- Medición de la contractilidad celular en respuesta al TGF-β.
- Análisis de alto rendimiento para evaluar múltiples muestras.
- Evaluación de la dinámica de la transición epitelial a mesenquimal.
Resultados principales
- Medición exitosa de los cambios en la contractilidad celular.
- Incrementos dependientes de TGF-β en la contractilidad demostrados.
- Validación de la utilidad del ensayo basado en PDMS.
- Obtención de conocimientos sobre la mecánica de los procesos de transición celular.
Conclusiones
- El ensayo de fuerza de tracción con PDMS es efectivo para estudiar la contractilidad celular.
- Se confirmó un aumento de la contractilidad durante la transición epitelial a mesenquimal.
- Este método puede aplicarse a diversos estudios biológicos y biomédicos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Esta plataforma de microscopía de fuerza de tracción de alto rendimiento permite la evaluación cuantitativa de la contractilidad celular en un formato escalable, lo que favorece la reducción de riesgos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento. Al vincular la transición epitelial-mesenquimatosa inducida por TGF-β con cambios biofísicos medibles, el método aporta valor predictivo para la validación de dianas en investigaciones sobre fibrosis y metástasis. El sistema basado en PDMS ofrece reproducibilidad y compatibilidad con los flujos de trabajo existentes de placas multipocillo, mejorando el reuso en entornos empresariales a lo largo de las líneas de biología del descubrimiento y desarrollo de ensayos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar a TGF-β como modulador de la contractilidad celular durante la EMT, apoyando la verificación de hipótesis sobre dianas.
- Valor operativo: Proporciona datos de contractilidad dependientes de la dosis y resueltos en el tiempo para priorizar dianas mecanicistas en las vías de fibrosis y cáncer.
- Valor predictivo: Cuantifica fenotipos biofísicos asociados a la EMT, facilitando la selección de dianas en fases preclínicas y la reducción de riesgos en las vías.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Proporciona mediciones cuantitativas de contractilidad independientes del sustrato para la estandarización de ensayos en cribados de mecanobiología.
- Valor operativo: Compatible con formatos de 96 pocillos, lo que permite el cribado paralelo de bibliotecas de compuestos o dosis de citocinas.
- Preparación del ensayo: Utiliza sustratos de PDMS estables e inertes con módulo ajustable (0,4–100 kPa) y vida útil indefinida, reduciendo la variabilidad entre lotes.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Relaciona la dosis y duración de TGF-β con la producción contráctil, apoyando modelos preclínicos alineados con biomarcadores de la EMT.
- Reducción de Riesgos Mecanicistas: Permite evaluar los cambios en la contractilidad como lectura funcional en sistemas relevantes para la enfermedad antes de la validación in vivo.
- Avance Ajustado al Riesgo: Apoya las decisiones de continuar o detener mediante la correlación de la intervención molecular con la modulación del fenotipo biofísico.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos iniciales, proporcionando lecturas biofísicas que orientan la toma de decisiones en fases tempranas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis sobre los efectos de la señalización de TGF-β en la mecánica celular y la contractilidad.
- Selección: Permite la cuantificación reproducible y de alto rendimiento de las fuerzas de tracción en formatos de múltiples pocillos para análisis de respuesta a la dosis.
- Análisis: Genera métricas de contractilidad (magnitud y distribución de la fuerza) que permiten comparar concentraciones de TGF-β y tiempos de exposición.
- Investigación Traducional: Conecta la inducción de EMT in vitro con cambios biomecánicos medibles, apoyando la relevancia de los modelos preclínicos.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable de fuerzas de tracción aplicable a diversos tipos celulares y objetivos de mecanobiología en oncología y fibrosis.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad en los fenotipos mecanobiológicos.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y escalabilidad mediante sustratos de PDMS estandarizados y compatibilidad con placas de múltiples pocillos.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir pruebas de condiciones en paralelo y reducir el consumo de reactivos por punto de datos.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización ajustada al riesgo de objetivos basada en cambios cuantitativos de contractilidad durante transiciones patógenas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo celular, análisis de imágenes de microscopía de fuerzas de tracción (TFM) y preparación de sustratos de PDMS.
- Depende de la reometría para la caracterización del sustrato y de la microscopía de fluorescencia para la cuantificación de las fuerzas de tracción.
- Necesita la estandarización de la densidad de siembra, la funcionalización del sustrato y las condiciones de imagen entre pocillos.
- La adaptación a diferentes tipos celulares puede requerir la optimización de la rigidez del sustrato y de los ligandos de adhesión.
- Las limitaciones prácticas incluyen la uniformidad del grosor del sustrato y la posible autofluorescencia del PDMS en ciertas longitudes de onda.
