Microscopía de fuerza de tracción de alto rendimiento Mediante PDMS revela efectos dependientes de la dosis de transformar el factor de crecimiento en la transición epitelial a mesenquimal
June 1st, 2019
Presentamos un ensayo de fuerza de tracción de alto rendimiento fabricado con caucho de silicona (PDMS). Este novedoso ensayo es adecuado para estudiar los cambios físicos en la contractilidad celular durante diversos procesos y enfermedades biológicas y biomédicas. Demostramos la utilidad de este método midiendo un aumento dependiente de la contractilidad durante la transición epitelial a mesenquimal.
Mi laboratorio está interesado en la mecanobiología, que examina cómo las células ejercen y están influenciadas por fuerzas mecánicas. Una forma de cuantificar la mecanobiología es midiendo la contractilidad celular. En las células adherentes, la contractilidad se manifiesta en las fuerzas de tracción ejercidas sobre el sustrato celular. Cuantificamos estas fuerzas utilizando una metodología generalmente conocida como microscopía de fuerza de tracción o MFT. Y TFM se implementa en una amplia variedad de métodos diferentes, pero un aspecto común es que es una técnica de laboratorio bastante serial y lenta hecha típicamente en un solo plato como este aquí. Esto nos limita a evaluar una población o condición a la vez. A lo largo del cultivo celular se mejoró hace algún tiempo, pero la creación de platos multipocilnos y pensamos, ¿no sería genial que pudiéramos TFM con el mismo mayor rendimiento y la misma eficiencia de tiempo y reactivos? Y esta fue nuestra solución. Así que creamos un plato de fuerza de tracción de 96 pozos. Y se ve muy similar a un plato convencional de cultivo de tejido de 96 pozos, sin embargo con este plato no sólo podemos examinar 96 condiciones diferentes de cultivo celular, sino también cuantificar su contractilidad celular. Esto presenta una solución de rendimiento mucho más alta que los enfoques de un solo plato, lo que nos permite examinar diversas condiciones celulares y respuestas contráctiles. Durante la metástasis del cáncer, las células cancerosas viajan desde su sitio primario a sitios secundarios, propagando la enfermedad en nuestro cuerpo. Este comportamiento metastásico de las células cancerosas representa el 90% de la muerte relacionada con el cáncer. Uno de los mecanismos propuestos para que las células cancerosas epiteliales adquieran un fenotipo más migratorio e invasivo es la transición epitelial-mesenquimal, EMT. Durante la EMT, se vuelven más migratorios e invasivos, cambiando su comportamiento físico. Para entender mejor estos cambios en el comportamiento físico, utilizamos nuestro sustrato de silicio blando para medir los cambios en la contractilidad de las células de la glándula mamaria de ratón con inducción EMT por TGF-En este estudio, investigamos cómo diferentes concentraciones y tiempo de incubación del comportamiento físico de las células afecta a TGF. El polidimetilsiloxano es un caucho muy compatible con el módulo más bajo de Young de aproximadamente 0,6 kilopascales. La rigidez de este material también puede ser sintonizable utilizando diferentes concentraciones de agente de reticulación incluyendo SYLGARD 184.To medir las propiedades mecánicas de PDMS utilizamos un reómetro. Después de mezclar la parte A y la parte B del PDMS, en una relación de peso de uno a uno y agregar el agente de curado con el porcentaje de peso especificado, cargue el lote preparado en la placa del reómetro. Asegúrese de cargar lo suficiente de la muestra para cubrir completamente el área del husillo. Es importante asegurarse de que el husillo toca la muestra completamente sin espacio libre en su borde. Cualquier muestra adicional debe ser cuidadosamente recortada y limpiada de la placa. Mida el módulo de almacenamiento final y la dependencia de tiempo de la viscoelasticidad de cada muestra haciendo barridos de tiempo y frecuencia a una cepa de cizallamiento oscilatoria de 0.5%Newsha]Este gráfico es un ejemplo de prueba de tiempo seq, habiendo hecho para medir el comportamiento reológico de polidimetilsiloxano con tensión de cizallamiento oscilatoria aplicada de 0.5% y temperatura de 1000
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Visión general
Este estudio presenta un ensayo de fuerza de tracción de alto rendimiento fabricado con goma de silicona (PDMS), diseñado para investigar cambios físicos en la contractilidad celular durante varios procesos biológicos. La utilidad del método se demuestra a través de la medición de aumentos dependientes de TGF-β en la contractilidad durante la transición epitelial-mesenquimal.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Biología celular
- Biomecánica
- Ingeniería biomédica
Antecedentes
- La contractilidad celular es crucial en varios procesos biológicos.
- Entender los cambios en la contractilidad puede proporcionar información sobre enfermedades.
- Los métodos tradicionales pueden carecer de rendimiento y sensibilidad.
- PDMS es un material versátil para crear ensayos.
Propósito del estudio
- Desarrollar un ensayo de alto rendimiento para medir la contractilidad celular.
- Evaluar el impacto del TGF-β en la contractilidad durante la transición epitelial-mesenquimal.
- Proporcionar un método confiable para estudiar el comportamiento celular en varias condiciones.
Métodos utilizados
- Fabricación de un ensayo de fuerza de tracción usando PDMS.
- Medición de la contractilidad celular en respuesta al TGF-β.
- Análisis de alto rendimiento para evaluar múltiples muestras.
- Evaluación de la dinámica de la transición epitelial-mesenquimal.
Principales resultados
- Medición exitosa de cambios en la contractilidad celular.
- Demostración de aumentos dependientes de TGF-β en la contractilidad.
- Validación de la utilidad del ensayo basado en PDMS.
- Proporcionó información sobre la mecánica de los procesos de transición celular.
Conclusiones
- El ensayo de fuerza de tracción PDMS es efectivo para estudiar la contractilidad celular.
- Se confirmó el aumento de contractilidad durante la transición epitelial-mesenquimal.
- Este método puede aplicarse a varios estudios biológicos y biomédicos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This high-throughput traction force microscopy platform enables quantitative assessment of cellular contractility in a scalable format, supporting mechanistic de-risking in early discovery. By linking TGF-β-induced epithelial-to-mesenchymal transition to measurable biophysical changes, the method provides predictive value for target validation in fibrosis and metastasis research. The PDMS-based system offers reproducibility and compatibility with existing multi-well workflows, enhancing enterprise reuse across discovery biology and assay development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of TGF-β as a modulator of cellular contractility during EMT, supporting target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides dose-dependent and time-resolved contractility data to prioritize mechanistic targets in fibrosis and cancer pathways.
- Predictive Value: Quantifies biophysical phenotypes linked to EMT, aiding in preclinical target selection and pathway de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, substrate-independent contractility measurements for assay standardization in mechanobiology screening.
- Operational Value: Compatible with 96-well formats, enabling parallel screening of compound libraries or cytokine doses.
- Assay Readiness: Uses stable, inert PDMS substrates with tunable modulus (0.4–100 kPa) and indefinite shelf life, reducing batch variability.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links TGF-β dose and duration to contractile output, supporting biomarker-aligned preclinical models of EMT.
- Mechanistic De-risking: Enables evaluation of contractility changes as a functional readout in disease-relevant systems prior to in vivo validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by correlating molecular intervention with biophysical phenotype modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing biophysical readouts that inform early-phase decision-making.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of TGF-β signaling effects on cellular mechanics and contractility.
- Screening: Enables high-throughput, reproducible quantification of traction forces across multi-well formats for dose-response analysis.
- Analytics: Generates contractility metrics (force magnitude, distribution) that allow comparison of TGF-β concentrations and exposure times.
- Translational Research: Connects in vitro EMT induction to measurable biomechanical changes, supporting preclinical model relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable traction force platform applicable across cell types and mechanobiology targets in oncology and fibrosis.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in mechanobiological phenotypes.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized PDMS substrates and multi-well compatibility.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling parallel condition testing and reducing reagent consumption per data point.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on quantitative contractility shifts during pathogenic transitions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, TFM image analysis, and PDMS substrate preparation.
- Depends on rheometry for substrate characterization and fluorescence microscopy for traction force quantification.
- Necessitates standardization of seeding density, substrate functionalization, and imaging conditions across wells.
- Adaptation to different cell types may require optimization of substrate stiffness and adhesion ligands.
- Practical limitations include substrate thickness uniformity and potential autofluorescence of PDMS at certain wavelengths.
