Name: Microscopía de fuerza de tracción de alto rendimiento Mediante PDMS revela efectos dependientes de la dosis de transformar el factor de crecimiento en la transición epitelial a mesenquimal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Aprende a medir la contractilidad celular mediante microscopía de fuerza de tracción de alto rendimiento con PDMS. Este método permite estudiar los efectos del TGF-β en la transición epitelial a mesenquimal.

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Los autores agradecen a Tom Kodger, Michael Landry y Christopher J. Barrett por su ayuda con la síntesis de cuentas. A.J.E. reconoce que el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería otorga rgPIN/05843-2014 y EQPEQ/472339-2015, la subvención 143327 de los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria, la subvención no 703930 de la Sociedad Canadiense contra el Cáncer y la Fundación Canadiense para la Innovación #32749 del proyecto. R. Krishnan reconoce que los Institutos Nacionales de Salud otorgan no. R21HL123522 y R01HL136209. H.Y. fue apoyado por Fonds de recherche Santé Québec, y Fonds de recherche Nature et Technologies Québec. Los autores agradecen a Johanan Idicula por su ayuda con el video y el manuscrito y a Zixin He por su ayuda en la preparación del vídeo.

NOTA: El siguiente protocolo guiará a los investigadores en la fabricación y el uso de la placa de MFT multi-pozo que se muestra en la Figura1.
1. Preparación de sustratos de silicona PDMS
<ol><li>Preparación de la mezcla de caucho de silicona PDMS basada en una mezcla compuesta de dos kits disponibles comercialmente.<ol>
<li>Añada la Parte A y la Parte B del kit PDMS (por ejemplo, GEL-8100, consulte la Tabla de Materiales)en una relación de peso 1:1 en el tubo de 50 ml. NOTA: La mezcla se mezcla en un rotador a una velocidad lo suficientemente lenta como para que la mezcla fluya de un lado a otro durante la revolución para asegurar una mezcla completa.</li>
		<li>Agregue la cantidad necesaria de agente de curado para el módulo deseado del sustrato. NOTA: La cantidad de agente de curado que se añadirá a la mezcla depende del módulo deseado del sustrato y normalmente puede variar de 0.1% a 1.8%. Consulte la Tabla 1 y la Figura 3 para obtener una guía sobre las concentraciones específicas del retitulador y los módulos resultantes.</li>
		<li>Mezclar la formulación en el rotador durante 30-45 min; asegurar que la rotación sea lo suficientemente lenta como para una mezcla completa.</li>
	</ol></li>
	<li>Capa inferior: recubrimiento de sustratos PDMS en la corredera de vidrio<ol>
<li>Coloque el mandril personalizado que se ilustra en la Figura 2 en el spin-coater. Limpie el vaso con etanol o isopropanol y séquelo con una toallita sin pelusas. Coloque el portaobjetos de vidrio en el mandril y encienda la aspiradora para mantener la diapositiva en su lugar.</li>
		<li>Aplique PDMS sin curar aproximadamente 1 cm de los bordes y trabaje hacia el centro. Aplique suficiente (3-4 ml) PDMS para asegurarse de que toda la superficie estará cubierta. NOTA: Para asegurarse de que el PDMS se extiende uniformemente en la superficie del vidrio, una punta de pipeta puede ser útil para extender la mezcla PDMS desde el centro hasta los bordes.</li>
		<li>Gire el vidrio con la mezcla PDMS en un spin-coater con el siguiente protocolo.<ol>
<li>Para distribuir el PDMS no curado en la diapositiva, acelere a 50 rpm/s de 0 a 200 rpm; 200 rpm durante 1 min.</li>
			<li>Para alcanzar una capa PDMS de 100 m de espesor, acelere a 50 rpm/s a 300 rpm y mantenga pulsado durante 1 min a 300 rpm. Diferentes espesores deseados que no sean 100 m requerirán valores de velocidad específicos.</li>
			<li>Para extraer, desacelerar a 50 rpm/s a 0 rpm. Desactive el vacío y retire el portaobjetos recubierto, teniendo cuidado de no tocar la superficie recubierta. NOTA: Es importante incluir los pasos de aceleración y desaceleración para garantizar una superficie continua y suave. ADVERTENCIA: Para asegurarse de que la muestra no vuela fuera del mandril, el soporte hecho a medida debe utilizarse para sujetar la corredera, y no depender simplemente del vacío y el mandril plano existente. Los detalles y especificaciones de este titular figuran en la Figura2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Coloque la muestra recubierta de espín en el horno a la temperatura recomendada por el fabricante (100 oC) durante 2 h. NOTA: La superficie del horno donde se coloca la muestra debe ser sólida (es decir, no una rejilla de alambre) y nivelar la superficie para garantizar el calentamiento y el espesor uniformes de la muestra. Una placa de cerámica o acero hace una superficie ideal.</li>
	</ol></li>
	<li>Capa de cuentas superior<ol>
<li>Agregue la solución de cordón en la proporción adecuada a la mezcla de PDMS restante. NOTA: Esta relación depende de la concentración de la solución de cordón de material y de la densidad de perlas deseada en la muestra. Los valores finales típicos son 9,2 x 1011 perlas/ml y0,05-0,2 perlas/m 2, y un exceso de perlas es generalmente preferible a una cantidad inadecuada.</li>
		<li>Mezcle la solución de cuentas con pdmS sin curar. Esto se puede lograr colocando el tubo en un rotador durante aproximadamente 30 minutos, vórtice durante 1-2 min, o sonicación durante 30 min. Estos métodos pueden combinarse. NOTA: En nuestra aplicación, encontramos que la sonicación es eficaz en la ruptura de agregados de cuentas, y la rotación es eficaz en la mezcla. Las perlas fiduciarias sintetizadas pueden acumularse en el almacenamiento. Antes de su uso, pueden ser resuspendidos en hexano y sonicados. Si hay agregados grandes significativos, se puede filtrar la suspensión del cordón a través de un filtro de jeringa de 5 m. Este paso de filtración es opcional; ayuda a recubrir la muestra con cuentas monodispersas, pero una fracción significativa de cuentas puede perderse en el filtro.</li>
		<li>Saque el portaobjetos del horno, deje enfriar a temperatura ambiente y colóquelo en el spin-coater.</li>
		<li>Agregue 3-4 ml del cordón y la mezcla PDMS no curada a la superficie de la muestra recubierta. NOTA: La mezcla con perlas añadidas es menos viscosa debido al hexano. Asegúrese de no tocar la superficie del sustrato, ya que puede dañar el sustrato PDMS ya recubierto. Además, la mezcla de cuentas puede inicialmente no mojar la superficie; cuidar que la mezcla no fluya inmediatamente de la superficie de PDMS curada.</li>
		<li>Gire la muestra con el siguiente protocolo.<ol>
<li>Para esparcir el cordón y la mezcla PDMS no curada, acelere a 100 rpm/s de 0 a 500 rpm; 500 rpm durante 1 min.</li>
			<li>Para lograr una capa delgada de PDMS incrustado en cuentas (1 m), acelere a 200 rpm/s de 500 a 5000 rpm; 5000 rpm durante 10 s.</li>
			<li>Para extraer, desacelerar a 100 rpm/s a 0 rpm. Desactive el vacío y retire el portaobjetos recubierto, teniendo cuidado de no tocar la superficie recubierta.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Colocar la muestra recubierta de espín en el horno a 100oC durante 1 h. NOTA: Las temperaturas por encima de 100 oC o duraciones superiores a 1 h pueden reducir la fluorescencia del cordón. Asegúrese de que la temperatura del horno esté a 100 oC y no más alta.</li>
		<li>El protocolo se puede pausar aquí. Para almacenar la muestra, cubra la superficie para evitar la exposición al polvo y a la luz. Asegúrese de que nada toque la superficie. La muestra es estable en el estante indefinidamente a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Montaje de la placa<ol>
<li>Añada la Parte A (base) y la Parte B (agente de curado, por ejemplo, Sylgard) de un kit de elastómero PDMS en una relación de peso de 10:1 en el tubo de 50 ml.</li>
		<li>Mezclar la mezcla en el rotador durante 30-45 min. NOTA: Para una placa, mezcle 5 ml de base con 0,5 ml de agente de curado. Se pueden añadir hasta 1 ml de hexano para reducir la viscosidad de la mezcla.</li>
		<li>Aplique la mezcla en la parte inferior del divisor y extienda la mezcla. NOTA: El divisor debe colocarse boca abajo.</li>
		<li>Poner el sustrato en el divisor boca abajo.</li>
		<li>Colocar la muestra boca abajo en el horno a 65oC durante 2 h.</li>
		<li>Saque muestras del horno y limpie la parte inferior del vidrio con 70% de etanol o isopropanol para eliminar cualquier residuo de PDMS. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Para almacenar la muestra, coloque una tapa sobre el sustrato y envuelva el dispositivo en papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. La muestra es estable en el estante indefinidamente a temperatura ambiente. El divisor utilizado en este método está en un formato de 96 pozos; sin embargo, los investigadores pueden emplear otros formatos (384-bueno, 2-bueno, 4-pozo, 8-bueno, etc.) dependiendo de las configuraciones de experimento deseadas y la disponibilidad de estructuras divisorias. Es posible que se requiera alguna optimización adicional.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Funcionalización de la superficie
<ol><li>Disolver 80 ml de una alícuota Sulfo-SANPAH en 40 ml de tampón HEPES de 0,1 M (pH 7-9). NOTA: Preparar alícuotas Sulfo-SANPAH disolviendo 100 mg de polvo de Sulfo-SANPAH en 2 ml de dimetilsulfóxido estéril (DMSO). Preparar un tampón HEPES de 0,1 M diluyendo 50 ml de HEPES en 450 ml de agua desionizada estéril y filtrar a través de un filtro de poros de 0,22 m.</li>
	<li>Añadir 200 ml de solución Diluida de Sulfo-SANPAH a cada pocal de la placa de 96 pocillos.</li>
	<li>Exponga la placa a la luz UV (300-460nm) a la distancia y duración adecuadas. NOTA: Después de la exposición a los rayos UV, el color de la solución debe ser más oscuro. La distancia y la duración de la exposición a los rayos UV dependen de la potencia de la lámpara UV. En nuestra aplicación, exponemos durante 10-15 min a una distancia de 5 cm.</li>
	<li>Retire la solución Sulfo-SANPAH de los pozos y agregue 200 ml de solución de fibronectina de 5 g/ml a cada pocil. NOTA: La proteína especificada por el investigador se puede utilizar para el recubrimiento superficial. Algunas proteínas de uso común son colágeno, fibronectina y laminina. Hemos encontrado Sulfo-SANPAH como el método más eficaz, y la limpieza de plasma mientras que a veces se emplea en PDMS, ya que crea una capa de dióxido de silicio y daña visiblemente la superficie.</li>
	<li>Incubar la placa a 4oC durante la noche. NOTA: Se pueden aplicar diferentes métodos de incubación dependiendo de la proteína utilizada para el recubrimiento.</li>
	<li>Retire la solución de fibronectina y lave cada pocal con solución salina con fosfato (PBS) dos veces.</li>
	<li>Coloque una tapa en la muestra.</li>
	<li>Añadir 200 l de PBS a cada pocto. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Las muestras recubiertas de fibronectina se pueden almacenar a 4 oC durante un máximo de 2 semanas.</li>
</ol>3. Esterilización UV
<ol><li>Esterilice la muestra bajo luz UV en un armario de seguridad biológica durante 30 min. NOTA: Los tiempos de exposición a los rayos UV más largos pueden afectar negativamente a la fluorescencia del cordón. Todos los pasos subsiguientes deben realizarse en condiciones estériles.</li>
</ol>4. Cultivo celular
<ol><li>Retire el PBS de cada pocal y agregue 200 l de células suspendidas en medios de cultivo a cada poca.<ol>
<li>Placa rinde las células a la densidad celular deseada. La densidad celular depende del experimento deseado. Para los estudios de una sola célula, las células deben estar separadas por un mínimo de 50 m y las celdas cerca de los bordes de la ventana de imágenes no deben incluirse en la medición del MFT. Para las celdas monocapa, la ventana de imágenes debe tener el campo de visualización cubierto con una capa confluente de celdas.</li>
		<li>Preparar los medios de cultivo de crecimiento completos para las células NMuMG complementando DMEM con 5% FBS, 10 mM HEPES, 10 g/mL de insulina, 1% penicilina-estreptomicina, 1 mM de L-glutamina y 0,5 g/ml de anfotericina B.</li>
		<li>Preparar el stock de insulina mediante la reconstitución en agua acidificada (2,5 ml de ácido acético glacial en 130 ml de agua desionizada) a una concentración de 10 mg/ml. Almacene la solución de stock a 4oC. Espere hasta que la solución esté clara y, a continuación, filtre a través de un filtro de poros de 0,22 m.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adición de TGF--<ol>
<li>Para preparar el stock de TGF-o, disolver 2 g de TGF-o en 100 ml de ácido cítrico de 10 mM (pH 3.0) y filtrar el esterilizado con poros de 0,22 m. Vortex el tubo y la alícuota en los volúmenes deseados. Conservar las alícuotas a -80oC.</li>
		<li>Añadir 1,5 l de solución de stock de TGF-o a 10 ml del medio de cultivo celular completo para constituir el medio de cultivo celular con la concentración final de TGF-o de 3 ng/ml. NOTA: Para hacer 10 mM de pH 3.0 ácido cítrico, diluir el ácido en agua y ajustar el pH a 3.0 añadiendo HCl.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Adquisición de datos
<ol><li>Para cada posición, adquiera al menos una imagen de partículas y células fiduciarias. Concéntrese en la capa de perlas. NOTA: El tamaño del píxel debe optimizarse en función del tamaño de las partículas fiduciarias y del método de procesamiento de imágenes que se esté utilizando. En esta aplicación, los autores utilizan un objetivo de 10x 0.4 NA, y las imágenes se adquieren con resolución 1024 x 1024, con 455 nm/píxel. En general, es útil conservar una resolución de al menos 1-5 píxeles por cordón; aquí, las cuentas son polidispersas y tienen un tamaño individual de 300-500 nm. Es fundamental que las cuentas fiduciarias fluorescentes estén enfocadas para las imágenes que se utilizarán para los cálculos de MFT. El enfoque y la calidad de las imágenes de las cuentas deben priorizarse sobre la toma de imágenes de las propias células. No debe haber conversaciones cruzadas entre diferentes canales, particularmente cualquier fluorescencia no de las cuentas fiduciarias que aparece en los espectros de imágenes de las cuentas.</li>
	<li>Una vez grabadas todas las posiciones de interés, añada una solución de desprendimiento a cada pozo para adquirir imágenes de referencia libres de fuerza de las partículas fiduciarias.<ol>
<li>Para preparar la solución de desprendimiento celular, mezcle una solución acuosa que contenga 2% TritonX-100, 50 mM de azida sódica y 500 mM de hidróxido de potasio. NOTA: Lo anterior se proporciona como un ejemplo de una solución de desprendimiento eficaz. Se pueden utilizar diferentes soluciones de desprendimiento a discreción de los investigadores para separar las células de la superficie del sustrato.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Análisis de imágenes
<ol><li>Realice el análisis de imagen adecuado como desee. NOTA: El software de análisis se desarrolló internamente. El análisis de imágenes se puede realizar con software o software personalizado disponible en línea.</li>
</ol>7. Síntesis de cuentas
NOTA: El siguiente protocolo se basa en el método de síntesis descrito por Klein et al.10.
<ol><li>Bajo una capucha de humos, prepare el matraz de tres cuellos con un condensador de reflujo refrigerado por agua. ADVERTENCIA: Configure una síntesis en una campana de humo sorquímica bien ventilada.</li>
	<li>Agregue 0,5 ml del estabilizador PDMS y el fluoróforo al matraz.</li>
	<li>Equipe un cuello con un tabique de goma con una aguja de entrada de nitrógeno y una aguja de salida y equipe el otro cuello con un tabique de goma para agregar reactivo con una jeringa.</li>
	<li>Añadir 100 ml de hexano anhidro en 250 ml al matraz y añadir una pequeña barra de agitación magnética.</li>
	<li>Colocar el matraz en el baño de aceite mineral a 75oC y purgarlo con gas nitrógeno durante 1 h.</li>
	<li>Añadir 6 ml de metilmetacrilato a un matraz inferior redondo de 25 ml.</li>
	<li>Añadir 0,100 g de 2,2'-azobisisobutyronitrile (AIBN) al matraz inferior redondo y purgar la mezcla con gas nitrógeno durante 1 h. NOTA: Enjuague el metilametacrilato a través de la columna preenvasada para eliminar los inhibidores antes de su uso. Agregue el metilametacrilato y la mezcla de AIBN al matraz de tres cuellos.</li>
	<li>La solución se vuelve inicialmente turbia y se vuelve lechosa. Deje que la reacción se ejecute durante 3 h después de que la solución se vuelva turbia.</li>
	<li>Después de las 3 h, coloque el matraz en un baño de agua helada.</li>
	<li>Filtrar al vacío la solución con papel de filtro grueso.</li>
	<li>Centrifugar el filtrado y volver a suspender las partículas en hexano. NOTA: El volumen del hexano que se añadirá depende de la concentración deseada de la solución de cordón. La sonicación facilita la re-dispersión de las partículas de cordón en la solución de hexano. Las perlas producidas por los autores tienen diámetros de polidispersodes de aproximadamente 300-500nm. Debido al uso de seguimiento de patrones de correlación cruzada para determinar desplazamientos, no se requieren perlas monodispersas.</li>
</ol>8. Protocolo de medición de reología
NOTA: La reología no es necesaria para cada investigador o experimento, pero es necesario cuantificar los módulos para las nuevas formulaciones de PDMS. En este protocolo, empleamos un reómetro de cizallamiento para medir los efectos del retiquete, la frecuencia y la tensión en los módulos de muestras PDMS. Dependiendo de las herramientas y la experiencia disponibles, los módulos también se pueden medir utilizando muchos otros enfoques de análisis mecánico. Además, los investigadores que utilizan este protocolo pueden optar por utilizar nuestros módulos publicados presentados en la Tabla1, Figura 3 y Figura4.
<ol><li>Utilice un reómetro con una geometría de placa paralela de 25 mm de diámetro. Se pueden utilizar otras geometrías.</li>
	<li>Inicializar el sistema y calibrar el dispositivo y el sistema de medición (placa paralela, d a 25 mm). Después de medir el espacio cero, comience a cargar la muestra de PDMS.</li>
	<li>Tan pronto como el elastómero PDMS y el agente reticulante se han mezclado, pipetee la mezcla en la placa inferior del reómetro.<ol>
<li>Mueva el husillo hacia abajo para ponerse en contacto completamente con la parte superior de la muestra de PDMS.</li>
		<li>Recorte cuidadosamente el exceso de muestra cargado de la placa inferior.</li>
	</ol>
</li>
	<li>En una prueba de barrido de deformación unitaria, aplique cepas crecientes para cada composición con diferente densidad de reticulación para garantizar que la estructura del polímero permanezca en el régimen viscoelástico lineal durante todas las mediciones de cizallamiento. NOTA: Los valores de tensión relevantes para los estudios celulares suelen estar en el rango de 0,1-10%. Hemos encontrado que PDMS es lineal hasta aproximadamente 100% de tensión.</li>
	<li>Mida el módulo de almacenamiento de cizallamiento dinámico (G') y el módulo de pérdida (G) de la red PDMS en una prueba de barrido de tiempo con una frecuencia de 1 Hz y una tensión de cizallamiento oscilatol del 0,5% a 100 oC.</li>
	<li>Para determinar la viscoelasticidad y la dependencia de tiempo de la red final PDMS, aplique una prueba de barrido de frecuencia con frecuencia sorteando 0.1-100 Hz y tensión de cizallamiento oscilatoliente de 0.5%.</li>
</ol>

<ol><li>Harris, A., Wild, P., Stopak, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicone+rubber+substrata%3A+a+new+wrinkle+in+the+study+of+cell+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion.</a> Science. 208 (4440), 177-179 (1980).</li>
<li>Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+forces+in+locomoting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Traction forces in locomoting cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 31 (3), 225-240 (1995).</li>
<li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stresses+at+the+Cell-to-Substrate+Interface+during+Locomotion+of+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li>
<li>Yoshie, H., Koushki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+Force+Screening+Enabled+by+Compliant+PDMS+Elastomers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Traction Force Screening Enabled by Compliant PDMS Elastomers.</a> Biophysical Journal. 114 (9), 2194-2199 (2018).</li>
<li>Park, C. Y., Zhou, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+for+modulators+of+cellular+contractile+force%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening for modulators of cellular contractile force.</a> Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 7 (10), 1318-1324 (2015).</li>
<li>Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+traction+stresses+increase+with+increasing+metastatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential.</a> PLoS ONE. 7 (2), e32572(2012).</li>
<li>Agus, D. B., et al. Physical Sciences - Oncology Centers Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+sciences+network+characterization+of+non-tumorigenic+and+metastatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A physical sciences network characterization of non-tumorigenic and metastatic cells.</a> Scientific Reports. 3 (1), 1449(2013).</li>
<li>Guo, M., Ehrlicher, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+Stochastic%2C+Motor-Driven+Properties+of+the+Cytoplasm+Using+Force+Spectrum+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Probing the Stochastic, Motor-Driven Properties of the Cytoplasm Using Force Spectrum Microscopy.</a> Cell. 158 (4), 822-832 (2014).</li>
<li>Ngan, E., Northey, J. J., Brown, C. M., Ursini-Siegel, J., Siegel, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+containing+LPP+and+alpha-actinin+mediates+TGFbeta-induced+migration+and+invasion+of+ErbB2-expressing+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">A complex containing LPP and alpha-actinin mediates TGFbeta-induced migration and invasion of ErbB2-expressing breast cancer cells.</a> Journal of Cell Science. 126 (Pt 9), 1981-1991 (2013).</li>
<li>Klein, S. M., Manoharan, V. N., Pine, D. J., Lange, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+monodisperse+PMMA+microspheres+in+nonpolar+solvents+by+dispersion+polymerization+with+a+macromonomeric+stabilizer%5BTitle%5D)+AND+%22Colloid+%26+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Preparation of monodisperse PMMA microspheres in nonpolar solvents by dispersion polymerization with a macromonomeric stabilizer.</a> Colloid & Polymer Science. 282 (1), 7-13 (2003).</li>
</ol>

AJE y RK tienen interés en Live Cell Technologies, una empresa que fabrica los materiales descritos en este artículo.

Para el éxito de este método, es fundamental tener una muestra recubierta uniformemente con un espesor constante de aproximadamente 100 m. El módulo debe ser cuidadosamente elegido para examinar la importancia física del sistema biológico de interés. Al fabricar una capa superior, la concentración de las partículas fluorescentes fiduciales debe optimizarse para un análisis preciso del desplazamiento y la tensión de tracción. El análisis de células individuales aisladas requiere una capa fiduciaria más densa que la medici...

La contractilidad acto-miosina es un elemento esencial de la mecánica celular activa, afectando los comportamientos celulares desde la motilidad y la proliferación hasta la diferenciación de células madre. En los tejidos, la contractilidad impulsa la actividad desde la separación polar en la embriogénesis, hasta la constricción de las vías respiratorias y la actividad cardíaca. Críticamente, para generar tensión, las células primero deben adherirse a su entorno extracelular. Al hacerlo, esta contractilidad genera fuerzas de tracción en su entorno. La Microscopía de Fuerza de Tracción (TFM) ha surgido en una multitud de formas como una manera de cuantificar estas fuerzas de diversas células bajo diferentes condiciones.
El campo del MFT ha visto una excepcional amplitud de innovación y aplicación, y los resultados han allanado el camino para nuevas perspectivas en biología, que incorporan mecánica y fuerzas físicas. A partir de arrugas sustratos de silicona1, los investigadores han aplicado varias técnicas para medir las fuerzas de tracción celular. Estos enfoques se han mejorado continuamente y ahora han alcanzadoun nivel de resolución sobre el orden de varios micras 2. Sin embargo, ha surgido un problema principal, que es la dificultad para crear sustratos de módulos adecuadamente bajos utilizando las siliconas disponibles. Para evitar este problema, la poliacrilamida se adoptó como reemplazo debido a la facilidad de creación de sustratos por el orden de 1-20 kPa3. Recientemente implementamos siliconas muy compatiblesen TFM 4, lo que nos permite fabricar la misma gama de módulos que la poliacrilamida, pero con las ventajas de la silicona inerte y robusta.
Los enfoques de MFT han permitido valiosos descubrimientos mecanobiológicos, sin embargo, una deficiencia persistente es su complejidad, a menudo restringiendo su uso a los investigadores en las disciplinas de ingeniería o ciencias físicas. Esto se debe en gran parte a las calibraciones detalladas y cálculos desafiantes que se requieren para cuantificar la contractilidad. Otro desafío importante es que los métodos de MFT son en gran medida de bajo rendimiento y, por lo tanto, no aptos para estudiar muchas condiciones o poblaciones diferentes simultáneamente5. Esto ha presentado un cuello de botella, que ha obstaculizado la transferencia de MFT de un entorno especializado en biofísica a aplicaciones biológicas y farmacológicas más amplias.
Recientemente hemos desarrollado una placa TFM de formato multipozo, que permite a los investigadores paralelizar sus mediciones de MFM para una cuantificación más rápida de las métricas de contractilidad, mientras exploran el impacto de diferentes compuestos y también utilizan menos reactivos4 . Esta metodología tiene una amplia utilidad en diversos estudios de mecanobiología, desde la evaluación de los efectos de los compuestos en la actividad celular, hasta la cuantificación de los cambios contractilo en la diferenciación o enfermedad.
Un área de investigación biomédica que se beneficiará enormemente de la MFT es el estudio de cómo las señales físicas afectan los fenotipos malignos de las células cancerosas. La metástasis, responsable del 90% de las muertes relacionadas con el cáncer, se caracteriza por células cancerosas que salen de su sitio tumoral original y colonizan un sitio secundario. Para que las células migren a través del tejido y pasen dentro y fuera del sistema vascular, deben cambiar radicalmente sus formas para exprimir a través de estas barreras físicas mientras generan fuerzas sustanciales para abrirse camino a lo largo de la matriz extracelular o moverse entre otras Células. Estas fuerzas se transmiten al sustrato a través de interacciones de adhesión focal2,3, y se pueden cuantificar utilizando TFM. Mientras que los cánceres son bioquímicamente excepcionalmente diversos, con un repertorio en expansión de mutaciones conocidas y cambios de proteínas, se han observado algunos cambios físicos comunes; en una variedad de cánceres, incluyendo cáncer esternón, próstata y pulmón, se ha demostrado que las células metastásicas ejercen 2-3 veces las fuerzas de tracción de las células no metastásicas6,7,8. Estos resultados sugieren que puede haber una fuerte correlación entre la progresión metastásica y las fuerzas de tracción ejercidas por las células; sin embargo, los cambios detallados de contractilidad dependientes del tiempo son difíciles de examinar.
La transición epitelial a mesenquimal (EMT) es un proceso por el cual las células reducen la adhesión de células celulares mediadas por unión mediada y estrecha, cada vez más migratorias e invasivas. Además de las funciones fisiológicas que incluyen la cicatrización de heridas y los procesos de desarrollo, la EMT es también un proceso explotado durante la metástasis, por lo que es un sistema modelo útil para estudiar este proceso. Usando TGF-, podemos inducir la EMT en células epiteliales mamarias murinas (NMuMG)9 para cuantificar directamente los cambios físicos durante esta transformación, y caracterizar el tiempo y los efectos dependientes de la dosis de TGF-o en la EMT y la contractilidad celular. En este artículo, demostramos la utilidad de este enfoque midiendo los cambios en la contractilidad durante una EMT inducida.

<table><tbody><tr><td><Placa fuerte></fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GEL-8100</td><td>Tecnología Nusil</td><td>GEL-8100</td><td>Dieléctrico de Alta Pureza, Kit de Gel de Silicona Suave</td></tr><tr><td>Dow Corning Sylgard 184 Encapsulante de Silicona Transparente 0,5 kg Adhesivos</td><td>Ellsworth</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5 KG</td> agente <td>de curado</td></tr><tr><td>Vidrio cortado a medida&nbsp;</td><td>Hausser Scientific Company</td><td></td><td>109,6 mm y más; x 72,8 mm y más de 1 mm de espesor</td></tr><tr><td>Target 2TM Filtro de jeringa de nailon</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F2513-4</td><td></td></tr><tr><td>Stripwell de 96 pocillos Soporte de tira para caja de huevos</td><td>Corning</td><td>2572</td><td></td></tr><tr><td>Tapa de microplaca universal de poliestireno con muesca en la esquina;</td><td>Corning</td><td>3099</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol etílico</td><td>Greenfield Global</td><td>P016EA95</td><td>0.95</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190764</td><td>reactivo ACS, &ge; 99,5%</fuente</td></tr><tr><td>>Recubrimiento de superficie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH Crosslinker</td><td>Proteochem</td><td>c1111-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina plasma bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-1MG</td><td>solución, estéril filtrada, BioReactivo, apta para cultivo celular</td></tr><tr><td>PBS, 1X</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL</td><td>pH 7,4, sin calcio ni magnesio</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td><Cultivo > células</DMEM fuerte>,</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1X</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL</td><td>4,5 g/L de glucosa, con L-glutamina, piruvato de sodio y rojo de fenol</td></tr><tr><td>FBS (Suero Fetal Bovino)</td><td>Wisent</td><td>080-150</td><td>Premium Quality,&nbsp; Endotoxina < 1, Hemoglobina < 25</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Wisent</td><td>330-050-EL</td><td>1M, ácido libre</td></tr><tr><td>Insulina Humana Recombinante</td><td>Wisent</td><td>511-016-CM</td><td>Grado USP</td></tr><tr><td>Solución de Penicilina-Estreptomicina</td><td>Wisent</td><td>450-201-EL</td><td>100 X, estéril filtrada para cultivo celular</td></tr><tr><td>Solución de L-Glutamina</td><td>Wisent</td><td>609-065-EL</td><td>200mM, estéril filtrada para cultivo celular</td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Wisent</td><td>450-105-QL</td><td>250&mu; g/ml, estéril filtrado para cultivo celular</td></tr><tr><td>TGF-& beta humano recombinante; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>HEK293 Derivado</td></tr><tr><td>del ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>537020</td><td>Glacial, &ge; 99,85%</td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275&nbsp;</td><td>Reactivo ACS, &ge; 99.5%</td></tr><tr><td>NMuMG</td><td>ATCC</td><td>CRL-1636</td><td>Línea celular de glándula mamaria de ratón</td></tr><tr><td>Azida de sodio</td><td>Fisher Schientific</td><td>AC190385000</td><td>99%, extra puro, ACROS Organics</td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio Sigma-Aldrich</td><td></td><td>221473</td><td>reactivo ACS, &ge; 85%, pellets</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>grado</td></tr> <tr><td>de laboratorio<fuerte> Síntesis de </fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,1&prime;-Dioctadecil-3,3,3&prime;,3&prime;-tetrametililindocarbocianina perclorato (DiI)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>468495-100MG</td><td>97%</td></tr><tr><td>Metacrilato de metilo</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>M55909-500ML</td><td>contiene &le; 30&nbsp; ppm MEHQ como inhibidor, 99%</td></tr><tr><td>Inhibidor Removedor</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>306312-1EA</td><td>Columna preempaquetada para eliminar hidroquinona y éter monometílico hidroquinona</td></tr><tr><td>Metacriloxilpropil Polidimetilsiloxano terminado</td><td>Gelest&nbsp;</td><td>DMS-R31 (25.000 g/mol)</td><td>Estabilizador de polidimetilsiloxano, 25.000 g/mol, 1.000 cSt</td></tr><tr><td>2,2&prime;-Azobis(2-metilpropionitrilo) (AIBN)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>441090-25G</td><td>98%</td></tr><tr><td>Hexano&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>296090-2L</td><td>anhidro, 95%</td></tr><tr><td>Hexano, mezcla de isómeros</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>227064-1L</td><td>anhidro, &ge; 99%</td></tr><tr><td>Lo que es &nbsp; papel de filtro cualitativo, Grado 1</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>WHA1001055</td><td>círculos, diam. 55&nbsp; mm,</td></tr><tr><td><fuerte>Equipo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laurell WS-650Mz-23NPPB</td><td>Laurell Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UVP Lámpara UVP UVP UVP Lámpara UV Portátil Modelo UVGL-58</td><td>VWR</td><td>21474-622</td><td></td></tr><tr><td>Reómetro</td><td>Anton Paar</td><td>MCR 302 WESP</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopía de fuerza de tracción de alto rendimiento mediante pdms revela efectos dependientes de la dosis de transformar el factor de crecimiento en la transición epitelial a mesenquimal

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

La contractilidad celular es esencial en diversos aspectos de la biología, impulsando procesos que van desde la motilidad y la división, hasta la contracción de los tejidos y la estabilidad mecánica, y representa un elemento central de la vida animal multicelular. En las células adherentes, la contracción acto-miosina se ve en las fuerzas de tracción que las células ejercen sobre su sustrato. La disregulación de la contractilidad celular aparece en un sinfín de patologías, haciendo de la contractilidad un objetivo prometedor en diversos enfoques de diagnóstico utilizando la biofísica como métrica. Además, las nuevas estrategias terapéuticas pueden basarse en corregir el mal funcionamiento aparente de la contractilidad celular. Estas aplicaciones, sin embargo, requieren la cuantificación directa de estas fuerzas.
Hemos desarrollado microscopía de fuerza de tracción basada en elastómero de silicona (TFM) en un formato multipozo paralelizado. Nuestro uso de un caucho de silicona, específicamente polidimetilsiloxano (PDMS), en lugar del poliacrilamida de hidrogel (PAA) comúnmente empleado nos permite hacer sustratos robustos e inertes con vidas útiles indefinidas que no requieren condiciones de almacenamiento especializadas. A diferencia de los enfoques basados en pilar-PDMS que tienen un módulo en la gama GPa, el PDMS utilizado aquí es muy compatible, que van desde aproximadamente 0,4 kPa a 100 kPa. Creamos una plataforma de alto rendimiento para TFM dividiendo estos grandes sustratos monolíticos espacialmente en pozos bioquímicos independientes, creando una plataforma multipozo para el cribado de fuerza de tracción que es compatible con los sistemas multipozo existentes.
En este manuscrito, utilizamos este sistema de fuerza de tracción multipozo para examinar el Epitelial a la Transición Mesenquimal (EMT); inducimos la EMT en las células NMuMG exponiéndolas a TGF-o, y cuantificando los cambios biofísicos durante la EMT. Medimos la contractilidad en función de la concentración y la duración de la exposición a TGF. Nuestros hallazgos aquí demuestran la utilidad del MFT paralelizado en el contexto de la biofísica de la enfermedad.

Antes de la adición de TGF-o, una monocapa confluente de células tiene una forma adoquinada y está apretadamente embalada. Tras el tratamiento con TGF, las células se vuelven más alargadas en morfología, ampliando el área celular y adquiriendo un fenotipo más mesenquimal. Utilizando el dispositivo multipozo fabricado con elastómeros PDMS suaves, se estudiaron las propiedades físicas de las células en un total de 17 condiciones diferentes. Las células fueron tratadas con cuatro concentraci...

Presentamos un ensayo de fuerza de tracción de alto rendimiento fabricado con caucho de silicona (PDMS). Este novedoso ensayo es adecuado para estudiar los cambios físicos en la contractilidad celular durante diversos procesos y enfermedades biológicas y biomédicas. Demostramos la utilidad de este método midiendo un aumento dependiente de la contractilidad durante la transición epitelial a mesenquimal.

Microscopía de fuerza de tracción de alto rendimiento Mediante PDMS revela efectos dependientes de la dosis de transformar el factor de crecimiento en la transición epitelial a mesenquimal

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Mi laboratorio está interesado en la mecanobiología, que examina cómo las células ejercen y están influenciadas por fuerzas mecánicas. Una forma de cuantificar la mecanobiología es midiendo la contractilidad celular. En las células adherentes, la contractilidad se manifiesta en las fuerzas de tracción ejercidas sobre el sustrato celular. Cuantificamos estas fuerzas utilizando una metodología generalmente conocida como microscopía de fuerza de tracción o MFT. Y TFM se implementa en una amplia variedad de métodos diferentes, pero un aspecto común es que es una técnica de laboratorio bastante serial y lenta hecha típicamente en un solo plato como este aquí. Esto nos limita a evaluar una población o condición a la vez. A lo largo del cultivo celular se mejoró hace algún tiempo, pero la creación de platos multipocilnos y pensamos, ¿no sería genial que pudiéramos TFM con el mismo mayor rendimiento y la misma eficiencia de tiempo y reactivos? Y esta fue nuestra solución. Así que creamos un plato de fuerza de tracción de 96 pozos. Y se ve muy similar a un plato convencional de cultivo de tejido de 96 pozos, sin embargo con este plato no sólo podemos examinar 96 condiciones diferentes de cultivo celular, sino también cuantificar su contractilidad celular. Esto presenta una solución de rendimiento mucho más alta que los enfoques de un solo plato, lo que nos permite examinar diversas condiciones celulares y respuestas contráctiles. Durante la metástasis del cáncer, las células cancerosas viajan desde su sitio primario a sitios secundarios, propagando la enfermedad en nuestro cuerpo. Este comportamiento metastásico de las células cancerosas representa el 90% de la muerte relacionada con el cáncer. Uno de los mecanismos propuestos para que las células cancerosas epiteliales adquieran un fenotipo más migratorio e invasivo es la transición epitelial-mesenquimal, EMT. Durante la EMT, se vuelven más migratorios e invasivos, cambiando su comportamiento físico. Para entender mejor estos cambios en el comportamiento físico, utilizamos nuestro sustrato de silicio blando para medir los cambios en la contractilidad de las células de la glándula mamaria de ratón con inducción EMT por TGF-En este estudio, investigamos cómo diferentes concentraciones y tiempo de incubación del comportamiento físico de las células afecta a TGF. El polidimetilsiloxano es un caucho muy compatible con el módulo más bajo de Young de aproximadamente 0,6 kilopascales. La rigidez de este material también puede ser sintonizable utilizando diferentes concentraciones de agente de reticulación incluyendo SYLGARD 184.To medir las propiedades mecánicas de PDMS utilizamos un reómetro. Después de mezclar la parte A y la parte B del PDMS, en una relación de peso de uno a uno y agregar el agente de curado con el porcentaje de peso especificado, cargue el lote preparado en la placa del reómetro. Asegúrese de cargar lo suficiente de la muestra para cubrir completamente el área del husillo. Es importante asegurarse de que el husillo toca la muestra completamente sin espacio libre en su borde. Cualquier muestra adicional debe ser cuidadosamente recortada y limpiada de la placa. Mida el módulo de almacenamiento final y la dependencia de tiempo de la viscoelasticidad de cada muestra haciendo barridos de tiempo y frecuencia a una cepa de cizallamiento oscilatoria de 0.5%Newsha]Este gráfico es un ejemplo de prueba de tiempo seq, habiendo hecho para medir el comportamiento reológico de polidimetilsiloxano con tensión de cizallamiento oscilatoria aplicada de 0.5% y temperatura de 1000

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Un ensayo para medir cuantitativamente el factor transformador del crecimiento (TGF)-β-inducida por invasión en geles de colágeno en 3 dimensiones se describe. Este ensayo se aprovecha de la serie MCF10A de líneas celulares, que representan diferentes etapas de desarrollo de cáncer de mama. Este método puede ser aprobada para su uso con otras líneas celulares y podrían ser utilizados para investigar otras posibles activadores o inhibidores de la invasión.

Ensayo esferoide para medir TGF-β inducida por invasión

Un método directo se describe para la inducción de la transición epitelial a mesenquimal (EMT) en una variedad de tipos de células. Se incluyen métodos para el análisis de células en estados EMT por inmunocitoquímica.

Inducción y Análisis de epitelial a mesenquimal de transición

Se ha demostrado que la regulación alternativa del empalme contribuye a la transición epitelio-mesenquimal (EMT), un programa celular esencial en diversos procesos fisiológicos y patológicos. Aquí describimos un método que utiliza un modelo de EMT inducible para la detección de empalme alternativo durante EMT.

Detección de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal de transición

Aquí, describimos el desarrollo y la aplicación de un ensayo de contracción en gel para evaluar la función contráctil en células mesenquimales que experimentaron una transición epitelio-mesenquimatosa.

Desarrollo de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayo para evaluar la función contráctil de las células mesenquimales que la transición epitelio-mesenquimal Sufrió

La diferenciación celular está regulada por una serie de factores microambientales, incluyendo tanto la composición de la matriz y de material de sustrato propiedades. Se describe aquí una técnica utilizando microarrays de células en combinación con microscopía de fuerza de tracción para evaluar tanto la diferenciación celular y las interacciones célula-sustrato biomecánicas como una función del contexto microambientales.

Una de alto rendimiento plataforma de microarrays de células para análisis correlativo de la diferenciación celular y las fuerzas de tracción

Presentamos aquí un método de cultivo celular para inducir transiciones mesenquimales-epitelial (MET) en células de sarcoma en base a la expresión ectópica combinado de miembros de la familia microRNA-200 y Grainyhead-como 2 (GRHL2). Este método es adecuado para una mejor comprensión del impacto biológico de la plasticidad fenotípica de la agresividad del cáncer y los tratamientos.

La inducción de la mesenquimales-epitelial Transitions en células de sarcoma

Se describe un protocolo para la inducción en vitro de transición endotelio-mesénquima (EndMT), que es útil para la investigación de vías de señalización celulares involucradas en EndMT. En este modelo experimental, EndMT es inducida por el tratamiento con TGF-β en las células endoteliales MS-1.

Análisis molecular de transición endotelio-mesénquima inducida por transformación de señalización del Factor de crecimiento β

Aquí, presentamos un protocolo basado en la mecánica para interrumpir la conexión de separación de la conexión 43 y medir el impacto posterior que esto tiene en la biomecánica endotelial a través de la observación de tracciones y tensiones intercelulares.

Biomecánica endotelial perturbando a través de Connexin 43 Interrupción Estructural

Describimos un flujo de trabajo sistemático para investigar la señalización β TGF y la EMT inducida por TGF-β mediante el estudio de la proteína y la expresión génica implicadas en esta vía de señalización. Los métodos incluyen hinchazón occidental, un ensayo de reportero luciferasa, qPCR y tinción de inmunofluorescencia.

Estudio de la señalización β TGF y la transición epitelial a mesenquimal inducida por TGF-β en cáncer de mama y células normales

Se describen métodos para investigar TGF-β2 inducida por EndMT en células endoteliales mediante la observación de los cambios en la morfología celular y el examen de la expresión endMT relacionados con los cambios de marcador utilizando la tinción de inmunofluorescencia. La edición del gen CRISPR/Cas9 fue descrita y utilizada para agotar el gen que codifica el caracol para investigar su papel en endMT inducido por TGF-β2.

TGF-β mediada por la transición endotelial a mesenquimal (EndMT) y la evaluación funcional de los efectores endMT utilizando la edición de genes CRISPR / Cas9

TGT surface es una plataforma innovadora para estudiar la diafonía factor de crecimiento-integrina. El diseño flexible de la sonda, la especificidad del ligando de adhesión y la modulación precisa de las condiciones de estimulación permiten evaluaciones cuantitativas sólidas de la interacción EGFR-integrina. Los resultados destacan a EGFR como un mecanismo de integrina de ajuste "mecano-organizador", que influye en el ensamblaje de la adhesión focal y la propagación celular.

Sondas de amarre de medidor de tensión para cuantificar la mecánica y la adhesión de la integrina mediada por el factor de crecimiento

Aprende a medir la contractilidad celular mediante microscopía de fuerza de tracción de alto rendimiento con PDMS. Este método permite estudiar los efectos del TGF-β en la transición epitelial a mesenquimal.

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Microscopía de fuerza de tracción de alto rendimiento Mediante PDMS revela efectos dependientes de la dosis de transformar el factor de crecimiento en la transición epitelial a mesenquimal

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