Name: Un modelo de ratón ortotópico inducido por hepatocitos oncogénicos que surge en el ajuste de la inflamación hepática y la fibrosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: Aprende a desarrollar un modelo ortotópico de hepatocarcinoma en ratón C57BL/6 usando técnicas de fibrosis hepática e inyección esplénica. Este método replica características inmunes del cáncer humano para estudiar inmunotolerancia tumoral y respuestas terapéuticas.

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Este trabajo cuenta con el apoyo de NIH/NCI R01 CA164335-01A1 (K. F. Staveley-O'Carroll, PI) y NIH/NCI R01CA208396 (Mark Kester, Guangfu Li, Kevin F. Staveley-O'Carroll).

NOTA: Todo el procedimiento, incluidos los sujetos de animales, ha sido aprobado por la IACUC de la Universidad de Missouri. Todos los ratones recibieron atención humana de acuerdo con los criterios descritos en la "Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio". El siguiente procedimiento para el aislamiento celular y la inoculación se debe realizar en una campana. Todos los artistas deben usar el equipo de protección personal estándar para el manejo de los ratones y tejidos.
1. Inducción de fibrosis hepática y cirrosis con inyección IP de tetracloruro de carbono (CCl4)
NOTA: Vea la Figura 1. (CCl4 es un reactivo altamente peligroso, debe manipularse con cuidado y con guantes resistentes a productos químicos)
<ol><li>Obtener ratones macho C57BL/6J de seis a ocho semanas de edad (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Preparar 10% CCl4 (v/v) solución en aceite de maíz en un tubo centrífugo. Determinar el volumen total en función del número de ratones a inyectar (ver paso 1.6).</li>
	<li>Utilice la técnica de manejo de ratones adecuada para seleccionar un ratón para inyección.</li>
	<li>Retenga manualmente el ratón con su lado dorsal (abdomen) hacia arriba.</li>
	<li>Limpie el lugar de inyección en la pared abdominal del ratón frotando con 70% de alcohol.</li>
	<li>Inyectar ratones macho C57BL/6J con 160 ml de 10% CCl4 solución por inyección intraperitoneal (IP) utilizando una aguja desechable de calibre 25.</li>
	<li>Asegúrese de que la aguja penetre justo a través de la pared abdominal (aproximadamente 4-5 mm) con bisel hacia arriba y ligeramente inclinado a 15-20 grados.</li>
	<li>Inyectar ratones dos veces por semana durante un total de cuatro semanas: cada ratón recibirá un total de ocho inyecciones. NOTA: Dos semanas después de la última inyección, los ratones tratados están listos para la inoculación ISPL de hepatocitos oncogénicos de ratones MTD2.</li>
</ol>2. Aislar los hepatocitos transgénicos en etiquetas de ratones MTD2 de línea
NOTA: Consulte la Tabla 1 para ver las recetas de la solución.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>10x Solución de sal equilibrada de Earle sin Ca o Mg (EBSS sin Ca o Mg)</td>
			<td>4 g KCl 68 g NaCl 1.4 g NaH2PO4 H2o 10 g dextrosa Añadir agua a 1 litro, pH a 4.32 Pasar a través del filtro</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solución 1</td>
			<td>20 mL 10x EBSS sin Ca o Mg 44 g NaHCO3 1.33 mL 1.5M Hepes 10 mL de 10 mL EGTA Añadir agua a 200 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solución 2</td>
			<td>100 mL 10x EBSS 2.2 g NaHCO3 6,67 ml 1,5 M Hepes Añadir agua a 1 litro</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.75% solución de colagenasa</td>
			<td>15 mg de colagenasa tipo 1 20 ml de solución 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Medio completo</td>
			<td>2 RPMI 50 mL FBS 5 mL 100x Penicilina-Estreptomicina</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Recetas de solución.
<ol><li>Obtenga la línea MTD2 ratones38 para servir como la fuente de hepatocitos oncogénicos.</li>
	<li>Anestetizar ratones MTD2 de 5 semanas de edad usando 2.5% isoflurano. NOTA: La anestesia adecuada se comprobará mediante el método de pellizcar de los dedos del dedo del pecho. En resumen, con dos dedos, dar al dedo del ratón / pie un buen apretón. Si no hay reacción de abstinencia, el animal es juzgado lo suficientemente profundo como para comenzar la cirugía.</li>
	<li>Cuando esté ndado adecuadamente, coloque los ratones en una posición supina y fije las extremidades con cinta adhesiva para proporcionar una exposición adecuada de la superficie abdominal.</li>
	<li>Realizar una incisión de laparotomía de línea media utilizando tijeras a lo largo de la longitud de la línea alba lo suficientemente grande como para proporcionar una exposición adecuada del hígado.</li>
	<li>Desplazar los intestinos hacia la izquierda para proporcionar una mejor exposición del hígado y la tríada del portal.</li>
	<li>Diseccionar por encima del hígado para exponer la vena cava inferior (IVC).</li>
	<li>Ligar el CIV por encima del hígado usando una abrazadera arterial.</li>
	<li>Volviendo al borde inferior del hígado, utilice una aguja de mariposa (ver materiales) para obtener acceso IV a la vena porta. Fije el catéter a mano.</li>
	<li>Perfundie sucesivamente el hígado del ratón utilizando una jeringa de inyección a 8,9 ml/min con 15 ml de solución 1, 15 ml de solución de colagenasa al 0,75% 2 y 15 ml de solución 2 a través del catéter.</li>
	<li>Cosecha el hígado perfundido cortando y tomando la masa tumoral de ratones MTD2 en un tubo cónico de 50 ml con 10-15 ml de PBS.</li>
	<li>Retire PBS y lave un tiempo adicional con PBS; no centrifugar en este paso.</li>
	<li>Corta el hígado en trozos más pequeños usando tijeras y luego lávate de nuevo con PBS 2x para eliminar la sangre restante.</li>
	<li>Añadir 5 ml de medio RPMI completo al tubo cónico y picar continuamente el hígado con tijeras a trozos pequeños (<3 mm)-tejido debe pasar suavemente a través de una pipeta de 5 ml.</li>
	<li>Agregue RPMI completo a un volumen final de 30 ml y suspenda el hígado con una pipeta de 5 ml.</li>
	<li>Filtrar la solución mixta con un colador de 70 m en un tubo cónico de 50 ml.</li>
	<li>Lave el colador varias veces con RPMI completo y ajuste el volumen final a 50 ml añadiendo medio RPMI adicional.</li>
	<li>Gire rápidamente la suspensión centrífuga hasta un máximo de 500 rpm; una vez que la velocidad se acelera a 50 x g, la centrífuga debe ser detenida.</li>
	<li>Decantar los gránulos sobrenadant y suspender en 20 mL de PBS.</li>
	<li>Cuente las celdas usando la exclusión azul de Trypan y un hemocitómetro, luego ajuste la concentración celular a 2.5 x 106/mL para la siguiente inoculación celular. NOTA: El rendimiento esperado de 5 gramos de tejido tumoral es de 80 millones de hepatocitos con viabilidad >95%.</li>
</ol>3. Inocular los hepatocitos de ratones MTD2 al hígado de ratones salvajes de tipo C57BL/6J por inyección de ISPL
<ol><li>La técnica aséptica debe utilizarse en todos los procedimientos</li>
	<li>Anestetizar los ratones macho C57BL/6J tratados con CCl4con 2,5% de isoflurano, los ratones deben ser tratados con lubricante para los ojos para evitar que los ojos se sequen.</li>
	<li>Prepare jeringas con 200 ml de hepatocitos inyectables.</li>
	<li>Cuando esté ndado adecuadamente, coloque los ratones con el lado izquierdo hacia arriba.</li>
	<li>Afeitar todo el flanco izquierdo de los ratones, luego fregar el área, alternando entre 70% de alcohol y betadina tres veces.</li>
	<li>Administrar 5 mg/kg de carprofeno subcutaneouly antes de la incisión quirúrgica.</li>
	<li>Hacer una incisión de 1 cm en el flanco izquierdo paralelo a lacostilla 13 desde el extremo dorsal que comienza justo debajo del músculo de la columna vertebral.</li>
	<li>Identifique el bazo y, a continuación, exteriorícelo con fórceps contundentes.</li>
	<li>Sujete el bazo con dos clips de titanio de tamaño medio. Coloque ambos clips entre la arteria esplénica y la vena, deje espacio entre los clips para cortar más tarde después de la inoculación. NOTA: El objetivo es aislar el polo inferior del bazo para reducir el riesgo de sembración.</li>
	<li>Inyectar 200 l (0,5 millones) de los hepatocitos preparados en el polo inferior del bazo utilizando una aguja de 27 G.</li>
	<li>Sujete la rama inferior del pedicular (vasos de poste esplénico inferior) con un clip de tamaño medio.</li>
	<li>Corte el bazo entre los dos clips colocados inicialmente.</li>
	<li>Retire el polo inferior del bazo que se inyectó directamente con células tumorales.</li>
	<li>Utilice 3-0 poliglactina 910 con sutura interrumpida para cerrar la capa muscular interna.</li>
	<li>Utilice clips de acero esterilizado para cerrar la capa externa de la piel. NOTA: Los clips de acero se prefieren sobre las suturas para evitar que los animales mastiquen suturas, dejando una herida abierta.</li>
	<li>Administrar 5 mg/kg de carprofeno por vía subcutánea después de la sutura.</li>
	<li>Coloque todos los animales en recuperación en una almohadilla de calentamiento con temperatura controlada y monitoree de cerca hasta que se recuperen completamente de la anestesia.</li>
	<li>Dé a los ratones acceso gratuito al agua después de la cirugía. Si el ratón se deshidrata durante la cirugía, administre líquidos subcutáneos (<1 ml).</li>
	<li>Retire los clips de piel a los 7-10 días posteriores a la operación.</li>
</ol>

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<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliposome+C6-ceramide+increases+the+anti-tumor+immune+response+and+slows+growth+of+liver+tumors+in+ice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Nanoliposome C6-ceramide increases the anti-tumor immune response and slows growth of liver tumors in ice.</a> Gastroenterology. 154, 1024-1036 (2018).</li>
<li>Held, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+antigen+expression+and+tumorigenesis+in+transgenic+mice+containing+a+mouse+major+urinary+protein%2FSV40+T+antigen+hybrid+gene%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">T antigen expression and tumorigenesis in transgenic mice containing a mouse major urinary protein/SV40 T antigen hybrid gene.</a> EMBO Journal. 8, 183-191 (1989).</li>
<li>Hanahan, D., Weinber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li>
</ol>

No hay nadie que declarar.

Con este protocolo, hemos establecido un modelo murino fiable y reproducible de HCC que imita la iniciación y progresión humana de HCC. Clínicamente, muchos factores de riesgo inducen sucesivamente lesiones hepáticas, fibrosis hepática, cirrosis y la etapa final del HCC. En nuestro protocolo, la inyección IP de CCl4 se utiliza primero para producir fibrosis hepática en ratones de tipo salvaje, lo que permite que los posteriores hepatocitos oncogénicos formen los tumores en el entorno de la fibrosis hepática. E...

El cáncer hepatocelular (HCC) es el tipo de cáncer que aumenta más rápidamente en los Estados Unidos (EE.UU.)1,2,3. Cada año, aproximadamente 850.000 nuevos casos se diagnostican4,5 y 700.000 pacientes mueren a causa de esta enfermedad letal6,7,8,9,10 , lo que la convierte en la segunda causa más alta de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo. El manejo de HCC incluye resección quirúrgica, trasplante, ablación, quimioembolización o terapias sistémicas, como sorafenib11. El diagnóstico y el manejo tempranos con resección quirúrgica o trasplante tienen el mayor beneficio de supervivencia global4. Desafortunadamente, la mayoría de los pacientes se presentan en una etapa posterior y requieren tratamiento con ablación, quimioembolización o sorafenib12. Sorafenib, un inhibidor receptor de tirosina quinasa (RTKI), fue aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos en 2008 como la única terapia de medicamentos sistémicos disponible para el tratamiento de HCC no resecable. Aunque el fármaco sólo proporciona un aumento modesto en la supervivencia global, de 7.9 a 10.7 meses13, proporcionó una nueva estrategia terapéutica que podría ser utilizado para manejar HCC.
Manipular el sistema inmunitario para eliminar los cánceres establecidos es un campo de rápido crecimiento en la investigación del cáncer14. Los estudios de punto de control inmune han avanzado considerablemente el desarrollo de fármacos inmunoterapéuticos en el tratamiento del cáncer15,16. La FDA aprobó el uso de anticuerpos (Abs) contra el antígeno t-linfocitos T citotóxico 4 (CTLA-4), la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1), y su ligando PD-L1 para el tratamiento del melanoma, el cáncer de pulmón, el cáncer de cabeza y cuello, y el cáncer de vejiga17, 18 , 19 , 20. Los ensayos clínicos de monoterapia o terapia combinada con uno o varios anticuerpos contra PD-1, PD-L1 o CTLA-4 para el tratamiento de la HCC avanzada están en curso21,22,23,y algunos ensayos han mostrado resultados favorables. En 2017, la FDA otorgó la aprobación acelerada para el anticuerpo anti-PD-1 para tratar a los pacientes con HCC, que son resistentes a sorafenib, pero la tasa de respuesta general de esta terapia es de sólo 14.3%. Otras estrategias no se han traducido en la práctica clínica en este momento24,25. Superar la tolerancia inmune profunda inducida por tumores para mejorar la terapia de punto de control inmune26; predecir la eficacia de la terapia de punto de control inmune; prevenir eventos adversos relacionados con el sistema inmunitario; optimizar la ruta de administración, la dosis y la frecuencia; y encontrar combinaciones efectivas de terapias27,28,29 siguen siendo tareas extremadamente desafiantes.
Hay varios enfoques convencionales utilizados para inducir HCC en modelos de ratón actualmente y se utilizan dependiendo de la pregunta de investigación particular del investigador30. Los modelos de ratón HCC inducidos químicamente con compuestos genotóxicos imitan la neoplasia maligna inducida por lesiones. Los modelos de xenoinjerto a través de la implantación ectópica u ortotópica de líneas celulares HCC son adecuados para la detección de fármacos. Varios ratones modificados genéticamente han sido diseñados para investigar la fisiopatología del HCC. Los ratones transgénicos que expresan genes virales, oncogenes y/o factores de crecimiento permiten la identificación de las vías implicadas en la hepatocarcinogénesis. Debido a las limitaciones inherentes, estos modelos no recapitulan las características inmunitarias típicas que se ven en el HCC humano, lo que ha impedido significativamente el esclarecimiento de los mecanismos subyacentes y el desarrollo de estrategias inmunoterapéuticas innovadoras14 ,15. Recientemente hemos creado un modelo murino clínicamente relevante. Este nuevo modelo no sólo imita la iniciación y progresión humana de HCC, sino que también refleja las características más típicas de la enfermedad humana, incluida la disfunción inmune. Hemos caracterizado sus características biológicas e inmunológicas. Aprovechando este novedoso modelo, hemos explorado diversas estrategias inmunoterapéuticas para tratar HCC31,32,33,34,35,36, 37. Esta plataforma única nos permite estudiar mecanismos de inmunotolerancia inducida por tumores y desarrollar estrategias terapéuticas de prueba de concepto para HCC hacia la posterior traducción clínica.

<table><tbody><tr><td>Máquina de anestesia</td><td>VETEQUIP</td><td>IMPAC6</td><td>máquina de anestesia para cirugía</td></tr><tr><td>Aguja de mariposa</td><td>BD</td><td>8122963</td><td>Aguja utilizada para la perfusión hepática</td></tr><tr><td>C57BL/6 ratones</td><td>Jackson Lab</td><td>000664&nbsp;</td><td>Ratones utilizados en Prototol</td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td>CRESCENT CHEMICAL</td><td>20402</td><td>carprofeno para la liberación del dolor</td></tr><tr><td>Cell Strainer&nbsp;</td><td>CORNING</td><td>REF 431751</td><td>Filtro de células, 70&micro; m, para el aislamiento de hepatocitos</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-30R</td><td>para el aislamiento</td></tr> celular <tr><td>Clips&nbsp;</td><td>Teleflex Medical</td><td>REF 523700</td><td>Clips de titanio para</td></tr><tr><td>microscopio</td> de bazo <td>Zeiss</td><td>Primovert&nbsp;</td><td>Microscopio para observación celular</td></tr><tr><td>Ratones Mtd2</td><td>N/A</td><td></td><td>Regalo del Dr. William A Celebrado en el Roswell Park Cancer Institute en 2002, mantenido en nuestro laboratorio</td></tr><tr><td>Aguja</td><td>BD</td><td>REF 305109</td><td>BD Aguja de precisiónGlide, 27G x 1/2 (0,4 mm x 13 mm)</td></tr><tr><td>Sutura</td><td>ETHICON</td><td>J303H</td><td>Sutura VICRYL recubierta</td></tr><tr><td>SV40 T Anticuerpo Ag</td><td>Abcam</td><td>ab16879</td><td>anti-SV40 Anticuerpo anti-antígeno T para IHC</td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>BD</td><td>REF 309626</td><td>Jeringa TB de 1 mL para inyección celular</td></tr><tr><td>Azul de tripán</td><td>SIGMA</td><td>T 8154</td><td>Solución de azul de tripán para prueba de viabilidad celular</td></tr><tr><td>Pinzas para heridas</td><td>Reflex</td><td>reflex9, Nº de pieza 201-1000</td><td>pinzas de acero inoxidable para cierre de heridas</td></tr></tbody></table>

un modelo de ratón ortotópico inducido por hepatocitos oncogénicos que surge en el ajuste de la inflamación hepática y la fibrosis

An Oncogenic Hepatocyte-Induced Orthotopic Mouse Model of Hepatocellular Cancer Arising in the Setting of Hepatic Inflammation and Fibrosis

La ausencia de un modelo animal clínicamente relevante que aborde las características inmunitarias típicas del cáncer hepatocelular (HCC) ha impedido significativamente el esclarecimiento de los mecanismos subyacentes y el desarrollo de estrategias inmunoterapéuticas innovadoras. Para desarrollar un modelo animal ideal recapitulando HCC humano, los ratones machos inmunocompetentes C57BL/6J reciben primero una inyección de tetracloruro de carbono (CCl4) para inducir fibrosis hepática, luego reciben hepatocitos oncogénicos histológicamente normales de machojoven joven Ratones transgénicos de antígeno SV40 T (TAg) (MTD2) por inoculación intraesplénica (ISPL). Los andrógenos generados en ratones machoreceptores en la pubertad inician la expresión de TAg bajo el control de un promotor específico del hígado. Como resultado, los hepatocitos transferidos se convierten en células cancerosas y forman masas tumorales en el entorno de la fibrosis/cirrosis hepática. Este novedoso modelo imita la iniciación y progresión humana de hCC en el contexto de la fibrosis/cirrosis hepática y refleja las características más típicas de la HCC humana, incluida la disfunción inmune.

Los hepatocitos oncogénicos aislados de ratones transgénicos tag(Figura 2) fueron sembrados en el hígado de ratones de tipo salvaje por inyección intraesplénica(Figura 3). Los hepatocitos trasplantados crecieron con éxito y de forma fiable tumores ortotópicos de HCC(Figura 4) con antígeno específico tumoral SV40 TAg (Figura 5) en el entorno de inflamación hepática y fibrosis (Figura 1).
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Aquí, describimos el desarrollo de un modelo murino clínicamente relevante de cáncer de hígado recapitulando las características inmunitarias típicas del cáncer hepatocelular (HCC).

Un modelo de ratón ortotópico inducido por hepatocitos oncogénicos que surge en el ajuste de la inflamación hepática y la fibrosis

The absence of a clinically relevant animal model addressing the typical immune characteristics of hepatocellular cancer (HCC) has significantly impeded ...

El uso de un modelo para desarrollar un modelo de masa de cáncer hepatocelular podría ayudar a las personas a dilucidar su inmunotolerencia inducida por tumores y a la inmunosuencia de tumores específicos. El tumor ortotópico que se desarrolla con la técnica de fibrosis hepática imita las características clínicas del cáncer de hígado humano. Este método podría proporcionar una herramienta útil en el estudio inmunológico del cáncer hepatocelular.La demostración visual de este método puede ilustrar los pasos más difíciles técnicamente, como la inyección intraesplénica, que son esenciales para una ejecución exitosa de este protocolo. A continuación, sujeta manualmente a un macho, de seis a ocho semanas de edad de edad 6 ratón de lado dorsal hacia arriba. Utilice exfoliantes alternativos de 70% de etanol y Betadina para limpiar el lugar de inyección tres veces.A continuación, entregue 160 microlitros de tetracloruro de carbono al ratón mediante inyección intraperitoneal y devuelva al animal a su jaula de origen. Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie, en un ratón transgénico de antígeno simiano de cinco meses de edad, coloque el ratón en la posición supina y asegure las extremidades con cinta adhesiva. Hacer una incisión de laparotomía de línea media a lo largo de la longitud de la linea alba, lo suficientemente grande como para proporcionar una exposición adecuada del hígado, y desplazar los intestinos hacia la izquierda.Disecciona sobre el hígado para exponer la vena cava inferior. Inducir una abrazadera de arteria para ligar el vaso. Utilice una aguja de mariposa para obtener acceso intravenoso a la vena porta y asegurar manualmente el catéter.Cambiando cuidadosamente las jeringas para cada solución, entregando con éxito 15 mililitros de solución uno, 15 mililitros de 0.75%solución de colagenasa dos, y 15 mililitros de solución dos sin colagenasa a través del catéter, a un aproximado de 8,9 mililitros de solución por minuto de flujo. Al final de la perfusión, cosecha la masa tumoral en un tubo cónico de 50 mililitros que contiene de 10 a 15 mililitros de PBS. Excóstate del tumor del próximo ratón MTD2 como se acaba de demostrar.Usa tijeras para cortar los hígados en trozos más pequeños. Transfiera los tejidos a un nuevo recipiente de PBS fresco para extraer el resto de la sangre del tejido antes de transferir las piezas de tejido a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga cinco mililitros de medio RPMI completo. Mince las muestras de hígado lavado hasta que las piezas pueden caber fácilmente a través de la punta de una pipeta de cinco mililitros.Añadir suficiente medio al tubo para alcanzar un volumen final de 30 mililitros. Utilice una pipeta de cinco mililitros para triturar los fragmentos de tejido, antes de filtrar la solución a través de un colador de 70 micrómetros en un nuevo tubo de 50 mililitros. Lavar el colador varias veces con un medio completo.Ajuste el volumen final a 50 mililitros con un medio completo adicional. Gire rápidamente la suspensión por centrifugación hasta un máximo de 50 veces g antes de detener la centrífuga y decantar el sobrenadante. A continuación, resuspender el pellet en 20 mililitros de PBS para el conteo.Para la inyección intraesplej de los hepatocitos MTD2, cargue una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 27 por cada animal receptor con 220 microlitros de hepatocitos por ratón. Confirme la falta de respuesta a la pellizca del dedo del pie en un animal anestesiado tratado con tetracloruro de carbono. Comenzando justo debajo del músculo de la columna vertebral, a continuación, hacer una incisión de un centímetro en el flanco izquierdo paralelo a la costilla decimotercera del extremo dorsal y utilizar fórceps de punta roma para exteriorizar el bazo.Sujeta el bazo con dos clips de titanio de tamaño medio entre la arteria esplénica y la vena, y entrega 200 microlitros de células en el polo inferior del bazo. Recorte la rama inferior del pediculo con un clip de tamaño medio y corte el bazo entre los dos clips colocados inicialmente. Retire el polo inferior del bazo que se inyectó directamente con las células tumorales y utilice 3-0 poliglactin 910 sutura interrumpido para cerrar la capa muscular interna.A continuación, utilice clips de herida de acero esterilizado para cerrar la capa externa de la piel y administrar por vía subcutánea cinco miligramos por kilogramo de carprofeno. Después del aislamiento de ratones transgénicos de antígeno T como se ha demostrado, se pueden observar hepatocitos y células infiltrantes tumorales. Las células suelen demostrar una viabilidad de casi el 100% después del procesamiento.Después de la inoculación intrasplénica en animales tratados con tetracloruro de carbono de tipo salvaje, los hepatocitos trasplantados crecen con éxito y de forma fiable tumores de carcinoma hepatocelular ortotópicos que expresan el antígeno simiano específico del tumor 40 T. La preparación de nuestra población viable y pura de hepatocitos a partir de la masa MTD2 y la administración precisa de la inyección intraesplénica son importantes para el éxito del procedimiento. Aunque nuestro equipo ha probado la inoculación de hepatocitos en ratones receptores a través de la inyección intravascular e intraperitoneal, estos otros métodos no fueron capaces de inducir carcinoma hepatocelular ortotópico.Este modelo proporciona una plataforma única que permite la investigación de la vigilancia inmune y la tolerancia en sus etapas tempranas y posteriores de la progresión tumoral. Tenga cuidado al usar el tetracloruro de carbono, ya que es tóxico.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

La infección de ratones con un adenovirus que expresan el autoantígeno humano importante del citocromo P450 2D6 (hCYP2D6) reconocidos por los sueros de los pacientes con tipo 2, los resultados de hepatitis autoinmune en una forma persistente de la enfermedad hepática autoinmune mediada por la hepatitis se caracteriza por una amplia fibrosis, y la generación de un CYP2D6 la respuesta inmune específica.

El CYP2D6 Animal Modelo: cómo inducir a la hepatitis autoinmune en ratones

Xenoinjertos tumorales humanos en ratones inmunodeficientes son herramientas valiosas para el estudio de la biología del cáncer. Se describen los protocolos específicos para generar los xenoinjertos subcutáneos y intrahepática de células de carcinoma hepatocelular humano o fragmentos tumorales. La regeneración hepática inducida por hepatectomía parcial en ratones receptores se presenta como una estrategia para facilitar el injerto intrahepática.

Generación de subcutánea e intrahepática hepatocelular carcinoma humano xenoinjertos en ratones inmunodeficientes

La interrupción del flujo biliar da lugar a una lesión hepática colestásica inflamatoria grave con una secuencia característica de alteraciones morfológicas dependientes del tiempo. En este trabajo presentamos un protocolo para la ligadura quirúrgica de la colédoca en ratones que permite inducir una fuerte respuesta fibrótica a los 21 a 28 días.

Ligadura del conducto biliar en los ratones: Inducción de la injuria hepática inflamatoria y fibrosis por colestasis obstructiva

La diseminación metastásica del cáncer es la principal causa de muerte por cáncer. Proporcionamos una descripción en profundidad de nuestra metodología de la cirugía de supervivencia para el establecimiento de un sistema de modelo de ratón singénico "-paciente como" ortotópico para el estudio de los mecanismos de la metástasis en tumores de órganos sólidos.

Un &quot;paciente-Like&quot; ortotópico Singénico modelo de ratón de carcinoma hepatocelular Metástasis

Este protocolo proporciona un método confiable para establecer ratones humanizados con el sistema inmunitario humano y las células hepáticas. Los ratones inmunodeficientes duales reconstituidos logrados mediante inyección intraesplénica de hepatocitos humanos y células madre CD34+ hematopoyéticas son susceptibles a la infección por el virus de inmunodeficiencia humana-1 y al daño hepático recapitulado observado en Pacientes infectados por el VIH.

Establecimiento del modelo de ratón TK-NOG humanizado dual para la patogénesis hepática asociada al VIH

Este protocolo presenta un modelo biomimético 3D con compartimento estromal fibromático que lo acompaña. Preparado con hidrogeles fisiológicamente relevantes en proporciones que imitan las propiedades biofísicas de la matriz extracelular estromal, un mediador activo de interacciones celulares, crecimiento tumoral y metástasis.

Un modelo biomimético para el cáncer de hígado para estudiar las interacciones tumorales-estroma en un entorno 3D con propiedades biofísicos ajustables

La inyección de organoides de cáncer colorrectal (CCR) en la vena porta genera metástasis hepáticas ricas en estroma. Este modelo de ratón de metástasis hepática del CCR representa una herramienta útil para estudiar las interacciones tumor-estroma y desarrollar nuevas terapias dirigidas al estroma, como las terapias génicas mediadas por virus adenoasociadas.

Inyección en la vena porta de organoides de cáncer colorrectal para estudiar la metástasis hepática del estroma

Aquí, presentamos un protocolo para crear xenoinjertos de carcinoma hepatocelular ortotópico con y sin ligadura de la arteria hepática y realizar imágenes no invasivas de tomografía por emisión de positrones (PET) de hipoxia tumoral utilizando [18 F] fluoromisonidazol ([18 F] FMISO) y [18 F] fluorodesoxiglucosa ([18F] FDG).

Imágenes PET/MR no invasivas en un modelo ortotópico de ratón de carcinoma hepatocelular

Los organoides generados a partir de los tumores de los pacientes se inyectan ortotópicamente en el hígado del ratón. La resección del tejido hepático no tumoral conduce a un entorno regenerativo en el tejido hepático donde se encuentra el tumor.

Un modelo de xenoinjerto de organoide derivado de pacientes con cáncer hepatocelular para investigar el impacto de la regeneración hepática en el crecimiento tumoral

El modelo murino de hepatectomía parcial 2/3 (66%) está bien descrito en la literatura, pero rara vez se han utilizado hepatectomías más extendidas que imitan el síndrome de tamaño pequeño después del trasplante hepático. Describimos un procedimiento de hepatectomía extendida del 78% en un modelo de ratón que resulta en aproximadamente un 50% de letalidad postoperatoria en ratones sanos.

Hepatectomía extendida al 78% en un modelo quirúrgico de ratón

Este protocolo presenta una cadena de imagen completa para visualizar y modelar la morfología de las células estrelladas hepáticas en tejido hepático intacto. Este enfoque combina marcaje fluorescente de fibroblastos usando genética de ratón, preparación tisular in situ basada en perfusión hepática y un método modificado de limpieza de tejidos iDISCO para lograr transparencia óptica.

Mapeo de la morfología de las células estrelladas hepáticas en modelos murinos de fibrosis hepática

Aprende a desarrollar un modelo ortotópico de hepatocarcinoma en ratón C57BL/6 usando técnicas de fibrosis hepática e inyección esplénica. Este método replica características inmunes del cáncer humano para estudiar inmunotolerancia tumoral y respuestas terapéuticas.

Un modelo de ratón ortotópico inducido por hepatocitos oncogénicos que surge en el ajuste de la inflamación hepática y la fibrosis (Video) | JoVE Journal

Un modelo de ratón ortotópico inducido por hepatocitos oncogénicos que surge en el ajuste de la inflamación hepática y la fibrosis

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