Nuevo protocolo para la generación de células dendríticas inmunogénicas fisiológicas

Las células de representación de antígenos dendríticos fisiológicos, llamadas PhDC, son los interruptores maestros inmunes que inician la inmunidad y tolerancia de células T específicas del antígeno. Este documento delinea un método eficiente para la producción de PhDC. El uso clínico de células dendríticas se ve obstaculizado por los métodos de citoquina no fisiológica utilizados para producirlas.

Nuestro método supera ese problema a través de la señalización plaquetaria eficiente de la conversión de monocitos a CC en humanos y ratones. Estos PhDC no dependen de condiciones de citoquinas no disponibles in vivo, por lo que pueden generar potentes respuestas clínicas contra tumores de células T tanto en humanos como en ratones con cánceres establecidos. El inicio plaquetario independiente de la especie de maduración monocito a phDC tiene una amplia aplicabilidad experimental.

PhDC permite la disección de la fisiología de células dendríticas, facilita la inducción de la inmunidad terapéutica contra el cáncer a los cánceres inmunogénicos y ofrece promesas para la vacunación antimicrobiana personalizada. Este sistema experimental es novedoso, y múltiples aspectos de la misma, como el recubrimiento de la cámara de plástico, el tratamiento de células tumorales con 8-MOP/UVA, las condiciones de flujo y la liberación de monocitos están mejor representados visualmente. Demostrando el procedimiento estará Eve Robinson, una técnico de mi laboratorio.

Para recoger las células mononucleares de sangre periférica, primero configure un tubo de 15 mililitros con cuatro mililitros de medio de aislamiento de linfocitos por cada cinco a 10 ratones sangraron. Luego, la sangre de capa lenta se extrae de ratones portadores de tumores en la parte superior del medio. Gire las células a 1.000 a 1.500 veces-G durante 20 minutos para separar los PBMC de los glóbulos rojos.

Al final de la centrifugación, recoger la capa de plasma superior, dejando 0.5 mililitros queman por encima de la capa de buffy, y almacenar en cuatro grados Celsius para su uso posterior. A continuación, recoja la capa de capa buffy en un tubo limpio de 15 mililitros lleno de PBS a 15 mililitros, y gire a 250 veces G en una centrífuga de cultivo de tejido estándar durante 10 minutos para recoger el PBMC. Al final de la centrifugación, pipetee cuidadosamente el sobrenadante y deslice el tubo para resuspender el pellet.

Luego agregue dos mililitros de tampón de lysis de glóbulos rojos ACK al tubo para eliminar los glóbulos rojos restantes de la PBMC. Incubar el PBMC sobre hielo durante 10 minutos. Llene el tubo con PBS a 15 mililitros, y gire hacia abajo a 250 veces-G en una centrífuga de cultivo de tejido estándar durante 10 minutos para recoger el PBMC.

Pipetee cuidadosamente el sobrenadante y deslice el tubo para aflojar el pellet. Resuspender el pellet en 300 microlitros de FBS. Para preparar células tumorales YUMM1.7 por grupo de tratamiento, primero resuspendir el gránulo de células tumorales en FBS en 2,5 millones de células por cada 300 microlitros.

Con las luces de la campana de cultivo de tejido apagadas, agregue 8-methoxypsoralen para una concentración final de 100 nanogratro por mililitro a la suspensión de células tumorales YUMM1.7. A continuación, mezcle las células, envuelva el recipiente celular en papel de aluminio e incubar a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Para pre-recubrir una placa de cultivo de tejido de 12 pozos, agregue un mililitro de FBS a un pozo por cada grupo de tratamiento de cinco ratones, y refrigerar la placa a cuatro grados Centígrados durante 20 minutos.

Después de 20 minutos, bajo una capucha de cultivo de tejido, retire la FBS de los pozos y agregue 300 microlitros de células tumorales expuestas por metoxipsoralen por pozo. A continuación, exponga la placa que contiene la célula a la fuente de luz ultravioleta precalentó para la irradiación total de cuatro julios por centímetro cuadrado. Para recoger células tumorales tratadas con 8-methoxypsoralen/UVA de cada pozo, gire la placa y la pipeta cuidadosamente para asegurar una recuperación completa de la célula.

Para realizar el paso de la placa de transimunización para cada grupo de tratamiento de cinco ratones, combine 300 microlitros del PBMC apropiado y 300 microlitros de células tumorales tratadas con 8-methoxypsoralen/UVA en un tubo cónico de 1,5 mililitros y mezcle las células. A continuación, abra las abrazaderas de tubo de entrada y salida de la placa TI. Utilice una jeringa de 10 mililitros para llenar el tubo TI con FBS, cerrando las abrazaderas mientras se llena el tubo para retener FBS dentro del tubo.

Desconecte la jeringa. Coloque una punta de pipeta P1000 firmemente en la toma de la placa TI. Sostenga la placa en un ángulo de 45 grados y llene la placa lentamente con PBMC y mezcla de células tumorales, evitando burbujas.

Retire la punta de la pipeta de la toma antes de soltar el émbolo de la pipeta. Devuelva las células restantes al tubo cónico de 1,5 mililitros. Incubar el tubo lleno de FBS, la placa TI llena de células y el tubo cónico de 1,5 mililitros que contiene las células restantes en la incubadora de cultivo de tejido a 37 grados celsius durante una hora.

Después de la incubación, suelte las abrazaderas y vacíe el tubo TI por gravedad. A continuación, inserte una punta de pipeta P1000 con el émbolo presionado en el puerto de la placa para extraer las celdas de la placa TI. Sujete la placa en un ángulo de 45 grados y llene la punta de la pipeta P1000.

Coloque las células de nuevo en su tubo cónico original de 1,5 mililitros. Para ejecutar la placa TI, conecte el tubo de salida a la placa y fije la placa TI en el sistema de funcionamiento de la placa. A continuación, utilizando una jeringa de un mililitro, extraiga esos 600 microlitros de PBMC y mezcla de células tumorales del tubo cónico de 1,5 mililitros.

Fije la jeringa al tubo de entrada con la abrazadera abierta y llene lentamente hasta que el líquido llegue al final del tubo. Coloque el extremo libre del tubo de entrada a la placa TI y continúe cargando suavemente el volumen restante. Cierre la abrazadera de entrada cuando haya terminado.

Separe la jeringa de un mililitro y conecte el tubo de entrada a la bomba de la jeringa. Asegure el tubo de salida a un tubo cónico limpio de 1,5 mililitros para la recolección celular. Ajuste el caudal de la bomba de jeringa a 0,09 mililitros por minuto.

Incline la placa TI aproximadamente 30 grados hacia el lado de la bomba de la jeringa utilizando una plataforma de funcionamiento de la placa TI. Suelte con cuidado la abrazadera del tubo de entrada. Encienda la bomba de la jeringa, observando cuidadosamente cómo se llena la placa TI.

Una vez que la placa TI esté completamente llena, inclínelo aproximadamente 30 grados en la dirección opuesta a medida que se vacía. Cuando todas las células del líquido estén en el tubo de recogida cónica de 1,5 mililitros, detenga la bomba. Para lavar la placa TI, desconecte el tubo de entrada de la bomba de la jeringa y conéctelo a una jeringa de un mililitro llena de 600 microlitros de FBS.

Rellene hasta que FBS esté completamente cargado. A continuación, desconecte la jeringa y conecte el tubo a la bomba de la jeringa. Ajuste el caudal de la bomba de jeringa a 0,49 mililitros por minuto.

Suelte la abrazadera de entrada y ejecute la placa TI, recogiendo el lavado en el mismo tubo cónico de 1,5 mililitros. Deslice o toque suavemente la placa TI todo el tiempo para ayudar a separar y eluir las células adherentes a medida que la placa se vacía. Desconecte el tubo cónico de 1,5 mililitros de la placa TI.

Gire el tubo de recogida en la microfure de sobremesa a 250 veces G durante ocho minutos y deseche el sobrenadante. Para realizar la coincimocimiento durante la noche de PBMC con antígeno, primero resuspendir el PBMC y el pellet de células tumorales en dos mililitros de RPMI claro complementado con 15% de suero de ratón autólogo. Luego, las células de la placa en un plato estéril tratado con cultivo de tejido no de 35 milímetros, e incubar durante la noche bajo condiciones estándar de cultivo de tejido.

Al día siguiente, separe cuidadosamente las células adherentes de la parte inferior del plato con un rascador de cultivo de tejido. Gire el plato mientras raspa para asegurar una recolección uniforme de la célula. Recoger las células en un tubo de 15 mililitros.

Añadir dos mililitros de PBS al plato, y repetir el paso de raspado, recogiendo las células en el mismo tubo. Enjuague el plato de 35 milímetros con un mililitro de PBS, y agregue el enjuague al mismo tubo. Girar a 250 veces-G en una centrífuga de cultivo de tejido estándar durante 10 minutos para recoger las células.

Pipetear cuidadosamente el sobrenadante, luego mover el tubo para resuspender el pellet. La terapia mostró una reducción del crecimiento tumoral de YUMM1.7 en más de 100 ratones tratados frente a ratones de control, como se observa en los datos acumulados de crecimiento tumoral de nueve experimentos independientes realizados durante dos años. Las curvas representativas de crecimiento tumoral para animales individuales dentro de un experimento proporcionan una sensación de variabilidad en el sistema.

Cuando los monocitos o las plaquetas se agotan de la fracción PBMC, o cuando se omite el paso de la placa, el efecto terapéutico ya no se observa. El tratamiento es ineficaz en ausencia de las células inmunitarias o de una fuente de antígeno, o en presencia de un antígeno no coincidente, como tumores YUMM1.7 tratados con células de carcinoma de colon MC38. Para un resultado inmunizante, también es fundamental evitar la exposición de PBMC a 8-methoxypsoralen.

El análisis FACS del cambio de los marcadores indicados de los controles IgG correspondientes en células CD11c+ humanas entre PBMC recién aislado, PBMC tratado con TI, PBMC tratado con TI sin paso de placa, plaquetas agotadas antes del paso de la placa, o ambos de los anteriores, mostró que la activación de CC depende de la presencia de plaquetas en el PBMC, y del paso de la placa TI. Los DC humanos activados por TI pueden procesar y presentar eficazmente antígenos de péptidos o antígenos de células tumorales humanas expuestas a 8-methoxypsoralen para activar líneas celulares T específicas de antígenos humanos en ensayos in vitro de una manera dependiente de TI y plaquetas. La especificidad de las respuestas de los células T depende de la fuente de los antígenos procesados.

Al inducir la inmunidad contra el cáncer, la apoptosis de cada línea de células cancerosas debe valorarse para maximizar la inmunogenicidad. Dado que la inmunidad inducida será específica para inmunizar antígenos, será posible una disección detallada de cada sistema. Cada cáncer experimental o clínico, y cada respuesta antimicrobiana, será únicamente informativo.

Cada cáncer humano individual tiene su propia variedad de antígenos específicos del tumor. El PhDC realiza la clasificación y presentación necesarias de antígenos tumorales, sin necesidad de su identificación previa de laboratorio. Tenga en cuenta que la luz 8-MOP y UVA son carcinógenos.

Utilice el equipo de protección adecuado y siga los procedimientos de seguridad cuando manipule 8-MOP y cuando trabaje con fuentes de luz UVA.