Name: Ensayos in Vitro Ubiquitination y Deubiquitination de histonas nucleosomales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Aprende ensayos de ubiquitinación y desubiquitinación in vitro para estudiar modificaciones postraduccionales de histonas nucleosomales. Este método permite identificar dominios enzimáticos y desarrollar cribados de inhibidores.

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Agradecemos a Diana Adjaoud por la asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Consejo de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (2015-2020), Genome Quebec (2016-2019) y Genome Canada (2016-2019) a E.B.A. E.B.A. es un estudiante senior de los Fonds de la Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). L.M y N.S.K. tienen una beca de doctorado del FRQ-S. H.B tenía una beca de doctorado del Ministerio de Educación Superior y de Investigación Científica de Túnez y la Fundación Cole.

1. GSH-agarose Purificación de afinidad del complejo GST-RING1B(1-159)-BMI1(1-109) E3 Ubiquitin Ligase
<ol><li>Utilice la construcción de expresión de bacterias pGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1 (1 -109aa) para transformar la bacteria BL21 (DE3) (ver Tabla de Materiales)23. Esta construcción permite la expresión del dominio RING1B murino 1-159 fusionado al dominio 1-109 BMI1 con la etiqueta GST en la estructura básica pGEX-6P-2.</li>
	<li>Realizar un cultivo de arranque durante la noche mediante la inoculación de ril-bacterias que expresan GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1(1 -109 aa) en 20 mL de medio de caldo LB en presencia de 100 g/ml de ampicilina y 50 g/ml de cloranfenicol. Incubar agitando a 37oC durante la noche. Al día siguiente, añadir el cultivo inicial a un matraz de 1 L que contenga 500 ml de medio de caldo LB fresco (1/26 de dilución) con ampicilina e incubar el cultivo en la coctelera a 37 oC durante 2 a 4 h.</li>
	<li>
Durante el tiempo de incubación, mida la DO a 600 nm con un espectrofotómetro. Cuando el cultivo de bacterias alcance 0,6 unidades de DoC a 600 nm, tome una alícuota de 1 ml en un tubo de 1,5 ml como muestra no inducida. Añadir 400 m de Isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) al cultivo de 1 L para inducir la expresión de proteínas. Incubar bacterias a 25oC durante 6 h hasta la noche.
	<ol>
<li>Centrifugar las alícuotas de 1 ml a 14.000 x g durante 30 s, desechar el sobrenadante, resuspender el pellet en 200 ml de tampón de muestra de Laemmli, y mantener para el análisis SDS-PAGE y Coomassie azul de inducción de proteínas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfiera el cultivo de bacterias inducido del matraz a una botella de centrifugación limpia y gire hacia abajo a 3.500 x g durante 15 min a 4 oC. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet con 40 ml de PBS frío y gire hacia abajo a 3.500 x g durante 15 min a 4 oC.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y congele el pellet a -80 oC o proceda al siguiente paso. Si las proteínas son inducidas en el peso molecular esperado, proceda al siguiente paso.</li>
	<li>Resuspender el pellet de bacterias en 25 ml de tampón de lisis helada A (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, EDTA de 1 mM, 1% NP40, 1 mM PMSF, TDT de 0,5 mM y cóctel antiproteasa 1/100 que contiene AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptina y Pepstatina A). Asegúrese de que todas las bacterias pellet se resuspenden. El pMSF y el cóctel antiproteasa deben añadirse recién al tampón de lisis, solo en el momento de la lisis bacteriana. PRECAUCION: Mantenga siempre la muestra en hielo. NOTA: Se puede añadir lisozyme a 100 g/ml para mejorar la lisis bacteriana.</li>
	<li>Incubar las bacterias lisiar sobre hielo durante 15 min. Utilice un sonicador de sonda y sonicar a una amplitud de salida del 70% durante 30 s (4-5x), y luego centrifugar a 21.000 x g durante 20 min a 4 oC. PRECAUCION: Durante la sonicación, mantenga siempre las muestras en hielo.</li>
	<li>Durante el tiempo de centrifugación, tomar perlas GSH-agarose embaladas de 500 l (50% lodos) en un tubo de 15 ml y añadir 10 ml de tampón A sin PMSF y antiproteasas. Mezcle brevemente y gire a 2.500 g durante 3 minutos a 4 oC, repita este paso de lavado dos veces más y mantenga las cuentas sobre hielo.</li>
	<li>Después de la centrifugación de lisado bacteriano, recoger el sobrenadante y transferirlo a un tubo cónico de 50 ml. Tome una alícuota de 100 l como un lisato total y agregue 100 l de 2 tampón de muestra de Laemmli para el análisis sDS-PAGE y azul de Coomassie.</li>
	<li>Filtrar el lisado a través de un filtro de jeringa de poro de 0,45 m y mezclarlo con las perlas GSH. Incubar a 4oC con agitación durante 5 h. Gire las perlas a 2.500 x g durante 3 min, retire y guarde el sobrenadante a medida que fluye. Lavar las perlas unidas a proteínas-GSH 6 veces (5 ml cada una) con tampón A que contiene cóctel antiproteasa y PMSF.</li>
	<li>Después del último lavado, transfiera las perlas junto con 10 ml de tampón a una columna de cromatografía vacía, agregue 1,5 ml de tampón A que contenga 25 mM de glutatión y recoja la elución por gravedad en microtubos de 1,5 ml. Repita el procedimiento de elución 4 veces. NOTA: La solución de glutatión se prepara a una concentración de 200 mM en 50 mM Tris-HCl, pH 7,5</li>
	<li>Tome una alícuota de 10 ml de cada una de las 4 eluciones y agregue 10 l de 2 x tampón de muestra de Laemmli. Estas muestras se utilizarán para el análisis sDS-PAGE y azul de coomassie para determinar la presencia y la pureza de las proteínas purificadas. NOTA: Después de la última elución, mantenga las perlas en tampón a 4 oC para su reciclaje y uso futuro.</li>
	<li>Elija las fracciones elutadas que muestran cantidades razonables de proteínas purificadas para su posterior análisis. Hacer pequeñas alícuotas de la preparación. Almacene las proteínas purificadas en -80oC. Por lo general, la concentración de proteínas oscilará entre 0,5 g y 2 g por l y las muestras se pueden almacenar en este estado.</li>
	<li>
OPCIONAL: Concentre la muestra o cambie el búfer con una unidad de filtro centrífugo de 10K</li>
</ol>2. Purificación del complejo BAP1/DEUBAD (ASXL2) Deubiquitinase
<ol><li>Utilice pET30a+-His-BAP138 y pDEST-MBP-DEUBAD (ASXL2)35 construcciones de expresión bacteriana para transformar las bacterias BL21 (DE3) RIL para la producción de His-BAP1 y MBP-DEUBAD respectivamente.</li>
	<li>Realizar dos cultivos de arranque nocturno separados mediante la incubación de His-BAP1 y MBP-DEUBAD (ASXL2) expresando bacterias en 20 ml de caldo LB de medio de ampicilina que contiene 50 g/ml de clorfenicol y el antibiótico correspondiente para cada plásmido, 100 g/ ml de kanamicina o 100 g/ml de ampicilina respectivamente. Colocar en la coctelera a 37oC.</li>
	<li>Realice los pasos 1.3–1.6.</li>
	<li>
Resuspender los pellets de bacterias en 25 ml de tampón de lisis helada B (50 mM Tris pH 7.3, 500 mM NaCl, 3 mM-Mercaptoetanol, 0.2% Triton X-100, 1 mM PMSF y 1/100 cóctel antiproteasa). Mezclar volúmenes iguales del His-BAP1 con los lysates MBP-DEUBAD e incubar en hielo durante 15 minutos.
	<ol>
<li>Durante la centrifugación, preparar cuentas de agarosa Ni-NTA empaquetadas de 500 l (50% de purines) lavándolas tres veces con tampón B sin PMSF y cóctel antiproteasa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de la centrifugación de lisado bacteriano, recoger el sobrenadante y transferirlo a un tubo cónico de 50 ml. Tome una alícuota de 100 l como un lisato total y agregue 100 l de 2 tampón de muestra de Laemmli para el análisis sDS-PAGE y azul de Coomassie.</li>
	<li>
Filtrar el lisado a través de un filtro de jeringa de poro de 0,45 m y mezclarlo con las perlas Ni-NTA. Incubar a 4oC con agitación durante 5 h. Gire las perlas a 2.500 x g durante 3 min, retire y guarde el sobrenadante a medida que el flujo a través.
	<ol>
<li>Lavar las perlas 6 veces (5 ml cada una) con tampón B que contiene 20 mM 1,3-Diaza-2,4-cicloopentano (Imidazol). NOTA: Haga una solución en stock de 2 M imidazol a pH 7.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después del último lavado, transfiera las perlas con 10 ml de tampón a una columna de cromatografía vacía, agregue 1 mL de tampón B que contenga 200 mM de Imidazol y recoja la elución por gravedad en microtubos de 1,5 ml que contengan 10 Ml de TDT (500 ml) y 2 EDTA (500 mM) , pH: 8). Repita el procedimiento de elución 4 veces. Tomar 10 l de cada fracción de elución y añadir 10 l de 2 búfer de muestra de Laemmli para el análisis SDS-PAGE y Coomassie blue. Agrupa las fracciones eluted deseadas. NOTA: Mantenga las perlas en el búfer a 4 oC para su reciclaje y uso futuro.</li>
	<li>
Diluir el complejo eludado 3 veces con tampón C (50 mM Tris pH 7.3, 300 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM DTT, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, y 1/100 cóctel inhibidor de proteasa) antes de la incubación con las perlas de amilosa de agarosa.
	<ol>
<li>Preparar cuentas de agarosa de amilosa (500 l embaladas) lavándolas 2 veces con el tampón C sin añadir PMSF y cóctel antiproteasa. Añadir las perlas a la elución diluida e incubar durante la noche a 4oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugar a 2.500 x g durante 3 min y mantener el flujo a través. Lavar las perlas de proteínas con 5 ml de tampón C (5-6x).</li>
	<li>Mantenga el complejo purificado His-BAP1/MBP-DEUBAD en las perlas de agarosa de amilosa en tampón D (50 mM HEPES pH 8.0, 50 mM NaCl, 10% glicerol y 1 mM de TDT) y guárdelo a -80 oC. Tomar 20 l de la fracción de perlas (solución de perlas del 50%) y añadir 20 l de búfer de muestra de 2x Laemmli para el análisis SDS-PAGE y Coomassie blue.</li>
</ol>3. Purificación de los nucleosomas de las células HEK293T
<ol><li>Células HEK293T de cultivo en el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con 5% de suero de ternero recién nacido (NBS), 2 mM de L-glutamina, y 1% penicilina/estreptomicina.</li>
	<li>Placa alrededor de 12 x 106 hek293T células en 20 mL de medios completos por plato de cultivo de 15 cm un día antes de la transfección (se utilizaron 10 platos). Antes de la fecundación, cambie el medio de la célula a 12 ml de medio libre de suero y transfecte las células con 21 g de pCDNA-Flag-H2A utilizando 63 l de polietilenimina (PEI) a 1 mg/ml36. Cambie a medio completo 12 h más tarde.</li>
	<li>Tres días después de la transfección, lavar las células con PBS helado de 15 ml (dos veces) y cosecharlas en 3 ml de PBS frío con hielo usando un rascador de células. Centrífuga a 2.100 x g durante 8 min a 4oC. Deseche el PBS y proceda a la etapa de lisis o congele el pellet celular a -80 oC.</li>
	<li>Resuspenda el pellet celular en aproximadamente 10 volúmenes de tampón E (50 mM Tris-HCl pH 7.3, 420 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM MgCl2, 1 mM PMSF, cóctel inhibidor de proteasa 1/100, y 20 mM de N-metilmaleimida (NEM)) e incubar en hielo durante 20 min. La N-metilmaleimida (NEM) es fundamental para inhibir los DDU que co-purifican con nucleosomas.</li>
	<li>
Después de la centrifugación a 3.000 x g durante 5 min, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de cromatina en 10 volúmenes de tampón E. Mezclar por inversión y centrífuga a 3.000 x g durante 5 min.
	<ol>
<li>Repita el paso de lavado en otro momento utilizando el buffer E y dos veces utilizando el buffer F "MNase Buffer" (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 0.3 M sacarosa, 0.1% NP-40, 1 mM PMSF, y 1/100 proteasa inhibitor inhibitor cóctel). ADVERTENCIA: El pellet flotará durante los lavados y la centrifugación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspenda la cromatina en un tampón F de 5 ml y trate el pellet con nucleasa microcócica (MNase) (3 U/ml durante 10 min a temperatura ambiente). NOTA: La reacción se puede ayudar mezclando usando un Homogeneizador Dounce.</li>
	<li>
Después de la incubación, tomar una alícuota de 40 l de la mezcla para el análisis de fragmentos de ADN nucleosomal. Mezcle esta alícuota con 40 l de fenol/cloroformo y 20 l de tampón de carga de ADN 6x, vórtice, gire a 18.000 x g durante 2 min, y cargue el ADN en un gel de agarosa del 2%.
	<ol>
<li>Cuando el ADN es predominantemente un fragmento de 147 bp correspondiente a mononucleosos, detenga la reacción añadiendo 5 mM EDTA a la concentración final.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de la centrifugación a 21.000 x g durante 20 min a 4oC, incubar la fracción de cromatina soluble con resina anti-bandera durante la noche a 4oC. Lavar las perlas con 6x Tampón G (50 mM Tris-HCl, pH 7.3, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 1/100 cóctel inhibidores de la proteasa).</li>
	<li>Transfiera las perlas con un búfer G de 5 ml en una columna de cromatografía vacía. Eluye los nucleosomas ligados a perlas con 200 g/ml de péptido de elución de bandera. Utilice un búfer de elución compuesto por tampón G que contenga 200 péptidos de elución de bandera de g/ml (ver Tabla de materiales)y 1/5 (vol:vol) 1 M Tris, pH 8.0. Elule los nucleosomas 3x con tampón de elución de bandera de 260 l (2 h cada elución).</li>
	<li>Pruebe las 3 eluciones tomando una alícuota para la extracción de fenol-cloroformo y cargue el ADN en un gel de agarosa del 2%. Tomar 10 l de cada fracción de elución y añadir 10 l de tampón de muestra de Laemmli 2x para el análisis SDS-PAGE y Coomassie azul y cargar cada elución para la detección de Western Blot de H2A ubiquitinado. Almacene la elución a -80 oC. En general, la purificación de las células humanas produce menos proteínas que la de las bacterias, con concentraciones que oscilan entre 0,1 y 0,5 g/L.</li>
</ol>4. Ensayo de ubiquitinación de nucleoso utilizando el complejo de la ligasa de ubiquitina BMI1/RING1B E3
<ol><li>Centrifugar los nucleosomas a través de filtros centrífugos de 0,5 ml de poro de 10K para cambiar el sustrato del tampón de elución al búfer de reacción H (25 mM Tris, pH 7,5; 10 mM MgCl2y 5 mM ATP). Alternativamente, los nucleosomas disponibles comercialmente se pueden utilizar para el ensayo. NOTA: El cambio de la solución de suspensión de sustrato al tampón de reacción garantiza la reproducibilidad y evita la posible inhibición de la ligasa E3 por compuestos presentes en la mezcla de elución flag.</li>
	<li>Incubar 1 g de los nucleosomas en un volumen total de tampón Hde 40 l. Añadir enzima activadora de ub (UBE1) (250 ng), enzimas ub (50 ng/L) y E2 de conjugación ubconjugada (672 ng), y 1 g de complejo de ligasa de ubiquitina BMI1/RING1B E3. Incubar la reacción durante 3 h a 37oC con agitación ocasional. NOTA: Se pueden realizar varios controles en paralelo, incluyendo la omisión, E1, E2, E3, ATP y ubiquitina. Esto garantiza la especificidad de la reacción de ubiquitinación.</li>
	<li>Detenga la reacción añadiendo 40 l de búfer de muestra de 2x Laemmli y analice la ubiquitinación histona H2A K119 por SDS-PAGE y la hincha occidental, de acuerdo con los procedimientos estándar. Utilizar anticuerpos anti-H2A o anti-H2A K119ub (ver Tabla de Materiales).</li>
</ol>5. Ensayo In Vitro Nucleosomal H2A DUB usando BAP1/DEUBAD
<ol><li>Utilice los nucleosomas purificados para el ensayo de desubiquitinación in vitro. Resuspenda 100–500 ng de nucleosomas en tampón I de 40 ml (50 mM Tris-HCl, pH 7,3, 1 mM MgCl2,50 mM de NaCl y 1 mM de TDT). Añadir 1 g de His-BAP1 y MBP-DEUBAD purificados por bacterias BAP1. Llevar a cabo la reacción de desubiquitinación durante 3 h a 37 oC con agitación ocasional.</li>
	<li>Detenga la reacción in vitro añadiendo 40 s de 2x tampón De Laemmli y analice mediante inmunoblotting.</li>
</ol>

<ol><li>Ye, Y., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+ubiquitin+chains%3A+E2+enzymes+at+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).</li>
<li>Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+chains%3A+structure+and+function+of+the+deubiquitinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 550-563 (2009).</li>
<li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unravelling+of+the+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The unravelling of the ubiquitin system.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 322-324 (2015).</li>
<li>Nakayama, K. I., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+ligases%3A+cell-cycle+control+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6, 369-381 (2006).</li>
<li>Senft, D., Qi, J., Ronai, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+ligases+in+oncogenic+transformation+and+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin ligases in oncogenic transformation and cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 69-88 (2018).</li>
<li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+Ligases%3A+Structure%2C+Function%2C+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li>
<li>Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+ubiquitin+chains.+NF-kappaB+signalling%2C+cell+death+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Linear ubiquitin chains. NF-kappaB signalling, cell death and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 503-508 (2014).</li>
<li>Kulathu, Y., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+ubiquitylation+-+the+unexplored+world+of+polyubiquitin+beyond+Lys48+and+Lys63+linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Atypical ubiquitylation - the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 508-523 (2012).</li>
<li>Yau, R., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increasing+complexity+of+the+ubiquitin+code%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The increasing complexity of the ubiquitin code.</a> Nature Cell Biology. 18, 579-586 (2016).</li>
<li>Mevissen, T. E. T., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Deubiquitinase+Specificity+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 159-192 (2017).</li>
<li>Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-like+protein+conjugation+and+the+ubiquitin-proteasome+system+as+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).</li>
<li>Minton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammasomes%3A+Ubiquitin+lines+up+for+inflammasome+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammasomes: Ubiquitin lines up for inflammasome activity.</a> Nature Reviews Immunology. 14, 580-581 (2014).</li>
<li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20, 1242-1253 (2014).</li>
<li>Upadhyay, A., Amanullah, A., Chhangani, D., Mishra, R., Mishra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+multifaceted+E3+ubiquitin+ligases+barricade+extreme+defense%3A+Potential+therapeutic+targets+for+neurodegeneration+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Selective multifaceted E3 ubiquitin ligases barricade extreme defense: Potential therapeutic targets for neurodegeneration and ageing.</a> Ageing Research Reviews. 24, 138-159 (2015).</li>
<li>Hammond-Martel, I., Yu, H., Affar el, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+ubiquitin+signaling+in+transcription+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">Roles of ubiquitin signaling in transcription regulation.</a> Cellular Signalling. 24, 410-421 (2012).</li>
<li>Schwertman, P., Bekker-Jensen, S., Mailand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+DNA+double-strand+break+repair+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+modifiers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of DNA double-strand break repair by ubiquitin and ubiquitin-like modifiers.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 379-394 (2016).</li>
<li>Uckelmann, M., Sixma, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+ubiquitination+in+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Histone ubiquitination in the DNA damage response.</a> DNA Repair. 56, 92-101 (2017).</li>
<li>Robzyk, K., Recht, J., Osley, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad6-dependent+ubiquitination+of+histone+H2B+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast.</a> Science. 287, 501-504 (2000).</li>
<li>Hwang, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+RING+finger+protein+required+for+histone+H2B+monoubiquitination+and+cell+size+control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A conserved RING finger protein required for histone H2B monoubiquitination and cell size control.</a> Molecular Cell. 11, 261-266 (2003).</li>
<li>Kim, J., Hake, S. B., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+homolog+of+yeast+BRE1+functions+as+a+transcriptional+coactivator+through+direct+activator+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions.</a> Molecular Cell. 20, 759-770 (2005).</li>
<li>Wood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((an+E3+ubiquitin+ligase+required+for+recruitment+and+substrate+selection+of+Rad6+at+a+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter.</a> Molecular Cell. 11, 267-274 (2003).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+histone+H2A+ubiquitination+in+Polycomb+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing.</a> Nature. 431, 873-878 (2004).</li>
<li>Buchwald, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+E3-ligase+activity+of+the+Ring-Ring+complex+of+polycomb+proteins+Bmi1+and+Ring1B%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1B.</a> The EMBO Journal. 25, 2465-2474 (2006).</li>
<li>Scheuermann, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H2A+deubiquitinase+activity+of+the+Polycomb+repressive+complex+PR-DUB%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB.</a> Nature. 465, 243-247 (2010).</li>
<li>Jensen, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAP1%3A+a+novel+ubiquitin+hydrolase+which+binds+to+the+BRCA1+RING+finger+and+enhances+BRCA1-mediated+cell+growth+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression.</a> Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).</li>
<li>Harbour, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+mutation+of+BAP1+in+metastasizing+uveal+melanomas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas.</a> Science. 330, 1410-1413 (2010).</li>
<li>Abdel-Rahman, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GermLine+BAP1+mutation+predisposes+to+uveal+melanoma%2C+lung+adenocarcinoma%2C+meningioma%2C+and+other+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">GermLine BAP1 mutation predisposes to uveal melanoma, lung adenocarcinoma, meningioma, and other cancers.</a> Journal of Medical Genetics. , (2011).</li>
<li>Bott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+deubiquitinase+BAP1+is+commonly+inactivated+by+somatic+mutations+and+3p21.1+losses+in+malignant+pleural+mesothelioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma.</a> Nature Genetics. 43, 668-672 (2011).</li>
<li>Goldstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GermLine+BAP1+mutations+and+tumor+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">GermLine BAP1 mutations and tumor susceptibility.</a> Nature Genetics. 43, 925-926 (2011).</li>
<li>Testa, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GermLine+BAP1+mutations+predispose+to+malignant+mesothelioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">GermLine BAP1 mutations predispose to malignant mesothelioma.</a> Nature Genetics. 43, 1022-1025 (2011).</li>
<li>Wiesner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GermLine+mutations+in+BAP1+predispose+to+melanocytic+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">GermLine mutations in BAP1 predispose to melanocytic tumors.</a> Nature Genetics. 43, 1018-1021 (2011).</li>
<li>Dey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+tumor+suppressor+BAP1+causes+myeloid+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation.</a> Science. 337, 1541-1546 (2012).</li>
<li>Pena-Llopis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAP1+loss+defines+a+new+class+of+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma.</a> Nature Genetics. 44, 751-759 (2012).</li>
<li>Bononi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAP1+regulates+IP3R3-mediated+Ca2%2B+flux+to+mitochondria+suppressing+cell+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BAP1 regulates IP3R3-mediated Ca2+ flux to mitochondria suppressing cell transformation.</a> Nature. 546, 549-553 (2017).</li>
<li>Daou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoubiquitination+of+ASXLs+controls+the+deubiquitinase+activity+of+the+tumor+suppressor+BAP1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1.</a> Nature Communications. 9, 4385(2018).</li>
<li>Daou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BAP1%2FASXL2+Histone+H2A+Deubiquitinase+Complex+Regulates+Cell+Proliferation+and+Is+Disrupted+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).</li>
<li>Mashtalir, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autodeubiquitination+protects+the+tumor+suppressor+BAP1+from+cytoplasmic+sequestration+mediated+by+the+atypical+ubiquitin+ligase+UBE2O%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O.</a> Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+carboxyl+hydrolase+BAP1+forms+a+ternary+complex+with+YY1+and+HCF-1+and+is+a+critical+regulator+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression.</a> Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+and+deubiquitinase+BAP1+promotes+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).</li>
<li>Dai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAP1+inhibits+the+ER+stress+gene+regulatory+network+and+modulates+metabolic+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAP1+links+metabolic+regulation+of+ferroptosis+to+tumour+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression.</a> Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).</li>
<li>Kolluri, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+functional+BAP1+augments+sensitivity+to+TRAIL+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+deubiquitinating+enzyme+BAP1+regulates+cell+growth+via+interaction+with+HCF-1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2009).</li>
<li>Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAP1%2FASXL1+recruitment+and+activation+for+H2A+deubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination.</a> Nature Communications. 7, 10292(2016).</li>
</ol>

Los autores no declaran intereses financieros en competencia.

Hay varias ventajas de establecer ensayos robustos de ubiquitinación in vitro y desubiquitinación para proteínas de interés. Estos ensayos se pueden utilizar para: (i) establecer condiciones óptimas y definir requisitos mínimos para estas reacciones, (ii) determinar constantes cinéticas y bioquímicas enzimáticas, (iii) definir las funciones de los cofactores o inhibidores que pueden afectar a estas reacciones, (iv) identificar interfaces de interacción, (v) probar el impacto de mutaciones artificiales o asociadas a la en...

La ubiquitinación es una de las modificaciones post-traduccionales más conservadas y es crítica para una amplia variedad de organismos, incluyendo levaduras, plantas y vertebrados. La ubiquitinación consiste en la unión covalente de ubiquitina, un polipéptido de 76 aminoácidos altamente conservado, a proteínas diana y se produce en tres pasos secuenciales que implican tres enzimas, es decir, E1-activación, E2-conjugating y E3 ligeas1, 2,3. Esta modificación post-traduccional desempeña un papel central en un amplio espectro de procesos biológicos. De hecho, las ligasas E3, que proporcionan la especificidad de la reacción, constituyen una gran superfamilia de enzimas y son las enzimas más abundantes del sistema de ubiquitina4,5,6. Los efectos aguas abajo de la ubiquitinación de proteínas dependen de la naturaleza de la modificación: monoubiquitinación, multimonoterminización, y poliubiquitinación lineal o ramificada. La monoubiquitinación rara vez se asocia con la degradación proteasomal, pero en su lugar esta modificación está implicada en la mediación de varios eventos de señalización. La poliubiquitinación implica el N-terminal o los residuos de lisina en la propia molécula de ubiquitina, y el destino de una proteína poliubiquitinizada depende de qué residuo está involucrado en la extensión de la cadena de ubiquitina. Durante mucho tiempo se ha sabido que la poliubiquitinación mediada por la lisina 48 de ubiquitina induce degradación proteasomal. Por el contrario, poliubiquitinación a través de lisina 63 de ubiquitina se asocia a menudo con la activación de proteínas7,8,9. Al igual que otras modificaciones importantes post-traduccionales, la ubiquitinación es reversible y la eliminación de ubiquitina de proteínas está garantizada por proteasas específicas las que se denominan deubiquitinasas (DUB), que han surgido como reguladores importantes de los procesos celulares 2 , 10. Es importante destacar que muchos DUB son altamente especializados, y regulan, a través de la desubiquitinación, sustratos específicos, lo que indica que un equilibrio fino entre ubiquitinación y desubiquitinación es crítico para la función proteica. Los E3 y los DUB, junto con la maquinaria de degradación del proteosoma y los factores accesorios, forman el Sistema de Proteasoma de Ubiquitina (UPS, con >1200 genes) que regula las principales vías de señalización, varias de las cuales están asociadas con el crecimiento y la proliferación celular, determinación del destino celular, diferenciación, migración celular y muerte celular. Es importante destacar que la desregulación de varias cascadas de señalización que implican ubiquitinación promueve enfermedades de tumorigénesis y neurodegeneración5,11,12,13, 14.
La ubiquitinación desempeña un papel generalizado en la biología de la cromatina y en los procesos dependientes del ADN15,16,17. Por ejemplo, la monoubiquitinación de histona H2A en lisina 119 (en adelante H2A K119ub) es una modificación crítica post-traduccional implicada en la represión transcripcional y la reparación del ADN18,19,20, 21,22. H2A K119ub es catalizado por el Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), que desempeña un papel clave en el mantenimiento de la información epigenética y está altamente conservado de Drosophila a humano. La PRC1 canónica está constituida en particular por el RING1B y el BMI1, que son el complejo de ligasa de ubiquitina E3 responsable del evento de ubiquitinación22,23. En Drosophila, la monoubiquitinación H2A (H2A K118ub que corresponde a H2A K119ub en mamíferos) es revertida por el DUB Calypso, que interactúa con el Peine Sexual Adicional (ASX) formando el complejo DE Podo-REpressivo DUB (PR-DUB)24. El ortología de mamíferos de calipso, BAP1,es un supresor tumoral suprimido o inactivado en diversas neoplasias malignas humanas25,26,27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. BAP1 regula los procesos dependientes del ADN en el núcleo y la apoptosis mediada por la señalización de calcio en el retículo endoplasmático33,34,35,36, 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. BAP1 ensambla complejos proteicos multisubunidadques reguladores de transcripción, en particular ASXL1, ASXL2 y ASXL3 (ASXL), tres ortologos de ASX38,43. Los ASXL utilizan el dominio DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD), también llamado dominio ASXM, para estimular la actividad BAP1 DUB35,36,44. Por lo tanto, los ASXL desempeñan un papel importante en la coordinación de la actividad DE BAP1 DUB en la cromatina y, más ampliamente, en su función supresora de tumores.
Existen varios métodos para estudiar los procesos de ubiquitinación y desubiquitinación. En particular, los ensayos bioquímicos que utilizan proteínas purificadas a partir de bacterias siguen siendo muy potentes para demostrar la ubiquitinación directa de sustratos específicos o la eliminación de ubiquitina de ellos. Estos experimentos se pueden llevar a cabo para investigar una serie de parámetros tales como determinar el requisito de complejos mínimos, determinar la cinética de reacciones, definir relaciones estructura/función y comprender el impacto de la patológica mutaciones genéticas. Aquí, proporcionamos protocolos para llevar a cabo reacciones de ubiquitinación y desubiquitinación en sustratos de cromatina con componentes purificados. Como sistema modelo, se presenta la ubiquitinación in vitro y la desubiquitinación de la proteína nucleosomal H2A. Las proteínas purificadas por bacterias ensambladas en complejos mínimos de RING1B/BMI1 y BAP1/DEUBAD se utilizan para la ubiquitinación o desubiquitinación de H2A nucleosomal, respectivamente.

<table><tbody><tr><td>Perlas de amilosa</td> y <td>agarosa New England Biolabs</td><td>#E8021</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0,5 mL filtros centrífugos 10K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>Anti-H2AK119ub (H2Aub)</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>#8240</td><td></td></tr><tr><td>Perlas anti-Flag-agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#A4596</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel antiproteasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>#P8340</tr><tr><td>BL21 (DE3) Bacterias CodonPlus-RIL</td><td>Agilent technologies</td><td>#230240</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Wisent</td><td>#319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Columna de cromatografía vacía</td><td>Biorad</td><td>#731-1550</td><td></td></tr><tr><td>Péptido bandera Sigma-Aldrich</td><td>#F3290</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>GSH-perlas de agarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#G4510</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td>ATCC</td><td>#CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#I5513</td><td></td></tr><tr><td>Nucleasa microcócica (MNasa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#N3755</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de agarosa Ni-NTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#88221</td><td></td></tr><tr><td>N-metilmaleimida (NEM)</td><td>Bioshop</td><td>#ETM222</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa de poro 0,45 &mu; m</td><td>Sarstedt</td><td>#83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimina (PEI)</td><td>Polysciences Inc</td><td>#23966-1</td><td></td></tr><tr><td>pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109)</td><td>Addgene</td><td>#63139</td><td></td></tr><tr><td>Ub Enzima activadora (UBE1)</td><td>Boston Biochem</td><td>#E-305</td><td></td></tr><tr><td>UBCH5C (UBE2D3)</td><td>Boston Biochem</td><td>#E2-627</td><td></td></tr></tbody></table>

ensayos in vitro ubiquitination y deubiquitination de histonas nucleosomales

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

La ubiquitinación es una modificación post-traduccional que desempeña un papel importante en varias vías de señalización y participa notablemente en la coordinación de la función de la cromatina y los procesos asociados al ADN. Esta modificación implica una acción secuencial de varias enzimas, incluyendo E1 ubiquitina activa, E2 ubiquitina-conjugating y E3 ubiquitina-ligasa y es revertida por deubiquitinasas (DUBs). La ubiquitinación induce la degradación de las proteínas o la alteración de la función proteica incluyendo la modulación de la actividad enzimática, la interacción proteína-proteína y la localización subcelular. Un paso crítico para demostrar la ubiquitinación o desubiquitinación de proteínas es realizar reacciones in vitro con componentes purificados. Las reacciones efectivas de ubiquitinación y desubiquitinación podrían verse muy afectadas por los diferentes componentes utilizados, los cofactores enzimáticos, las condiciones de amortiguación y la naturaleza del sustrato.  Aquí, proporcionamos protocolos paso a paso para llevar a cabo reacciones de ubiquitinación y desubiquitinación. Ilustramos estas reacciones utilizando componentes mínimos del ratón Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), BMI1 y RING1B, una ligasa de ubiquitina E3 que monoubiquitina histone H2A en lisina 119. La desubiquitinación de H2A nucleosomal se realiza utilizando un complejo mínimo de desubiquitinación represiva de policomb (PR-DUB) formado por la deubiquitinasa humana BAP1 y el dominio DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) de su cofactor ASXL2. Estos ensayos de ubiquitinación/desubiquitinación se pueden llevar a cabo en el contexto de nucleosomas recombinantes reconstituidos con proteínas purificadas por bacterias o nucleosomas nativos purificados a partir de células de mamíferos. Destacamos las complejidades que pueden tener un impacto significativo en estas reacciones y proponemos que los principios generales de estos protocolos puedan adaptarse rápidamente a otras ligasas y deubiquitinasas de la ubiquitina E3.

Las proteínas GST-BMI1 y RING1B están bien producidas en bacterias y se pueden extraer fácilmente en la fracción soluble. La Figura 1A muestra una tinción azul de Coomassie para una purificación típica del complejo GST-BMI1-RING1B. Las bandas GST-BMI1 y RING1B migran al peso molecular esperado, 45 kDa y 13 kDa respectivamente. En particular, el complejo de ligasa E3 es altamente homogéneo con niveles muy bajos de contaminantes de proteínas bacterianas y/o pro...

La ubiquitinación es una modificación post-traduccional que desempeña un papel importante en los procesos celulares y está estrechamente coordinada por la desubiquitinación. Los defectos en ambas reacciones subyacen a patologías humanas. Proporcionamos protocolos para la realización de la ubiquitinación y la reacción de desubiquitinación in vitro utilizando componentes purificados.

Ensayos in Vitro Ubiquitination y Deubiquitination de histonas nucleosomales

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Dada la complejidad de las reacciones de ubiquitinación y desubiquitinación dentro de las células, es importante establecer ensayos in vitro con componentes purificados definidos. Esto ayuda a entender los mecanismos de ubiquitinación y desubiquitinación y también a determinar cómo las mutaciones asociadas con los genes que codifican las enzimas responsables de esta reacción pueden causar enfermedad humana. Podemos identificar los dominios y motivos en estos componentes que impulsan estas reacciones.También podemos desarrollar ensayos de pantalla de alto rendimiento que se pueden utilizar para detectar inhibidores de moléculas pequeñas que se pueden desarrollar como terapias potenciales. Para comenzar la lelisis bacteriana, agregue el cóctel de PMSF y antiproteasa en el tampón de lelisis helada A.Add 25 millters del tampón de lelisis A en la botella que contiene bacterias pellet y resuspend el pellet. Transfiera el izado que contiene bacterias en un tubo para la sonicación.Utilice un sonicador de sonda para sonicar el izado a una amplitud de salida del 70% durante 30 segundos, de cuatro a cinco veces. Luego centrifugar a 21.000 veces g durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Después de incubar el licato de bacterias con cuentas GSH durante cinco horas según el manuscrito, transfiera las cuentas junto con 10 milivarios de tampón en una columna de cromatografía vacía.A continuación, agregue 1,5 milímetros de tampón A que contenga 25 glutationes mililares en la columna y recoja la elución por gravedad en microtubos de 1,5 mililitros. Repita el procedimiento de elución cuatro veces con tampón fresco A un tratamiento continua de las fracciones eluidas según el manuscrito. Para empezar, resuspender los gránulos de la bacteria His-BAP1 y MBP-DEUBAD en 25 milivarios de tólisis helada B.Mix 25 milltadores de cada relación e incubar en hielo durante 15 minutos.Sonicar y luego centrifugar el izado a 21.000 veces g durante 20 minutos. Después de la centrifugación de izado, filtre el analizado a través de un filtro de jeringa de poro de 0,45 micrómetros en un frasco y mezcle con las perlas de níquel NTA. Incubar a cuatro grados centígrados con temblor durante cinco horas.Después de eso, gira las cuentas a 25.000 veces g durante tres minutos. Utilice una pipeta para guardar el sobrenadante en un tubo de 50 mililitros a medida que el flujo a través. Lavar las cuentas con cinco milímetros de tampón B, que contienen 20 imidazol mililolar, seis veces con centrífuga de tres minutos.Después del último lavado, transfiera las perlas con 10 milímetros de tampón B a una columna de cromatografía vacía y agregue un mililitro de tampón B que contenga 200 imidazol mililolar. Recoger la elución por gravedad en microtubos de 1,5 mililitros que contienen TDT y EDTA. Repita el procedimiento de elución cuatro veces y aduponga las fracciones eluidas deseadas en un tubo de 15 mililitros.Agregue el búfer C para diluir el complejo eluido tres veces. Luego transfiera la elución diluida a las cuentas de amilosa preparadas en tubos e incubar durante la noche a cuatro grados centígrados con temblores. Por la mañana, centrifugar los tubos a 2.500 veces g durante tres minutos y mantener el sobrenadante en un tubo de 15 mililitros como flujo a través.Lave las cuentas unidas a proteínas con cinco milivarios de tampón C durante cinco a seis veces. A continuación, agregue 500 microlitros de tampón D al complejo su-BAP1/MBP-DEUBAD purificado en las perlas de agarosa de amilosa para hacer una solución de perlas del 50%. Transfiera 20 microlitros de la solución de 50% de perlas a un tubo de microcentrífuga y agregue 20 microlitros de dos veces lansilla de muestra de Laemmli para el análisis azul SDS-PAGE y Coomassie.Almacene la solución de perlas restante en menos 80 grados Celsius para uso futuro. Después de cultivar las células HEK293T, vajilla 12 millones de células en 20 milímetros de medios completos en un plato de cultivo de 15 centímetros, un día antes de la transfección. Después de un día, bajo la capucha de cultivo celular, aspirar medios y suministrar 12 milivales de medios libres de suero.Transfectar las células con 21 microgramos de pCDNA flat-H2A usando 63 microlitros de PEI a un miligramo por mililitro. Después de 12 horas, cambie a medio completo. Después de cosechar las células según el manuscrito, resuspendir el pellet celular en unos 10 volúmenes de tampón E que contiene NEM para inhibir las deubiquitinas e incubar en hielo durante 20 minutos.Después de la centrifugación a 3.000 g durante cinco minutos, deseche el sobrenadante. Lavar el pellet de cromatina dos veces con 10 volúmenes de tampón E primero y luego lavar dos veces con tampón F.Resuspend la cromatina en cinco milivarios de tampón F y tratar el pellet con nucleasa microcócica a la concentración de tres unidades por mililitro durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, transfiera una alícuota de 40 microlitros de la mezcla a un tubo de 1,5 mililitros para el análisis de fragmentos de ADN nucleosómico.Añadir 40 microlitros de fenol-cloroformo y 20 microlitros de seis veces tampón de carga de ADN. Vórtice y girar a 18.000 veces g durante dos minutos. A continuación, transfiera 15 microlitros de la fase acuosa en un gel de 2% de agarosa para cargar el ADN.Después de detener la reacción y la centrifugación según el manuscrito, incubar la fracción de cromatina soluble con cuentas de resina anti-bandera en un tubo de 15 mililitros durante la noche a cuatro grados centígrados con temblor. Lave las cuentas seis veces con el tampón G.Transfiera las perlas con cinco milivarios de tampón G en una columna de cromatografía vacía. Diluir los nucleosomas ligados del cordón con 260 microlitros de tampón G que contienen 200 microgramos por mililitro de péptido de elución de bandera y de uno a cinco Tris molares a pH ocho.Eluir los nucleosomas tres veces, una hora en la sala fría. Para realizar el ensayo de ubiquitinación, primero agregue un microgramo de los nucleosomas purificados en 40 microlitros de tampón H.Después de eso, agregue una mezcla de solución enzimática que contenga 250 nanogramos de UBE1, 672 nanogramos de enzimas conjugantes UB y E2 UB y un microgramo de complejo de BMI1-RING1B E3 ubiquizolasa en el tubo. Incubar la reacción durante tres horas a 37 grados centígrados con temblores ocasionales.Detenga la reacción añadiendo 40 microlitros de dos veces la tampón de muestra de Laemmli y analice la histona H2AK119 ubiquitinación por hinchazón occidental. Para realizar el ensayo de deubiquitinación in vitro resuspendir los nucleosomas purificados en 40 microlitros de tampón I y un microgramo de bacterias purificaron las cuentas His-BAP1/MBP-DEUBAD. Coloque el tubo en una incubadora a 37 grados centígrados durante tres horas para llevar a cabo la reacción de deubiquitinación con temblores ocasionales.A continuación, detenga la reacción añadiendo 40 microlitros de dos veces el tampón de Laemmli y analice por inmunoblotting. En este experimento, la tinción azul de Coomassie para una purificación típica del complejo GST-BM1-RING1B utilizando cuentas de afinidad GST, muestra que las bandas migran con un peso molar esperado alrededor de 45 kilodaltones y 13 kilodaltones respectivamente. Del mismo modo, la purificación del complejo His-BAP1 MBP-DEUBAD también dio lugar a preparaciones relativamente altas y homogéneas con bandas de alrededor de 90 kilodaltones y 55 kilodaltones respectivamente.Por otro lado, la fracción nucleosomal purificada está compuesta esencialmente por una banda de 147 pares base que indica la presencia de fracción mononucleosomal altamente enriquecida. La tinción azul coomassie de nucleosomas purificados muestra un patrón de banda típico de las cuatro subunidades histonas con cantidades estequiométricas. La ubiquitinación de la histona H2A con el complejo BMI1-RING1B muestra un aumento dependiente del tiempo de la forma ubiquitinada de la proteína, mientras que los niveles de la forma no modificada se reducen de forma concomitante.La reacción de ubiquitinación es total ya que prácticamente todas las proteínas H2A se transforman en H2A K119ub. Por otro lado, el ensayo de desubiquitinación se llevó a cabo nucleosomas nativos. Tras la incubación de estos nucleosomas con BAP1-DEUBAD se observó una reducción dependiente del tiempo de la señal H2A K119ub.El éxito de las reacciones de ubiquitinación y desubiquitinación depende de la forma en que se purifica la proteína. Necesitamos un buen rendimiento y el uso de tampones para la resuspensión proteica y la purificación debe ser compatible con reacciones bioquímicas. Cuando este ensayo de ubiquitinación y desubiquitinación está bien establecido podemos probar el efecto activadores e inhibidores, así como el impacto de las mutaciones genéticas asociadas a la enfermedad.Este método ha sido establecido por la contribución de varios laboratorios y son muy útiles para entender los mecanismos de ubiquitinación y desubiquitinación. Varios productos químicos son peligrosos y necesitan ser manipulados en el capó. Esto incluye fenol-cloroformo, ácidos, bases, y agentes reductores.

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Investigación

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Bioquímica

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