Método para obtener patrón de respiración en ratones senescentes a través de la pletimografía barométrica sin restricciones

Este protocolo se puede utilizar para medir patrones de respiración en ratones. Es importante destacar que puede minimizar el impacto de los comportamientos activos en cepas modificadas genéticamente que pueden confundir resultados. Las principales ventajas de esta técnica son que no es invasiva y que no requiere el uso de restricciones anestésicas o inductoras del estrés.

Comience por asegurarse de que todas las mangueras y tubos están conectados a la cámara de pletisógrafo barométrico y conectando un tubo de entrada de gas y un tubo de salida de vacío directamente a la cámara de pletimografía barométrica. Para calibrar el flujo bajo en la cámara, ajuste el flujo dentro y fuera de la cámara a cero y retire el tubo de flujo en la cámara. Apague el vacío e introduzca un cero en la celda de la unidad baja para registrar el flujo cero en la configuración del amplificador 7700 del software de pletiógrafo barométrico.

A continuación, vuelva a conectar el tubo de entrada y encienda el flujo de vacío para calibrar el flujo alto y permitir que el gas nitrógeno equilibrado con oxígeno del 20,93% fluya a través de la cámara de pletimografía barométrica desde el mezclador de gas. A continuación, convierta el valor de entrada medido desde el medidor de flujo de litros por minuto en mililitros por segundo y haga clic en la celda de unidad alta para introducir el valor en mililitros por segundo. Haga doble clic en cal alta, cambie el tiempo a tres segundos y haga clic en Medir.

A continuación, deje abierta la pestaña de configuración del amplificador 7700 para calibrar los analizadores metabólicos al software de pletimografía barométrica. Para calibrar el analizador metabólico, en el programa mezclador de gas, ajuste el mezclador de gas a 20,93% de oxígeno y 79,07% de nitrógeno. Y en el analizador metabólico, establezca el nivel de calibración de oxígeno en 20.93% y el dióxido de carbono en 0%Gire el dial de nuevo a la muestra una vez que se hayan introducido los valores apropiados en los analizadores de gas para establecer el alto porcentaje de oxígeno y bajo dióxido de carbono.

Haga clic en la pestaña ABCD 4 del software de pletimografía barométrica e introduzca 20,93 bajo la unidad alta de la línea C2 para obtener oxígeno. En cal alta, cambie el tiempo a tres segundos y haga clic en Medir. Introduzca cero bajo la cal baja de la línea C3 para dióxido de carbono.

A continuación, cambie el tiempo a tres segundos y haga clic en Medir bajo cal baja. En el programa mezclador de gas, cambie el valor de oxígeno a 10% y el valor de dióxido de carbono a 5% y espere varios minutos para que el flujo de gas se ajuste a estos valores. En los analizadores metabólicos, gire las perillas de ajuste para calibrar el dióxido de carbono al 5%teniendo cuidado de volver a la muestra del dial una vez que los valores hayan sido calibrados.

Después de comprobar que las lecturas del analizador son estables, haga clic en unidad alta debajo de C3 e introduzca cinco para el dióxido de carbono. A continuación, cambie cal alta a tres segundos y haga clic en Medir. Haga clic en unidad baja bajo la opción C2 e ingrese 10 para oxígeno y haga clic en cal baja, ingrese tres segundos y haga clic en Medir.

Cambie el mezclador de gas de nuevo a 20.93%oxígeno y 79.07%nitrógeno y espere varios minutos a que la cámara se ajuste a estos valores. Realice calibraciones adicionales de forma rutinaria con tanques de gas certificados para confirmar que el mezclador de flujo y los analizadores de dióxido de oxígeno-carbono funcionan correctamente. Cuando los analizadores metabólicos hayan sido calibrados, vuelva a comprobar los medidores de flujo conectados a la cámara del pleti resuelto barométrico y ajuste el flujo de aire dentro y fuera de la cámara a las velocidades adecuadas para el experimento.

Cuando todos los ajustes se hayan aplicado al software de pletimografía barométrica, haga clic en Cerrar en la pestaña Adquisición, pulse Iniciar adquisición, asigne un nombre al archivo y haga clic en Aceptar para comenzar a grabar. Para la pletimografía barométrica sin restricciones, registre el peso y la temperatura corporal inicial del ratón antes de devolver el ratón a su jaula de origen.

Espere 10 minutos para recoger los datos de oxígeno y dióxido de carbono de fondo de la cámara vacía antes de colocar el ratón en la cámara. Durante la primera hora, documentar el comportamiento del animal tomando notas detalladas que incluyen los valores específicos de la entrada y salida de la cámara. Al final de la habituación de la cámara, observe los segmentos de respiración silenciosa durante los próximos 60 minutos tomando mediciones de temperatura corporal cada 10 minutos cuando utilice un dispositivo implantable.

Tenga cuidado de familiarizarse con los comportamientos generales del ratón para que los casos de respiración tranquila sin olfateo, acicalamiento o exploración puedan ser identificados apropiadamente. Al final del experimento, devuelva el ratón a su jaula y limpie y limpie completamente el equipo. Para un análisis del metabolismo, abra el panel metabólico en el software y obtenga el promedio de los primeros 10 minutos de los niveles de oxígeno y dióxido de carbono desde cuando la cámara estaba vacía.

Vea el panel de flujo del software de pletimografía barométrica y haga clic con el botón derecho en Analizar atributo para establecer los parámetros adecuados. Para un patrón de análisis respiratorio, confirme los tiempos de los 15 segundos de respiración silenciosa utilizando notas sobre el comportamiento animal, así como el trazado del panel de flujo. A continuación, introduzca los tiempos en el diálogo de analizador abierto desde la pestaña del analizador de datos y haga clic en Modo de vista de analizador para mostrar solo los segmentos de interés específicos de 15 segundos.

Para analizar las apneas y la respiración aumentada, en el archivo de revisión abierto, salga del modo de vista del analizador y haga clic en Configurar configuración P3 y Configuración del gráfico para seleccionar Vista de página como tipo y cinco como número de paneles. Introduzca menos dos en la caja etiquetada como baja y dos en la caja etiquetada alto para las medidas de flujo en mililitros por segundo y aplique los cambios. A continuación, desplácese hasta la marca de 30 minutos en el panel de trazados de flujo y cuente manualmente las apneas y las respiraciones aumentadas durante el período de 30 a 60 minutos después de que el ratón se colocó en la cámara.

Para este análisis, los períodos de respiración suspendida que duran más de o igual a 0,5 segundos son indicativos de una apnea. Las respiraciones aumentadas se indican por un fuerte aumento en el rastro respiratorio por encima de 1,25 mililitros por segundo seguido de una fuerte disminución por debajo de menos 0,75 mililitros por segundo. Este trazado de flujo representativo de respiración silenciosa en un ratón de 22 meses de edad es típico de un patrón en el que la respiración es consistente sin comportamientos respiratorios activos.

Este patrón respiratorio proviene de un segmento más activo durante el cual los ratones estaban explorando el olfato de la cámara y/o el aseo y no es ideal para el tipo de colección de respiración utilizada para esta metodología. El parámetro seleccionado para la evaluación del posible patrón de diferencias respiratorias entre los dos puntos de tiempo fue la frecuencia respiratoria, el volumen de marea, la ventilación de minutos, la relación de tiempo inspiratorio del volumen de marea y la relación de dióxido de carbono expulsada por ventilación por minutos. Se realizaron análisis adicionales con cada uno de los cuatro segmentos de línea de base de 15 segundos para frecuencia, volumen de marea, ventilación de minutos, relación de tiempo inspiratorio de volumen de marea y relación de dióxido de carbono expulsada por ventilación por minutos.

No se encontraron diferencias significativas entre ninguno de los puntos de tiempo ni diferencias en la variabilidad entre ninguno de los cuatro segmentos de tiempo para cualquier patrón de medida respiratoria. La cuantificación del número de apneas y respiraciones aumentadas observadas para cada animal durante los minutos 30 a 60 del protocolo de pletimografía barométrica sin restricciones reveló que los animales envejecidos mostraban un alto número de apneas y la presencia de respiraciones aumentadas en un lapso de 30 minutos. Los investigadores también pueden emplear desafíos de gas como hipoxia o hipercapnia para documentar cualquier cambio en el patrón respiratorio resultante de una intervención o terapia.

Esta técnica proporciona un medio para caracterizar patrones de respiración en pequeños roedores y cepas animales modificadas genéticamente que pueden presentar diferencias de comportamiento distintas.