Interrogando a centros germinales autorreactivos individuales por fotoactivación en un modelo mixto de quimérico de la autoinmunidad

Este modelo quimérico fisiológicamente relevante de centros germinales autoreactivos espontáneos permite la vinculación de la localización celular in vivo con análisis moleculares posteriores. La principal ventaja del modelo quimérico mixto de centros germinales autoreactivos es su naturaleza versátil y marginal, permitiendo el interrogatorio de prácticamente cualquier subconjunto celular deseado o vía molecular. La relevancia fisiológica de este modelo de desarrollo de enfermedades autoinmunes permite nuevos conocimientos que pueden ayudar al avance de nuevas terapias.

Este modelo de quimera de médula ósea se puede utilizar en inmunología, inmunooncología e investigación con células madre. El componente de fotoactivación tiene un uso amplio, ya que vincula la localización de tejido con el análisis de células aguas abajo. La preparación y reconstitución de la médula ósea y las medidas de etiquetado in vivo y explantación de tejidos son procedimientos técnicamente complejos que se prestan bien a demostraciones visuales.

Para extraer el fémur y la tibia del ratón 564Igi del donante, retire la piel de una extremidad posterior, y salga de las articulaciones de la rodilla y el tobillo tirando del pie con fuerza. Proceda a romper la articulación del tobillo. Luego, tire del pie hacia el cuerpo mientras se aferra a la tibia, despojando así los tendones y los músculos de la tibia.

Rompe la articulación de la rodilla para liberar la tibia, y tira del hueso hacia el cuerpo mientras te aferras al fémur para despojar los tendones y los músculos del fémur. Luego, haz una incisión en la articulación de la cadera, y corta los tendones antes de sacar el fémur de la cavidad de la cadera. Después de retirar los huesos contralaterales de las extremidades traseras de una manera similar, frote cuidadosamente los huesos con una toalla de papel gruesa para eliminar cualquier músculo restante y tejido conectivo, y enjuague los huesos despojados en el tampón de médula ósea helada.

Luego, usa el número siete de fórceps de Dumont para transferir los huesos a un recipiente de tampón de médula ósea fresca sobre hielo. Para extraer las células de la médula ósea, enjuague un mortero en un tampón de médula ósea helada y utilice una pipeta serológica de 10 mililitros para reemplazar el tampón de lavado por 10 mililitros de tampón de médula ósea fresco y frío. Usa los fórceps para transferir los huesos al mortero, y usa un pestillo para aplastar y moler los huesos para liberar la médula ósea.

Utilice la pipeta de 10 mililitros para recoger el extracto de médula ósea antes de pasar la solución de médula ósea a través de un colador celular de 70 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros sobre hielo. Luego, enjuague el mortero con 10 mililitros adicionales de tampón fresco y frío de la médula ósea para asegurar una recuperación completa de las células. Para preparar las suspensiones del donante, mezcle los volúmenes apropiados de GFP fotoactivables y médula de donante 564Igi en un tubo cónico de 50 mililitros, y pelete las células por centrifugación.

Resuspender el gránulo de células mixtas a una concentración de uno por 10 a las ocho células por mililitro de tampón de médula ósea helada, y transferir las células a un tubo de microcentrífuga preenfriado de 1,5 mililitros en hielo. A continuación, confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie en el ratón receptor CD45.1 anestesiado, y deslice el tubo de las células de la médula ósea del donante para asegurar una resuspensión adecuada. Cargue 200 microlitros de mezcla de médula ósea en una jeringa de insulina de 0,3 mililitros y, con el receptor de lado, estire suavemente la piel por encima y por debajo del ojo para sacar ligeramente el ojo.

Inserte cuidadosamente la punta de la jeringa en un ángulo aproximado de 30 grados en la parte frontal de la cavidad ocular, teniendo cuidado de evitar el ojo y el tejido circundante. Cuando la punta de la aguja toque el hueso debajo de la cavidad ocular, retraiga la aguja unos 0,5 milímetros antes de usar presión constante para inyectar lentamente la médula ósea del donante. Luego, devuelva el ratón a su jaula con agua antibiótica ad libitum, con monitoreo hasta la recuperación completa.

Para etiquetar el ganglio linfático popliteal, diluir dos microlitros de anticuerpos CD169 antiratón con etiqueta de fitoerytrina en 18 microlitros de PBS, y añadir dos gotas de 10 microlitros del anticuerpo en un pedazo de película de parafina de plástico. Cargue cada gota en una sola jeringa de insulina de 0,3 mililitros con una aguja de calibre 30 e inyecte 10 microlitros de anticuerpos en el reposapiés del animal receptor anestesiado. Antes de cosechar el ganglio linfático, coloque un cubreobjetos cuadrado en una superficie plana y utilice una jeringa de cinco mililitros cargada de grasa al vacío para trazar los bordes del cubreobjetos con grasa de aproximadamente uno a dos milímetros de cada borde.

Transfiera la cámara a una superficie fría y plana, y llene la cámara de grasa al vacío con tampón de médula ósea helada. Para acceder a los ganglios linfáticos popliteales, utilice tijeras rectas y finas para hacer una incisión en la piel justo debajo del foso de la rodilla del animal receptor eutanizado, y extienda el corte hacia arriba a lo largo de la línea de los isquiotibiales casi hasta la articulación de la cadera. Usando Dumont número cinco o el número siete fórceps, tire de cada uno de los colgajos expuestos de la piel hacia afuera para exponer el tejido en la fosa popliteal, y use los fórceps para ingresar cuidadosamente la fosa sólo medial a la vena popliteal.

Abra y cierre los fórceps a lo largo del eje de la pierna para exponer el ganglio linfático popliteal subyacente antes de usar el pulgar y el dedo índice para pellizcar el músculo del cuádriceps desde el lado frontal proximal hasta la rodilla, para sacar el ganglio linfático de la fosa. Deslice los fórceps debajo del ganglio linfático para liberar el nodo del tejido circundante y colóquelo en la cámara de grasa al vacío. Después de que se haya recogido el segundo ganglio linfático, coloque un segundo cubreobjetos en el borde de grasa al vacío, y presione suavemente hacia abajo para cerrar la cámara, teniendo cuidado de extruir todas las burbujas de aire.

Para identificar los centros germinales en muestras de tejido del bazo cosechado, coloque la cámara de imágenes en el escenario de un microscopio fluorescente de dos fotones y utilice una pipeta de transferencia de plástico de 3,5 mililitros para colocar una gota de agua destilada en la parte superior del cubreobjetos superior. Baje el objetivo hasta el punto de contacto y utilice la luz transmitida para enfocarse en la parte superior del tejido. Cambie al modo oscuro y a la excitación de dos fotones y ajuste el láser a 940 nanómetros.

Localice las áreas individuales de pulpa blanca bordeadas por la tinción CD169 cerca de la superficie del tejido, e identifique la vaina linfoides periarteriolar por la segunda generación armónica asociada con el arteriolo central. En la zona entre la vaina linfoides periarteriolar y la zona marginal, identificar la presencia de macrófagos altamente autofluorescentes, activados de cuerpos tediosos y, utilizando estos puntos de referencia, dibujar una región de interés alrededor de un único área central germinal. A continuación, configure una pila Z de alrededor de 100 a 150 micrómetros de profundidad, comenzando desde la superficie del tejido y utilizando un tamaño de paso de unos tres micrómetros antes de cambiar a una longitud de onda de excitación de 830 nanómetros.

Apague o atenúe todos los canales para evitar el fotodajo de los detectores e imagine la pila. A continuación, vuelva a la longitud de onda de excitación de 940 nanómetros y vuelva a abrir los canales, escaneando a través de la pila para confirmar una fotoactivación eficiente y una ausencia de fotodago en toda la pila de imágenes. El serotipado de las quimeras mixtas de médula ósea revela números de células B normalizados a las seis semanas después de la reconstitución, con una baja frecuencia de células B circulantes 9D11 positivas derivadas del compartimento 564Igi.

Dentro de la puerta de linfocitos total, había una baja frecuencia de células residuales derivadas de receptores, de las cuales alrededor del 6% son derivadas de CD45.1, lo que indica un grado general de quimerismo de alrededor del 94%Hubo un quimerismo prácticamente completo en el compartimiento de células B y un dominio de células B derivadas de médula ósea GFP fotoactivables, una consecuencia de la fuerte selección negativa de células B derivadas de 564.Igi. Como se ha observado, el etiquetado in vivo con CD169 facilita una visualización robusta de la zona marginal. La segunda señal armónica es evidente en los elementos estructurales que contienen colágeno y los vasos principales, incluyendo la arteria central de la vaina linfoide periarteriolar y los macrófagos altamente autofluorescentes de cuerpos telébles activados asociados con la actividad del centro germinal.

En conjunto, estos datos permiten la identificación de una región de interés que probablemente contiene un único centro germinal fotoactivable. La evaluación citométrica de flujo descendente confirma aún más la presencia de números de compartimentos celulares B normalizados, una población central germinal espontánea y un subconjunto de células B germinales fotoactivadas. Es importante restringir el tiempo de respuesta total de los pasos de explantado, fotoactivación y procesamiento de tejidos a cuatro a seis horas para garantizar una viabilidad celular suficiente.

Las células fotoactivadas pueden ser ordenadas por flujo y sometidas a secuenciación de una sola célula para, por ejemplo, caracterizar el repertorio del receptor de células B de un solo centro germinal. El modelo de quimera mixta ha permitido la exploración de la biología autoreactiva del centro germinal a una nueva profundidad, por ejemplo, proporcionando una visión de cómo se desarrolla el proceso de propagación del epítopo. Tenga en cuenta que la fuente de luz para la microscopía de dos fotones son láseres de clase 4 pulsados muy potentes que pueden dañar gravemente los ojos.