Name: Interrogando a centros germinales autorreactivos individuales por fotoactivación en un modelo mixto de quimérico de la autoinmunidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Aprende a generar quimeras de médula ósea murina con centros germinales autorreactivos espontáneos usando fotoactivación PA-GFP. Este modelo vincula la localización celular in vivo con análisis moleculares posteriores para estudiar autoinmunidad.

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SE Degn es un compañero de Lundbeckfonden y Carlsberg Foundation Distinguished Fellow. Este trabajo fue apoyado en parte además por una subvención de biomédica NNF (SE Degn).

<ol><li>Lerner, A., Jeremias, P., Matthias, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+World+Incidence+and+Prevalence+of+Autoimmune+Diseases+is+Increasing%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Celiac+Disease%22%5BJournal%5D)">The World Incidence and Prevalence of Autoimmune Diseases is Increasing.</a> International Journal of Celiac Disease. 3 (4), 151-155 (2015).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).</li>
<li>Mutoh, T., Miyata, T., Kashiwagi, S., Miyawaki, A., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+behavior+of+individual+cells+in+developing+organotypic+brain+slices+revealed+by+the+photoconvertable+protein+Kaede%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">Dynamic behavior of individual cells in developing organotypic brain slices revealed by the photoconvertable protein Kaede.</a> Experimental neurology. 200 (2), 430-437 (2006).</li>
<li>Tomura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cellular+movement+in+vivo+with+photoconvertible+fluorescence+protein+%E2%80%9CKaede%E2%80%9D+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein “Kaede” transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (31), 10871-10876 (2008).</li>
<li>Tomura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+and+quantification+of+dendritic+cell+migration+and+antigen+trafficking+between+the+skin+and+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Tracking and quantification of dendritic cell migration and antigen trafficking between the skin and lymph nodes.</a> Scientific Reports. 4, 6030(2014).</li>
<li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nature biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).</li>
<li>Pereira, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+metastases+can+invade+local+blood+vessels%2C+exit+the+node%2C+and+colonize+distant+organs+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+NY%29%22%5BJournal%5D)">Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice.</a> Science (New York, NY). 359 (6382), 1403-1407 (2018).</li>
<li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+NY%29%22%5BJournal%5D)">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science (New York, NY). 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li>
<li>Victora, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+center+dynamics+revealed+by+multiphoton+microscopy+with+a+photoactivatable+fluorescent+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter.</a> Cell. 143 (4), 592-605 (2010).</li>
<li>Habuchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+single-molecule+photoswitching+in+the+GFP-like+fluorescent+protein+Dronpa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reversible single-molecule photoswitching in the GFP-like fluorescent protein Dronpa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9511-9516 (2005).</li>
<li>Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+protein+activity+by+fluorescent+protein+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+NY%29%22%5BJournal%5D)">Optical control of protein activity by fluorescent protein domains.</a> Science (New York, NY). 338 (6108), 810-814 (2012).</li>
<li>Degn, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+Evolution+of+Autoreactive+Germinal+Centers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clonal Evolution of Autoreactive Germinal Centers.</a> Cell. 170 (5), 913-926 (2017).</li>
<li>Berland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+7-dependent+loss+of+B+cell+tolerance+in+pathogenic+autoantibody+knockin+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 7-dependent loss of B cell tolerance in pathogenic autoantibody knockin mice.</a> Immunity. 25 (3), 429-440 (2006).</li>
<li>Chatterjee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+C4+maintains+peripheral+B-cell+tolerance+in+a+myeloid+cell+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Complement C4 maintains peripheral B-cell tolerance in a myeloid cell dependent manner.</a> European journal of immunology. 43 (9), 2441-2450 (2013).</li>
<li>Toubai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+acute+GVHD+by+sex-mismatched+H-Y+antigens+in+the+absence+of+functional+radiosensitive+host+hematopoietic-derived+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Induction of acute GVHD by sex-mismatched H-Y antigens in the absence of functional radiosensitive host hematopoietic-derived antigen-presenting cells.</a> Blood. 119 (16), 3844-3853 (2012).</li>
<li>Luzina, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+formation+of+germinal+centers+in+autoimmune+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous formation of germinal centers in autoimmune mice.</a> Journal of leukocyte biology. 70 (4), 578-584 (2001).</li>
<li>Sachs, D. H., Kawai, T., Sykes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+tolerance+through+mixed+chimerism%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+perspectives+in+medicine%22%5BJournal%5D)">Induction of tolerance through mixed chimerism.</a> Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 4 (1), a015529(2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Un gran número de modelos murinos de autoinmunidad está disponible, muchos de los cuales presentan centros germinales espontánea16. Sin embargo, muchos de los modelos disponibles albergan complejos orígenes genéticos o mutaciones en los centro reguladores de proliferación de linfocitos o activación, hacerlas mal adaptado a entrecruzamiento con líneas de reportero y estudios del comportamiento normal del linfocito en autoinmunidad, respectivamente. El modelo actual, por el contrario, permite un enfoque de 'plug-and-play' al análisis profundo de las células de centro germinales derivados de tipo salvaje B autorreactivos utilizando cualquier combinación deseada de los transgenes, knock-outs y reporteros, en este caso representado por photoactivatable GFP. Usando estrategias de etiquetado en vivo, solo centros germinales pueden visualizarse en tejidos linfoides explantados y su fotoactivado de componentes celulares utilizando un microscopio de dos fotones. Los linfocitos fotoactivado de centros germinales solo pueden ser analizados u ordenado flujo cytometrically, como células individuales o a granel. Estas células pueden someterse posteriormente a análisis moleculares y funcionales adicionales aguas abajo para proporcionar nuevas perspectivas en el campo de la autoinmunidad.
Hay algunos pasos críticos para el desempeño exitoso de este procedimiento. Como lo demuestran los resultados representativos, la irradiación (1.100 Rad) y la reconstitución de la médula ósea de donante con éxito Coloque nuevamente el compartimiento de receptores de la médula que rinde casi completo quimerismo en el compartimiento de la célula de B. Esto es un punto importante, como las células B residuales derivados del destinatario haría un subconjunto de la población de centro germinal 'oscuro'. Independientemente de la fuente usada para la irradiación, el dosis/tiempo de irradiación debe ser optimizada para obtener efecto máximo myeloablative con daño tisular colateral mínimo a los animales. Para la reconstitución, el protocolo de hueso-crush y reconstitución con células del donante total 20 millones se ha encontrado para producir robusta grados altos de reconstitución. Trabajo estéril y frío de hielo para la extracción de médula ósea asegura alta viabilidad del donante de médula. Para llegar al donante deseado proporción de médula ósea, es fundamental tener gran cuidado cuando contando partes alícuotas de las células, tanto para el conteo en sí mismo y al sacar la submuestra de la médula ósea para contar. Mezcla y granulación Co los tuétanos de donantes, en lugar de centrifugar y resuspender por separado y luego mezclar, sirven para evitar cualquier sesgo en los coeficientes de donantes tras el recuento de células.
La generación de quimera mixta médula del Protocolo puede estar sola, y que permite generación de quimeras con centros germinales autorreactivas con reportero deseada, transgén o knock-out. Sin embargo, una limitación a esto es la necesidad de donantes histocompatibles. La cepa de 564Igi está en un fondo de congenic C57Bl/6J y como consecuencia, el otro donante o donantes y los receptores deben tener un fondo de congenic H-2b (o alternativamente, la cepa de 564Igi debe ser retrocruzas a la tensión deseada y el fenotipo autoinmune verificado en el fondo). El procedimiento de irradiación tiende a favorecer un ambiente de tolerogénicas17y desajustes en algunos antígenos menores de histocompatibilidad pueden ser tolerados. Sin embargo, este aspecto debe cuidadosamente considerar, particularmente si mezclar machos y hembras donantes o beneficiarios, debido al potencial de reactividad mujer con hombre restringido Y-antígenos.
Del mismo modo, el aspecto de fotoactivación del Protocolo puede estar solo y puede usarse en muchos contextos diferentes. Sin embargo, el reportero GFP PA actualmente sólo está disponible con el promotor de la UBC, que está activo en todas las células de estirpe hematopoyética, pero no en células stromal. Como se mencionó en la introducción, otros photoactivatable, fotoconmutables, cepas de reportero de photoconvertible están disponibles y se pueden sustituir por PA-GFP, con adecuado ajuste de las condiciones experimentales.
Es importante evitar la fotoactivación inadvertida de zonas indeseables, manteniendo el láser muy por encima de 900 nm cuando la proyección de imagen, como esta longitud de onda no Fotoactivar PA-GFP. Para la fotoactivación de sí mismo, ajustes específicos, tales como láser potencia y pixel tiempo de detención, dependerá de la profundidad en el tejido, el tejido específico utilizado y el sistema de proyección de imagen, y cada aplicación tiene que ser optimizado para el sistema específico de proyección de imagen utilizado. Debe tener cuidado no a fotoenvejecimiento las células, pero es al mismo tiempo esencial para fotoactivación eficiente a lo largo de la pila, con el fin de obtener una representación suficiente de las células activadas para análisis posteriores. Generalmente constituyen las células del centro germinal B en cualquier lugar de 0.5% ~ 2% de las células esplénicas o cutáneo ganglionar B y como puede verse en los resultados representativos (figura 5), pueden hacer las células del centro germinal única B fotoactivado la ~ 1% del total población presente en una porción de bazo único. Por lo tanto, acertado análisis o clasificación de un número significativo de células requiere procesar un gran número de eventos.

La incidencia de la enfermedad autoinmune ha aumentado rápidamente en las últimas décadas, particularmente en las sociedades occidentales. Hoy en día, enfermedad autoinmune alinea tercero en la lista de causas más frecuentes de morbilidad y mortalidad en el mundo occidental1. Siguen sin respuesta preguntas fundamentales sobre el desarrollo y progresión de la enfermedad autoinmune. Un requisito para los avances en nuestra comprensión de los mecanismos subyacentes de la enfermedad y la dinámica celular es el acoplamiento exacto de la localización microanatomical de subconjuntos de la célula con análisis moleculares o funcionales posteriores. En la última década, ha permitido el desarrollo de un número de fluoróforos biológica photoconvertible, photoactivatable o fotoconmutables estable y su integración en las cepas reportero preciso microanatomical etiquetado y rastreo de celulares subconjuntos en modelos murinos.
Kaede, una proteína fluorescente de photoconvertible origina una corales pétreos, somete photoconversion irreversible de fluorescencia verde a fluorescencia roja a la exposición a la luz violeta o ULTRAVIOLETA2. Inicialmente empleado para seguir el comportamiento dinámico de las células individuales en el desarrollo de organotypic de rebanadas de cerebro3, generación de un ratón knock-in permite posteriormente monitoreo celular movimiento en vivo de Kaede y el sistema fue aplicado al análisis de migración de células inmunes a y de los ganglios linfáticos4. Este enfoque fue posteriormente refinado con un reportero de segunda generación5. Un reportero similar es Dendra6, que recientemente fue utilizado para rastrear las metástasis de nodo de linfa en vivo7.
La primera proteína de photoactivatable desarrollada era una proteína verde fluorescente (GFP) diseñada con una sola mutación del punto (T203H), conduce a una absorción muy baja en la región de longitud de onda de 450 a 550 nm8. Después de la fotoactivación por luz ultravioleta, esta proteína fluorescente verde photoactivatable (PA-GFP) cambia su máximo de absorción de ~ 400 a ~ 500 nm, dando una intensidad aproximada de la 100-fold aumenta cuando excitó con una longitud de onda de 488 nm. La generación de ratones transgénicos en los que todas las células hematopoyéticas expresan PA-GFP permite, por primera vez, un análisis profundo de la selección de la célula de B en anatómicamente definidas zonas claras y oscuras del centro germinal9.
Considerando que la fotoactivación es una conversión irreversible de un estado no fluorescente a un estado fluorescente, y photoconversion es una transición unidireccional de una longitud de onda a otra, fotoconmutables proteínas son capaces de traslados entre ambas condiciones10 . Esta última capacidad recientemente fue aprovechada para ingeniero control óptico de proteína actividad11.
Utiliza el periodista PA-GFP, recientemente hemos caracterizado los repertorios de células B de centros germinales solo en un modelo novedoso de autoinmunidad como lupus espontáneo12. Este modelo se basa en quimeras mezclados con 1 parte de la médula que un autorreactivos de células B receptor knock-en con especificidad para los complejos de proteína ribonuclear (564Igi13,14) combinado con 2 partes de la médula de cualquier deseada donante. En aproximadamente 6 semanas post reconstitución se consiguen condiciones homeostáticas en que autorreactivos espontáneos centros germinales están presentes en el bazo y los ganglios linfáticos cutáneos. En particular, el centro germinal células B población es casi exclusivamente (~ 95%) compuesto de células derivadas del compartimiento no 564Igi, y estas células B derivados de tipo salvaje son autorreactivos. Por lo tanto, el modelo permite un enfoque de 'plug-and-play' para análisis de células de B autoreactive centro germinal usando varios transgenes, knock-outs y reporteros. Aquí, describimos el procedimiento para generar quimeras mixtas con centros germinales autorreactivos espontánea poblados por linfocitos con el reportero PA-GFP. Usando estrategias de etiquetado en vivo, solo centros germinales pueden visualizarse en tejidos linfoides explantados y su fotoactivado de componentes celulares utilizando un microscopio de dos fotones. Linfocitos fotoactivado de centros germinales solo pueden posteriormente analizados por citometría de flujo o clasificados por celular activado por el fluorocromo clasificación (FACS) y sometidos a análisis moleculares y funcionales descendentes adicionales. La capacidad de analizar los linfocitos autorreactivos de centros germinales solo puede ser aplicada directamente para proporcionar nuevas perspectivas en el campo de la autoinmunidad, pero las técnicas y enfoques descritos pueden además encontrar las aplicaciones relevantes en estudios de enfermedades infecciosas y las metástasis del tumor.

<table><tbody><tr><td>Anticuerpo, 9D11-A568</td><td>Hibridoma 9D11 generado internamente, amablemente proporcionado por MC Carroll, etiquetado con el kit: Biotium 92255</td><td></td> Anticuerpo, 9D11-A647 Hibridoma 9D11 generado internamente, amablemente proporcionado por MC Carroll, marcado con el kit: Nordic Biosite ABD-1031 Anticuerpo, FITC anti-ratón CD45.1 Biolegend 110705 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo, Azul Pacífico anti-ratón/antígeno GL7 humano (marcador de activación de células T y B)</td><td>Biolegend</td><td>144613</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo, PE anti-ratón CD169 (Siglec-1)</td><td>Biolegend</td><td>142403</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo, PE/Cy7 anti-ratón CD38 Biolegend</td><td></td><td>102717</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo, PerCP/Cy5.5 anti-ratón/humano CD45R/B220</td><td>Biolegend</td><td>103235</td><td></td></tr><tr><td>Tubo capilar, Filtro de</td> células <td>Fisher Scientific</td><td>211766</td><td></td>heparinizado envuelto en Mylar</tr><tr><td>, 70 y micro; m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos, 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos, cuadrado, 22x22 mm, 0,13-0,17 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22X22-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>1.084.180.250</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 70%</td><td>VWR</td><td>8301.360</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Life Technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Citómetro de flujo, FACS Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td>338962</td><td></td></tr><tr><td>Citómetro de flujo, LSRFortessa SORP</td><td>BD Biosciences-Producto</td><td></td> de <td>pedido especial con 4 láseres (405 nm, 488 nm, 561 nm y 640 nm)</td></tr><tr><td>Grasa, alto vacío, Dow Corning</td><td>VWR</td><td></td> DOWC1597418 <td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro, Burker-T&uuml; rk</td><td>VWR</td><td>630-1544</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano, IsoFlo vet.</td><td>Orion Pharma</td><td>9658</td><td></td></tr><tr><td>Medio de separación de linfocitos (Lympholyte-M Cell Separation Media)</td><td>Cedarlane</td><td>CL5035</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga, 1,5 mL (Eppendorf)</td><td>Microscopio Sarstedt</td><td>72.690.550</td><td></td></tr>, <tr><td>dos fotones</td><td>Prairie Technologies (ahora Bruker)</td><td>-</td><td>Pedido especial Mortero de microscopio de dos fotones Ultima In Vivo</td></tr><tr><td>con labio, sin esmaltar, 75 ml</td><td>VWR</td><td>410-0110</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>1063290500</td><td></td></tr><tr><td>Aguja, calibre 18</td><td>BD Medical</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>VWR</td><td>87.769.290</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>d8537</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de mortero</td><td>VWR</td><td>47747-358</td><td></td></tr><tr><td>Maja, sin esmaltar, 175 mm</td><td>VWR</td><td>410-0122</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta, serológica, 10 ml</td><td>VWR</td><td>612-3700</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta, de transferencia, de plástico</td><td>Sarstedt</td><td>861.172.001</td><td></td></tr><tr><td>Película de parafina de plástico (Parafilm M)</td><td>Placa Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>, 96 pocillos</td><td>Falcon</td><td>353910</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas quirúrgicas, Student Dumont #5 Pinzas</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas quirúrgicas, Student Dumont #7 Pinzas</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas, Student Tijeras finas, rectas</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa, 10 mL</td><td>Terumo</td><td>SS-10ES1</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa, 20 mL</td><td>Terumo</td><td>SS-20ES1</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa, 5 mL</td><td>Terumo</td><td>SS-05S1</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa, Insulina, 0,3 cc</td><td>BD Medical</td><td>324827</td><td></td></tr><tr><td>Tribrissen vet. 24% inj., que contiene 200 mg de sulfadiazina y 40 mg de trimetoprim/ml</td> MSD Solución de azul de tripano <td>431577</td><td></td><td>para la salud animal</td></tr><tr><td>, 0,4 %</td><td>VWR</td><td>K940-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tinte de viabilidad, eBioscience Tinte de viabilidad fijable eFluor 780</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65-0865-14</td><td></td></tr></tbody></table>

interrogando a centros germinales autorreactivos individuales por fotoactivación en un modelo mixto de quimérico de la autoinmunidad

Interrogating Individual Autoreactive Germinal Centers by Photoactivation in a Mixed Chimeric Model of Autoimmunity

Enfermedades autoinmunes presentan una carga significativa para la salud. Siguen sin respuesta preguntas fundamentales sobre el desarrollo y progresión de la enfermedad autoinmune. Un requisito para los avances en nuestra comprensión de los mecanismos subyacentes de la enfermedad y la dinámica celular es el acoplamiento exacto de la localización microanatomical de subconjuntos de la célula con posteriores análisis moleculares o funcionales; un objetivo que ha sido tradicionalmente difícil de lograr. Recientemente ha permitido el desarrollo de fluoróforos biológica estable photoactivatable y su integración en las cepas de reportero precisa microanatomical etiquetado y rastreo de celulares subconjuntos en modelos murinos. Aquí, describimos cómo la capacidad de analizar los linfocitos autorreactivos de centros germinales solo puede ayudar a proporcionar nuevas penetraciones en autoinmunidad, utilizando la combinación de un novedoso modelo quimérico de autoinmunidad con un reportero de photoactivatable como ejemplo . Demostrar que un procedimiento para generar mezcla quimeras con espontánea autorreactivos centros germinales poblados por linfocitos con un reportero de la proteína fluorescente verde photoactivatable. Usando estrategias de etiquetado en vivo, solo centros germinales pueden visualizarse en tejidos linfoides explantados y su componentes celulares fotoactivado por microscopia de dos fotones. Linfocitos fotoactivado de centros germinales solo pueden analizarse entonces clasifican flujo cytometrically, como células individuales o a granel y podrán ser sometidos a análisis moleculares y funcionales descendentes adicionales. Este enfoque puede aplicarse directamente para proporcionar nuevas perspectivas en el campo de la autoinmunidad, pero el procedimiento para la generación de quimeras de la médula ósea y el procedimiento de fotoactivación además puede encontrar amplio uso en estudios de enfermedades infecciosas y metástasis del tumor.

Generación de quimeras de mixtos de la médula
El presente Protocolo robusta alcanza quimeras de médula ósea mezclada con un chimerism casi total en el compartimiento de la célula de B como se muestra en el resultado representativo en la figura 1 (para significación estadística consulte por favor a 12). Los números de células B normalizado revela serotipificación en 6 semanas post reconstitución (figura 1A), con una baja frecuencia de 9 11 (idiotipo) positivo células B circulantes derivan del compartimiento 564Igi (figura 1B). Dentro de la puerta de linfocitos totales, hay una baja frecuencia de células residuales derivados del destinatario, ~ 6% CD45.1 (Q1), que indican un total grado de quimerismo de ~ 94% (figura 1). En el donante del compartimento (CD45.1-, Q3 + Q4) el cociente de 564Igi (Q4) a PA-GFP (Q3) está alrededor de 23% a 77%. Esta ligeramente inferior de entrada de 33% a 66% de proporción se explica por la fuerte selección negativa de células B derivados del compartimiento de 564Igi 12. Como se ve en la figura 1, existe quimerismo virtualmente completa en el compartimiento de la célula de B (99.9% CD45.1-) y el dominio de PA-GFP médula ósea las células de B (Q3), que es una consecuencia de la pesada selección negativa de células B derivados de 564Igi.
Cosecha de tejidos, transformación y evaluación de citometría de flujo
Figura 2 y figura 3 demuestran procedimientos y resultados de explantar recién aislaron de los ganglios linfáticos y bazo rebanadas. Figura 4 se presenta un resultado representativo para el etiquetado en vivo y la fotoactivación de un área de solo centro germinal en la rebanada de un bazo explanted. Como puede verse (Figura 4A), el etiquetado en vivo con CD169-PE ha etiquetado enérgicamente la zona marginal (rojo, indicado por "MZ"). La segunda señal de armónicos es evidente en los elementos estructurales que contengan colágeno y vasos principales (azules), incluyendo la arteriola central de la vaina linfoide periarteriolar (PALS). Muy autofluorescent, macrófagos de cuerpos tingibles activados se asocian a actividad de centro germinal (flecha). Tomados en conjunto, la identificación de la zona marginal, PALS y macrófagos de cuerpos tingibles, permite la identificación de una región de interés que probablemente contiene un único centro germinal. La región de interés es Fotoactivado, tal como se ilustra en la Figura 4B. Como lo demuestra, fotoactivación es microanatomically precisa9, produciendo un área definida de la activación. Los resultados presentados además servir como confirmación de una densidad alta de PA-GFP + linfocitos en el reconstituido quimeras y la presencia de centros germinales espontáneos. Evaluación de citometría de flujo aguas abajo más confirma número de compartimiento de normalizada la célula de B (figura 5), una población espontánea centro germinal (figura 5E) y la presencia de un subconjunto de las células del centro germinal B que han sido fotoactivado (figura 5F).
Así, el presente Protocolo presenta un método robusto para generación de quimeras mixta médula ósea espontánea autorreactivos centros germinales, que se componen predominante tipo derivadas de células de B con un reportero de photoactivatable. A su vez esto permite análisis aguas abajo de los centros germinales (descripción gráfica en la figura 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59397/59397fig1.jpg"> Figura 1: Flow cytometric evaluación del grado de quimerismo en sangre de 564Igi (CD45.1-, PA - GFP-): PA-GFP (CD45.1, PA-GFP +) mezclado quimeras en los receptores de CD45.1 letalmente irradiados (CD45.1 +, PA - GFP-), 6 semanas post reconstitución. Parcela A) mostrando el control de las células B B220 +, previamente cerradas en los linfocitos de la camiseta. Subgate de parcela A, mostrando 9 11 + (idiotipo) frecuencia en la población de la célula de B en B). C) parcela de PA-GFP versus CD45.1, pre-gated en los linfocitos de la camiseta. D) parcela de PA-GFP versus CD45.1 en la subgate de la célula de B de parcela A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59397/59397fig1large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59397/59397fig2.jpg"> Figura 2: Procedimiento para la recolección y montaje poplíteo los nodos de linfa para la proyección de imagen y fotoactivación. A) una incisión se hace debajo de la rodilla y extender hasta la articulación de la cadera, y los bordes se repliegan hacia los lados, con el fin de exponer el hueco poplíteo (flecha). B) el supraclavicle que se abre y el ganglio linfático poplíteo es expuesta (flecha). C) ganglio linfático poplíteo es obtenido de la fosa. D) el procedimiento se repite para el lado contralateral y ambos nodos se montan en una cámara de vacío/cubreobjetos-grasa doble cara llenada con tampón de BM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59397/59397fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59397/59397fig3.jpg"> Figura 3: procedimiento para la cosecha y el bazo para la proyección de imagen y la fotoactivación de montaje. Un) una incisión se hace en la línea medial anterior justo debajo de la caja torácica y extendida alrededor del cuerpo a la línea axilar posterior y los bordes se repliegan para exponer la punta del bazo (flecha). B) del bazo es retraída y suprimida y cortar en rodajas finas (1-2 mm), que se montan en una cámara de vacío/cubreobjetos-grasa doble cara llenada con tampón de BM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59397/59397fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59397/59397fig4.jpg"> Figura 4: Fotoactivación. Dos fotones A) micrografía de un centro germinal en el bazo antes de fotoactivación. Etiquetado in vivo con anti-CD169-PE fue realizado antes de la cosecha del bazo para etiquetar la zona marginal (rojo, indicado por "MZ"). El segundo armónicos de la señal es evidente en estructuras que contengan colágeno asociadas al tegumento y vasos principales (azul). Puntas de flecha identifican altamente autofluorescent, macrófagos tingibles cuerpo activados asociados con la actividad del centro germinal. Se realizó la proyección de imagen 940 excitación nm. La barra de escala en la esquina superior izquierda indica 200 μm. B) en cuanto a, pero después de la fotoactivación a 830 nm. Fotoactivado células son ahora visible (verde) en una región definida de interés delimitada por la zona marginal y que abarca los macrófagos de cuerpos tingibles previamente identificados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59397/59397fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59397/59397fig5.jpg"> Figura 5: Flow cytometric análisis de las células del centro germinal B fotoactivado. A) parcela de avance versus dispersión y linfocitos la puerta del lado. Parcela B) área de dispersión hacia adelante en función de la altura de la dispersión hacia delante dentro de la puerta del linfocito y puerta de camiseta resultante. C) viabilidad del tinte parcela de exclusión dentro de la puerta de la camiseta y puerta de célula viva resultante. Gating D) de las células B B220 +. Gating E) de las células del centro germinal B, identificado como CD38lo GL7hi células dentro el B220 + puerta. F) Gating de fotoactivado células dentro de la población de células B GC, identificado como el subconjunto de las células que expresan Co desactivado y fotoactivado PA-GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59397/59397fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59397/59397fig6.jpg"> Figura 6: gráfica Resumen del Protocolo de. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59397/59397fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo describe la generación de quimeras mixta médula ósea murina con centros germinales autoinmunitarios espontáneos, en autorreactivos que linfocitos llevan un reportero de la proteína verde fluorescente (GFP-PA) de photoactivatable. Esto proporciona la capacidad para vincular la localización celular en posteriores análisis moleculares y funcionales de los tejidos.

Interrogando a centros germinales autorreactivos individuales por fotoactivación en un modelo mixto de quimérico de la autoinmunidad

Autoimmune diseases present a significant health burden. Fundamental questions regarding the development and progression of autoimmune disease remain ...

Este modelo quimérico fisiológicamente relevante de centros germinales autoreactivos espontáneos permite la vinculación de la localización celular in vivo con análisis moleculares posteriores. La principal ventaja del modelo quimérico mixto de centros germinales autoreactivos es su naturaleza versátil y marginal, permitiendo el interrogatorio de prácticamente cualquier subconjunto celular deseado o vía molecular. La relevancia fisiológica de este modelo de desarrollo de enfermedades autoinmunes permite nuevos conocimientos que pueden ayudar al avance de nuevas terapias.Este modelo de quimera de médula ósea se puede utilizar en inmunología, inmunooncología e investigación con células madre. El componente de fotoactivación tiene un uso amplio, ya que vincula la localización de tejido con el análisis de células aguas abajo. La preparación y reconstitución de la médula ósea y las medidas de etiquetado in vivo y explantación de tejidos son procedimientos técnicamente complejos que se prestan bien a demostraciones visuales.Para extraer el fémur y la tibia del ratón 564Igi del donante, retire la piel de una extremidad posterior, y salga de las articulaciones de la rodilla y el tobillo tirando del pie con fuerza. Proceda a romper la articulación del tobillo. Luego, tire del pie hacia el cuerpo mientras se aferra a la tibia, despojando así los tendones y los músculos de la tibia.Rompe la articulación de la rodilla para liberar la tibia, y tira del hueso hacia el cuerpo mientras te aferras al fémur para despojar los tendones y los músculos del fémur. Luego, haz una incisión en la articulación de la cadera, y corta los tendones antes de sacar el fémur de la cavidad de la cadera. Después de retirar los huesos contralaterales de las extremidades traseras de una manera similar, frote cuidadosamente los huesos con una toalla de papel gruesa para eliminar cualquier músculo restante y tejido conectivo, y enjuague los huesos despojados en el tampón de médula ósea helada.Luego, usa el número siete de fórceps de Dumont para transferir los huesos a un recipiente de tampón de médula ósea fresca sobre hielo. Para extraer las células de la médula ósea, enjuague un mortero en un tampón de médula ósea helada y utilice una pipeta serológica de 10 mililitros para reemplazar el tampón de lavado por 10 mililitros de tampón de médula ósea fresco y frío. Usa los fórceps para transferir los huesos al mortero, y usa un pestillo para aplastar y moler los huesos para liberar la médula ósea.Utilice la pipeta de 10 mililitros para recoger el extracto de médula ósea antes de pasar la solución de médula ósea a través de un colador celular de 70 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros sobre hielo. Luego, enjuague el mortero con 10 mililitros adicionales de tampón fresco y frío de la médula ósea para asegurar una recuperación completa de las células. Para preparar las suspensiones del donante, mezcle los volúmenes apropiados de GFP fotoactivables y médula de donante 564Igi en un tubo cónico de 50 mililitros, y pelete las células por centrifugación.Resuspender el gránulo de células mixtas a una concentración de uno por 10 a las ocho células por mililitro de tampón de médula ósea helada, y transferir las células a un tubo de microcentrífuga preenfriado de 1,5 mililitros en hielo. A continuación, confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie en el ratón receptor CD45.1 anestesiado, y deslice el tubo de las células de la médula ósea del donante para asegurar una resuspensión adecuada. Cargue 200 microlitros de mezcla de médula ósea en una jeringa de insulina de 0,3 mililitros y, con el receptor de lado, estire suavemente la piel por encima y por debajo del ojo para sacar ligeramente el ojo.Inserte cuidadosamente la punta de la jeringa en un ángulo aproximado de 30 grados en la parte frontal de la cavidad ocular, teniendo cuidado de evitar el ojo y el tejido circundante. Cuando la punta de la aguja toque el hueso debajo de la cavidad ocular, retraiga la aguja unos 0,5 milímetros antes de usar presión constante para inyectar lentamente la médula ósea del donante. Luego, devuelva el ratón a su jaula con agua antibiótica ad libitum, con monitoreo hasta la recuperación completa.Para etiquetar el ganglio linfático popliteal, diluir dos microlitros de anticuerpos CD169 antiratón con etiqueta de fitoerytrina en 18 microlitros de PBS, y añadir dos gotas de 10 microlitros del anticuerpo en un pedazo de película de parafina de plástico. Cargue cada gota en una sola jeringa de insulina de 0,3 mililitros con una aguja de calibre 30 e inyecte 10 microlitros de anticuerpos en el reposapiés del animal receptor anestesiado. Antes de cosechar el ganglio linfático, coloque un cubreobjetos cuadrado en una superficie plana y utilice una jeringa de cinco mililitros cargada de grasa al vacío para trazar los bordes del cubreobjetos con grasa de aproximadamente uno a dos milímetros de cada borde.Transfiera la cámara a una superficie fría y plana, y llene la cámara de grasa al vacío con tampón de médula ósea helada. Para acceder a los ganglios linfáticos popliteales, utilice tijeras rectas y finas para hacer una incisión en la piel justo debajo del foso de la rodilla del animal receptor eutanizado, y extienda el corte hacia arriba a lo largo de la línea de los isquiotibiales casi hasta la articulación de la cadera. Usando Dumont número cinco o el número siete fórceps, tire de cada uno de los colgajos expuestos de la piel hacia afuera para exponer el tejido en la fosa popliteal, y use los fórceps para ingresar cuidadosamente la fosa sólo medial a la vena popliteal.Abra y cierre los fórceps a lo largo del eje de la pierna para exponer el ganglio linfático popliteal subyacente antes de usar el pulgar y el dedo índice para pellizcar el músculo del cuádriceps desde el lado frontal proximal hasta la rodilla, para sacar el ganglio linfático de la fosa. Deslice los fórceps debajo del ganglio linfático para liberar el nodo del tejido circundante y colóquelo en la cámara de grasa al vacío. Después de que se haya recogido el segundo ganglio linfático, coloque un segundo cubreobjetos en el borde de grasa al vacío, y presione suavemente hacia abajo para cerrar la cámara, teniendo cuidado de extruir todas las burbujas de aire.Para identificar los centros germinales en muestras de tejido del bazo cosechado, coloque la cámara de imágenes en el escenario de un microscopio fluorescente de dos fotones y utilice una pipeta de transferencia de plástico de 3,5 mililitros para colocar una gota de agua destilada en la parte superior del cubreobjetos superior. Baje el objetivo hasta el punto de contacto y utilice la luz transmitida para enfocarse en la parte superior del tejido. Cambie al modo oscuro y a la excitación de dos fotones y ajuste el láser a 940 nanómetros.Localice las áreas individuales de pulpa blanca bordeadas por la tinción CD169 cerca de la superficie del tejido, e identifique la vaina linfoides periarteriolar por la segunda generación armónica asociada con el arteriolo central. En la zona entre la vaina linfoides periarteriolar y la zona marginal, identificar la presencia de macrófagos altamente autofluorescentes, activados de cuerpos tediosos y, utilizando estos puntos de referencia, dibujar una región de interés alrededor de un único área central germinal. A continuación, configure una pila Z de alrededor de 100 a 150 micrómetros de profundidad, comenzando desde la superficie del tejido y utilizando un tamaño de paso de unos tres micrómetros antes de cambiar a una longitud de onda de excitación de 830 nanómetros.Apague o atenúe todos los canales para evitar el fotodajo de los detectores e imagine la pila. A continuación, vuelva a la longitud de onda de excitación de 940 nanómetros y vuelva a abrir los canales, escaneando a través de la pila para confirmar una fotoactivación eficiente y una ausencia de fotodago en toda la pila de imágenes. El serotipado de las quimeras mixtas de médula ósea revela números de células B normalizados a las seis semanas después de la reconstitución, con una baja frecuencia de células B circulantes 9D11 positivas derivadas del compartimento 564Igi.Dentro de la puerta de linfocitos total, había una baja frecuencia de células residuales derivadas de receptores, de las cuales alrededor del 6% son derivadas de CD45.1, lo que indica un grado general de quimerismo de alrededor del 94%Hubo un quimerismo prácticamente completo en el compartimiento de células B y un dominio de células B derivadas de médula ósea GFP fotoactivables, una consecuencia de la fuerte selección negativa de células B derivadas de 564.Igi. Como se ha observado, el etiquetado in vivo con CD169 facilita una visualización robusta de la zona marginal. La segunda señal armónica es evidente en los elementos estructurales que contienen colágeno y los vasos principales, incluyendo la arteria central de la vaina linfoide periarteriolar y los macrófagos altamente autofluorescentes de cuerpos telébles activados asociados con la actividad del centro germinal.En conjunto, estos datos permiten la identificación de una región de interés que probablemente contiene un único centro germinal fotoactivable. La evaluación citométrica de flujo descendente confirma aún más la presencia de números de compartimentos celulares B normalizados, una población central germinal espontánea y un subconjunto de células B germinales fotoactivadas. Es importante restringir el tiempo de respuesta total de los pasos de explantado, fotoactivación y procesamiento de tejidos a cuatro a seis horas para garantizar una viabilidad celular suficiente.Las células fotoactivadas pueden ser ordenadas por flujo y sometidas a secuenciación de una sola célula para, por ejemplo, caracterizar el repertorio del receptor de células B de un solo centro germinal. El modelo de quimera mixta ha permitido la exploración de la biología autoreactiva del centro germinal a una nueva profundidad, por ejemplo, proporcionando una visión de cómo se desarrolla el proceso de propagación del epítopo. Tenga en cuenta que la fuente de luz para la microscopía de dos fotones son láseres de clase 4 pulsados muy potentes que pueden dañar gravemente los ojos.

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Investigación

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Immunology and Infection

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