Name: Opsonofagocítico asesinato ensayo para evaluar las respuestas inmunológicas contra patógenos bacterianos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Aprende el ensayo opsonofagocítico para evaluar respuestas inmunes contra Streptococcus pneumoniae. Este método permite medir la eficacia de anticuerpos y células fagocíticas en la eliminación bacteriana.

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Agradecemos su inestimable colaboración en el establecimiento de ensayos OPKA en nuestro laboratorio Dr. Moon Nahm (Universidad de Alabama Birmingham). Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud beca 1R01AI123383-01A1 a FYA.

1. la cultura, la diferenciación y la validación de las células HL-60

<ol><li>Preparar medios de cultivo de células HL-60 compuesto por 500 mL RPMI con L-glutamina y 50 mL inactivadas por calor suero bovino fetal. No agregue antibióticos ya que esto puede afectar la diferenciación de las células HL-60.</li>
	<li>Para la propagación y mantenimiento de las células HL-60, cultura 5 x 106 células en 10 mL de medio de cultivo celular HL-60 75 cm2 ventilación frascos a 37 º C y 5% CO2. Pasaje las células cada 3−4 dias a mantener concentraciones óptimas de la célula. Nota: La concentración celular no debe exceder 5 x 106/ml.</li>
	<li>Generar acciones de trabajo de las células HL-60 tomar aproximadamente 1 x 106 células/mL en medios de cultivo HL60 con 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) en los tubos criogénicos de 1 mL. Nota: Las acciones de trabajo pueden ser almacenadas a-80 ° C. La principal acción debe ser almacenada a-120 ° C.</li>
	<li>Diferenciar células HL-60 por cultivo 1,5 x 107 células en 15 mL de medio de cultivo celular HL-60 con 0,6% N, N-dimetilformamida (DMF) a 37 ° C y 5% de CO2 en frascos de tapón filtro estéril 75 cm2 durante 3 días antes de la OPKA.</li>
	<li>Validar que las células HL-60 han sido distinguidas con éxito y son apropiadas para su uso en el ensayo OPKA mediante ensayos de viabilidad y marcadores de superficie celular según establecido flujo cytometry protocolos16,17, 18,19. Después de la diferenciación, cosechar células HL-60 y mancha de aproximadamente 1 x 104 células con fluorescencia conjugado anticuerpos/manchas CD71, CD35, anexina V y yoduro de propidio. Nota: Las células diferenciadas deben ser ≥65% viables, ≥55% CD35+y ≤20% CD71+ determinado a través de establecer protocolos de validación14 (figura 1).</li>
</ol>
2. preparación de OPKA Buffers y reactivos

<ol><li>Preparar 50 mL de buffer estéril opsonización B (OBB) mezclando 42,5 mL de estéril 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS) con Ca2 +/Mg2 +5 mL de suero bovino fetal inactivado con calor y 2,5 mL de 0.1% gelatina estéril. Almacenar a 4 ° C.</li>
	<li>Obtener conejo bebé complemento y almacenar a-80 ° C.</li>
	<li>Obtener o preparar platos para cultivo bacteriano (es decir, placas de agar sangre de oveja al de 5% 15 x 100 mm2 ).</li>
</ol>
3. preparación de muestras de acción bacterianas

<ol><li>Obtener un stock de las cepas bacterianas positivo para ser probado. Nota: De este protocolo, serotipo 3 Streptococcus pneumoniae (WU2, generosamente proporcionada por el Dr. Moon Nahm) se utiliza.</li>
	<li>Crecer la cepa bacteriana en un caldo apropiado (es decir, caldo Todd-Hewitt + 0,5% extracto de levadura para esta cepa WU2) para aproximadamente 2−4 h a 37 ° C. Nota: La densidad óptica a 600 nm (OD600) de la cultura debe ser entre 0.6 y 0.8.</li>
	<li>De la pelotilla de las bacterias por centrifugación a 6.000 x g durante 2 min y resuspender las células en 10−30 mL de glicerol al 15% en el caldo apropiado. Alícuota del cultivo bacteriano (alícuota de 500 μl) en tubos de centrífuga estériles de 1.5 mL y conservar a-80 ° C.</li>
	<li>Descongelar un vial de acción bacteriana en baño de agua de 37 ° C. Las células bacterianas de la pelotilla y resuspender en 500 μl de OBB en condiciones estériles.</li>
	<li>Preparar diluciones diferentes de la población bacteriana en OBB (es decir, 10 μl de ninguna dilución, 10 μl de 1:10, 10 μl de 1: 100, etcetera). Realizar el ensayo OPKA (secciones 4-6, incluyendo co-cultivo HL-60/complemento) como se describe a continuación utilizando varias diluciones de la acción bacteriana no tratada. La cultura las placas durante la noche a 30 ° C (sin CO2). Nota: La temperatura de 30 ° C es específica para WU2 evitar crecimiento excesivo; otras cepas/serotipos pueden crecer óptimamente a 37 ° C.</li>
	<li>Contar las colonias para cada dilución de la acción bacteriana no tratada cultivada conjuntamente con complemento y células HL-60. Determinar qué dilución de las bacterias produce el número óptimo de colonias contables (aproximadamente 80−120 unidades formadoras de colonias de bacterias cultivadas conjuntamente con las células HL-60). Tenga en cuenta esta dilución para futuras OPKAs que implica esta acción bacteriana.</li>
</ol>
4. cultura y el tratamiento bacteriana

<ol><li>Descongelar un tubo de caldo bacteriano preparado en el paso 3.3. Pellet de bacterias (6.000 x g durante 2 min) y resuspender el precipitado de células en OBB en una disolución óptima determinada en el paso 3.6.</li>
	<li>Pipetear 10 μl de la dilución bacteriana resuspendida por pozo en una placa de cultivo celular de 96 pocillos de fondo redondo.</li>
	<li>Añadir 20 μl del anticuerpo o drogas el tratamiento apropiado a cada pozo experimental por duplicado. Nota: En este protocolo, se agrega un anticuerpo serotipo-específicos generado en ratones como tratamiento X y una enzima hidrolasa de glucósido conocida para degradar la cápsula de polisacárido 3 serotipo se agrega como tratamiento Y (figura 2)4,20. Para los pozos de control, use 1 x PBS o OBB, dependiendo el buffer utilizado para los pozos de tratamiento.</li>
	<li>Agitar la placa de la muestra a aproximadamente 90 rpm durante 1 h a temperatura ambiente. Ajustar estas condiciones dependiendo de la temperatura óptima o agitación de los tratamientos de prueba.</li>
</ol>
5. HL-60 la cultura bacteriana Co

<ol><li>Recolección de las células HL-60 diferenciados que son tratadas con DMF tres días antes (ver paso 1.4) en tubos cónicos de 15 mL para preparar células HL-60. Sedimenten las células (x 500 g, 3 min), deseche el sobrenadante y lavar con menos de 10 mL de PBS 1 x.</li>
	<li>Sedimenten las células lavadas (500 x g, 3 min), eliminar el sobrenadante y resuspender las células en OBB (comenzar con 1 mL OBB y ajustar para una concentración final de 1 x 107/ml después de la célula que cuenta).</li>
	<li>Agregar complemento de conejo bebé (de suero de conejo estéril, sin diluir bebé, semanas de edad 3−4) en un volumen final de 1:5. Nota: La concentración final de la mezcla de HL-60-complemento debe ser de 1 x 107/ml. Si pruebas de dependencia de complemento, puede utilizarse una segunda solución que contiene activadas células HL-60 con complemento inactivadas por calor (complemento puede ser inactivado por incubar en un baño de agua a > 55 ° C durante al menos 30 minutos).</li>
	<li>Después de 1 h la cultura bacteriana es completa (paso 4.4), dividen cada muestra (es decir, 10 μl de cada 30 μl de la muestra en dos nuevos pozos) en los pocillos duplicados para los dos grupos (es decir, uso solo 20 μl de la original cultura Co 30 μL para tener en cuenta para el error de pipeteo) : un sistema será Co cultivado con HL-60-complemento y uno incluirá sólo las bacterias. Añadir 50 μl de la mezcla de la HL-60-complemento (de paso 5.3) para cada sistema experimental de pozos (delegado + HL-60); Añadir 50 μl de OBB solo a los pozos de las bacterias sólo (delegado -HL-60). Nota: Para este ejemplo, se utiliza aproximadamente 800 UFC bacterianas para la inicial co-cultivo con células HL-60 de 5 x 10550 μl. Si esta multiplicidad de la infección es demasiado alta o demasiado baja según lo indicado por los números finales de la Colonia, ajustar la dilución bacteriana inicial en comparación con el recuento de células HL-60.</li>
	<li>Agitar la placa de 96 pozos a 37 ° C durante 1 hora (sin CO2).</li>
</ol>
6. placas y la incubación de la muestra

<ol><li>Diluir cada bien 1:5 con OBB, para que cada muestra tiene un volumen de 50 μl.</li>
	<li>Pipetee 50 μl de cada muestra directamente en un área designada de una placa de cultivo bacteriano, garantizar el espacio adecuado entre las muestras. De 15 x 100 mm2 alrededor de las placas de agar, muestras de pipeta aproximadamente 4 en un plato.</li>
	<li>Cubra y deje las muestras a secar durante unos 15 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Invertir las placas y la cultura durante la noche a 30 ° C (sin CO2). Por otra parte, la cultura placas en jarras anaeróbicas para comprobar las condiciones anóxicas afectan el crecimiento bacteriano o control para morfología.</li>
	<li>Después de la cultura durante la noche, contar las colonias en cada área designada de la muestra. Analizar los datos comparando el número de células vivas en cada sistema para el control correspondiente o muestras que no reciben cultura Co de células HL-60 (indicativo de supervivencia de la célula de 100%, 0% matanza de la célula).</li>
</ol>

<ol><li>Romero-Steiner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+an+opsonophagocytic+assay+for+the+measurement+of+functional+antibody+activity+against+Streptococcus+pneumoniae+using+differentiated+HL-60+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).</li>
<li>Nanra, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsular+polysaccharides+are+an+important+immune+evasion+mechanism+for+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+and+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus.</a> Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).</li>
<li>Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy+of+Pseudomonas+aeruginosa+pyelonephritis+in+neutropenic+mice+with+human+antilipopolysaccharide+monoclonal+antibody+and+cefsulodin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin.</a> Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).</li>
<li>Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+Hydrolysis+of+Pneumococcal+Capsular+Polysaccharide+Renders+the+Bacterium+Vulnerable+to+Host+Defense%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense.</a> Infection and Immunity. , (2018).</li>
<li>Baker, C. J., Noya, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+use+of+intravenous+immune+globulin+for+group+B+streptococcal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection.</a> Reviews of Infectious Diseases. 12, Suppl 4 476-482 (1990).</li>
<li>Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+opsonic+and+nonopsonic+serotype+3+pneumococcal+capsular+polysaccharide-specific+monoclonal+antibodies+against+intranasal+challenge+with+Streptococcus+pneumoniae+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice.</a> Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).</li>
<li>Parameswarappa, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Semi-synthetic+Oligosaccharide+Conjugate+Vaccine+Candidate+Confers+Protection+against+Streptococcus+pneumoniae+Serotype+3+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection.</a> Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).</li>
<li>Jackson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomized+clinical+trial+of+a+single+versus+a+double+dose+of+13-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine+in+adults+55+through+74+years+of+age+previously+vaccinated+with+23-valent+pneumococcal+polysaccharide+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine.</a> Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).</li>
<li>Cywes-Bentley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+to+a+conserved+antigenic+target+is+protective+against+diverse+prokaryotic+and+eukaryotic+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).</li>
<li>Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+HL-60+cell+line+to+measure+opsonic+capacity+of+pneumococcal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).</li>
<li>Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+differentiation+of+human+promyelocytic+leukemia+cells+induced+by+dimethyl+sulfoxide+and+other+polar+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).</li>
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<li>Dwyer, M., Gadjeva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opsonophagocytic+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Opsonophagocytic assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).</li>
<li>Burton, R. L., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+fourfold+multiplexed+opsonophagocytosis+assay+for+pneumococcal+antibodies+against+additional+serotypes+and+discovery+of+serological+subtypes+in+Streptococcus+pneumoniae+serotype+20%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunololgy%22%5BJournal%5D)">Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20.</a> Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).</li>
<li>Clarke, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-cost%2C+high-throughput%2C+automated+counting+of+bacterial+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies.</a> Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).</li>
<li>Aanei, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Database-guided+Flow-cytometry+for+Evaluation+of+Bone+Marrow+Myeloid+Cell+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e57867(2018).</li>
<li>Hirz, T., Dumontet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Isolation+and+Analysis+to+Determine+their+Role+in+Lymphoma+Cell+Sensitivity+to+Therapeutic+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visulaized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents.</a> Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846(2016).</li>
<li>Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+annexin+V%2Fpropidium+iodide+apoptosis+assay+for+accurate+assessment+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), 2597(2011).</li>
<li>Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+HL-60+promyelocytic+leukemia+cells%3A+simultaneous+determination+of+phagocytic+activity+and+cell+cycle+distribution+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry.</a> Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).</li>
<li>Middleton, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+the+Streptococcus+pneumoniae+type+3+capsule-specific+glycoside+hydrolase+of+Paenibacillus+species+32352%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352.</a> Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

OPKAs servir a funciones esenciales en la determinación de anticuerpo mediado inmune respuestas inducidas por vacunas6,8. La importancia principal de este OPKA simplificada es la adaptabilidad en las condiciones de prueba (es decir, anticuerpos, enzima tratamientos, etcetera.). En este sentido, mientras que este ensayo puede utilizarse para probar la contribución de opsoninas (es decir, anticuerpos) fagocitosis, puede también ser utilizado para evaluar formas de ...

Opsonofagocítico matando a ensayo (OPKA) es una herramienta crítica para vincular alteraciones en la estructura bacteriana o función con cambios posteriores en la respuesta inmune y la función. Como tal, con frecuencia se utiliza como una prueba complementaria para determinar base inmunitaria la eficacia de los tratamientos de anticuerpo, candidatos vacunales, optimización de la enzima, etcetera. Mientras los ensayos in vivo son necesarios para determinar el margen de altura eficaz o la protección de un modelo de infección bacteriana, la OPKA puede utilizarse para evaluar contribución inmune a la muerte de la célula bacteriana más básicos componentes: bacterias, células inmunes y experimental tratamientos. Estudios anteriores han demostrado que OPKAs pueden ser modificados y utilizados para una variedad de bacterias y serotipos, incluyendo Streptococcus pneumoniae1,2de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa3. Además, estos ensayos optimizados pueden utilizarse para evaluar distintos tratamientos experimentales, incluyendo la capacidad de una enzima para que la bacteria sea más accesible a los tratamientos4 y anticuerpo complemento-mediada de las células inmunes para mejorar opsonización5. Clásico, ensayo OPKA se ha utilizado con éxito en investigación básica y clínica ajustes como un indicador de gran alcance para la protección inducida por anticuerpos patógenos específicos6,7,8,9 .
Diferentes tipos de células inmunes pueden usarse para evaluación de opsonofagocítico matar. Una población fagocítica comúnmente utilizada es la línea de células leucémicas humanas HL-60. Esta línea celular se puede mantener como promyelocytes inactivada en la cultura; sin embargo, puede ser distinguidos en varios Estados activados a través de diferentes drogas tratamientos10,11. Tratamiento de HL60 con N, N-dimetilformamida distingue la línea celular en neutrófilos activados con fuerte actividad fagocítica11. Mientras que las células HL-60 se han optimizado y se utilizan con frecuencia para estos ensayos de fagocitosis10, pueden utilizarse otros leucocitos polimorfonucleares primarios como el brazo inmune del experimento12.
Además, estos ensayos pueden ser simplificado13 o multiplexado14 mirar varias cepas resistentes a los antibióticos de la bacteria a probar. El método de multiplexado se ha hecho más factible a través del desarrollo de software que puede contar eficientemente Colonia bacteriana formando unidades (UFC) por spot en una placa de agar15. Aquí, describimos un método racionalizado usando una cepa bacteriana, las células HL-60, complemento de conejo bebé y placas de agar sangre. Con este método, varios tratamientos pueden ser evaluados rápidamente para hacer frente a preguntas de investigación específicas sobre cómo se pueden modular la respuesta inmune innata a la infección bacteriana.

<table><tbody><tr><td>Anexina V (conjugada con APC)</td><td>BioLegend</td><td>640919</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD35, humano (conjugado con PE)</td><td>BioLegend</td><td>333405</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD71, humano (conjugado con PE)</td><td>BioLegend</td><td>334105</td><td></td></tr><tr><td>cepa bacteriana a utilizar (es decir, Streptococcus pneumoniae, WU2)</td><td>Laboratorio de Referencia Respiratoria Bacteriana (Dr. Moon Nahm)&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>placas de agar sangre Hardy</td><td>Diagnostic</td><td>A10</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Clone serum</td><td>HyClone</td><td>SH30080.03</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Sigma</td><td>G9012-1L</td><td></td></tr><tr><td>células HL-60</td><td>ATCC</td><td>CCL-240</td><td></td></tr><tr><td>IgG Control de isotipo (conjugado PE)</td><td>BioLegend</td><td>400907</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetilformamida (DMF)</td><td>Fisher Químico</td><td>UN2265</td><td></td></tr><tr><td>yoduro de propidio</td><td>Sigma</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medios con L-glutamina</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr></tbody></table>

opsonofagocítico asesinato ensayo para evaluar las respuestas inmunológicas contra patógenos bacterianos

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Un aspecto clave de la respuesta inmune a la colonización bacteriana de la hostia es la fagocitosis. Un ensayo de matanza opsonofagocítico (OPKA) es un procedimiento experimental en el que las células fagocíticas son cultivadas conjuntamente con unidades bacterianas. Las células inmunes a fagocitar y matar los cultivos bacterianos en una forma dependiente de complemento. La eficacia de la muerte de la célula inmunitaria depende de varios factores y puede utilizarse para determinar bacterias diferentes culturas Comparar con respecto a la resistencia a la muerte celular. De esta manera, la eficacia de la terapéutica de base inmunitaria potencial puede ser evaluada contra cepas bacterianas específicas o serotipos. En este protocolo, describimos un OPKA simplificada que utiliza condiciones de cultivo básico y cuenta determinar la viabilidad de la célula bacteriana después de co-cultivo con condiciones de tratamiento y HL-60 células inmunes de la célula. Este método ha sido utilizado con éxito con un número de diferentes serotipos de neumococos, capsulares y cepas de acapsular y otras especies bacterianas. Las ventajas de este protocolo OPKA son su simplicidad, versatilidad (como este ensayo no se limita a los tratamientos de anticuerpo como opsoninas) y reducción al mínimo de tiempo y reactivos para evaluar grupos experimentales básicos.

Validación de la diferenciación de la HL-60 se debe realizar antes de comenzar la OPKA. Esto puede lograrse mediante citometría de flujo para determinar la expresión extracelular de CD11b, CD35, CD71 y anexina V (figura 1). Yoduro de propidio también puede utilizarse como un marcador de viabilidad. Después de ser tratado con DMF durante 3 días, se debe aumentar la expresión de CD35 (≥55% de todas las células) y disminución de expresión de CD71 (≤20% de todas las células). El porcentaje de pr...

Este ensayo de matanza opsonofagocítico se utiliza para comparar la capacidad de las células inmunitarias fagocíticas y matar bacterias basadas en diferentes tratamientos o condiciones. Clásicamente, este ensayo sirve como el estándar de oro para la evaluación de funciones efectoras de los anticuerpos contra una bacteria como opsoninas.

Opsonofagocítico asesinato ensayo para evaluar las respuestas inmunológicas contra patógenos bacterianos

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Este ensayo vincula la modulación de la estructura bacteriana y la función a la actividad antibacteriana basada en células inmunitarias. Como tal, se puede evaluar una inmunoterapéutica clave de un tratamiento potencial para determinar la probabilidad de un aclaramiento bacteriano mejorado. El ensayo de matanza opsonofofática tradicionalmente sirve como el estándar de oro para evaluar las funciones efectivas de los anticuerpos levantados contra la bacteria como obsonantes.Este protocolo ofrece simplicidad y versatilidad sobre los ensayos estandarizados de alto rendimiento existentes. En este protocolo, investigamos los efectos de un tratamiento farmacológico sobre la neumonía por estreptococos y cómo estos efectos se traducen en una mejor fagocitosis de la bacteria. Aquí, aplicamos el OPKA a las células de la neumonía por estreptococos.Sin embargo, este protocolo se puede adoptar para evaluar la matanza fagocítica de otros patógenos por las células inmunitarias. Dedique tiempo a optimizar las existencias bacterianas y asegúrese de que las UFC finales a contar estén dentro del rango óptimo. Recomendamos encarecidamente el uso de citometría de flujo para garantizar que las células HL

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Se presenta un análisis de flujo de alto rendimiento por citometría de determinar la actividad fagocítica de los antígenos específicos de los anticuerpos de muestras clínicas, la utilización de fluorescentes recubiertas de antígeno cuentas y una línea celular de monocitos que expresan múltiples receptores Fc-proporciona el uso de los receptores y las determinaciones de la actividad fagocítica en un estándar y forma reproducible por cualquier antígeno de interés.

La determinación de la actividad fagocítica de los anticuerpos de muestras clínicas

Fuente: Nagre, N., et al. Fagocitosis de macrófagos alveolar y eliminación bacteriana en ratones. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo demuestra la evaluación de la fagocitosis mediada por receptores del complemento utilizando glóbulos rojos de oveja opsonizados con IgM y complemento, seguida de su captación por macrófagos de ratón. El grado de fagocitosis se cuantifica midiendo un producto cromogénico azul formado por la oxidación catalizada por hemoglobina del diaminofluoreno.

Modelado de la fagocitosis mediada por complemento utilizando glóbulos rojos opsonizados in vitro

Fuente: Seman, B. G., et.al. Modelo de imagen neonatal de sepsis bacteriana Gramnegativa. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demuestra el aislamiento de neutrófilos y monocitos inflamatorios de bazos neonatales de ratón y su aplicación en un ensayo luminiscente de eliminación bacteriana. Cubre la disociación mecánica, la lisis de glóbulos rojos, el enriquecimiento celular basado en perlas magnéticas, la incubación bacteriana y la protección con antibióticos. Las lecturas de luminiscencia...

Evaluación in vitro de la muerte bacteriana por fagocitos esplénicos neonatales de ratón

Este video muestra una técnica para evaluar la actividad bactericida mediada por el complemento de los anticuerpos presentes en el suero. Este enfoque combina suero aislado con bacterias patógenas y proteínas exógenas del complemento. Tras la incubación, las bacterias se cultivan en una placa de agar y las colonias producidas se cuantifican para medir el título bactericida sérico.

Ensayo bactericida en suero para la actividad bactericida mediada por el complemento de los anticuerpos

En este vídeo, demostramos un ensayo para detectar la citotoxicidad de cepas de S. taphylococcus aureus virulentas y menos virulentas frente a neutrófilos humanos después de la fagocitosis utilizando citometría de flujo.

Ensayo de citotoxicidad de cepas de Staphylococcus aureus en neutrófilos después de fagocitosis

El video muestra un ensayo de eliminación opsonofagocítica in vitro utilizando un cocultivo de neutrófilos humanos con Streptococcus pneumoniae. Los anticuerpos y las proteínas del complemento facilitan la opsonización de las bacterias, lo que permite a los neutrófilos reconocer y matar a las bacterias, mostrando una actividad opsonofagocítica exitosa de los neutrófilos.

Evaluación de la actividad de destrucción opsonofagocítica frente a patógenos bacterianos

Este vídeo muestra un ensayo de opsonoadherencia para examinar la interacción entre las bacterias opsonizadas y las células inmunitarias. Las bacterias marcadas con fluorescencia, tratadas con suero de prueba que contiene anticuerpos anticápsulas, se incuban con macrófagos. Después de teñir los macrófagos con fluorescencia, las bacterias adheridas a la superficie del macrófago se observan bajo un microscopio para su visualización.

Un ensayo de opsonoadherencia para evaluar la opsonización de bacterias encapsuladas por anticuerpos anticápsulas

Aquí, presentamos un protocolo para medir la virulencia de las bacterias planctónicas o conectado a superficie utilizando D. discoideum (ameba) como anfitrión. Virulencia se mide durante un período de 1 h y anfitrión matando se cuantifica usando análisis de imagen y microscopia de fluorescencia. Demostramos este protocolo utilizando la bacteria p. aeruginosa.

Un análisis de la virulencia bacteriana rápida basada en imágenes usando ameba

Aquí presentamos un elegante protocolo para la evaluación en vivo de la vacuna eficacia y anfitrión inmunorespuestas. Este protocolo puede ser adaptado para modelos de vacuna que estudian viral, bacteriana o parásitos patógenos.

Evaluación de las respuestas del huésped-patógeno y eficacia de la vacuna en ratones

Aquí presentamos un protocolo para medir actividad de Shigellacidal de anticuerpos en suero. Suero se mezcla con las bacterias y complemento exógeno, que se incubó, y la mezcla de reacción se platea en placas de agar. Viables bacterias forman colonias que se cuentan, usando un enumerador de colonias automatizado y permite determinar la concentración bactericida.

Un alto rendimiento Shigella-ensayo bactericida específico

El ensayo de adhesión a opsono es un método alternativo al ensayo de muerte opsonótico-fagocítico para evaluar las funciones opsónicas de los anticuerpos en el desarrollo de vacunas.

Ensayo de adhesión a Opsono para evaluar anticuerpos funcionales en el desarrollo de vacunas contra la antrasis bacillus y otros patógenos encapsulados

Aprende el ensayo opsonofagocítico para evaluar respuestas inmunes contra Streptococcus pneumoniae. Este método permite medir la eficacia de anticuerpos y células fagocíticas en la eliminación bacteriana.

Opsonofagocítico asesinato ensayo para evaluar las respuestas inmunológicas contra patógenos bacterianos

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