Investigación de alteraciones en Caecum Microbiota después de una lesión cerebral traumática en ratones
19 de septiembre de 2019
Aquí se presenta un protocolo para inducir lesiones cerebrales traumáticas difusas utilizando un dispositivo de percusión de fluido lateral seguido de la recopilación del contenido de caecum para el análisis de microbioma intestinal.
La simultáneación y las interacciones de líneas entre el cerebro y la microbiota intestinal sigue siendo desconocida. Utilice esta técnica, alteraciones en la microbiota intestinal después de lesión cerebral traumática en ratones se pueden examinar. La principal ventaja de esta técnica es que es relativamente simple y eficiente.
Demostrando el procedimiento estará Wendong You, un estudiante graduado de mi laboratorio. Para la inducción de lesiones cerebrales traumáticas, confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie en un ratón anestesiado, y aplique ung ón en los ojos del animal. Después del afeitado, desinfecta la piel expuesta del cuero cabelludo con 70% de etanol antes de incitar el cuero cabelludo en un plano sagital.
Usando fórceps, retraiga la incisión en ambos lados y separe ligeramente el periosteo. Utilice un marcador para dibujar un círculo de tres milímetros de diámetro en el área parietal derecha del cráneo a dos milímetros de distancia de la línea media. Utilice un taladro eléctrico para penetrar cuidadosamente el cráneo sin dañar la dura.
Retire el colgajo óseo para exponer una ventana ósea de tres milímetros y coloque una cánula de lesión plástica sobre la craneotomía. Después de cementar la cánula al cráneo con acrílico dental, utilice una jeringa de cinco mililitros para llenar la cánula con solución salina estéril 0,9%normal, teniendo cuidado de evitar burbujas. Encienda el osciloscopio y el amplificador.
Confirme que el tubo de alta presión del dispositivo de lesión de percusión de fluido lateral está libre de burbujas de aire, y entregue alrededor de 10 pulsos de prueba, hasta que el dispositivo dé una señal estable. Ajuste el ángulo de la posición inicial del péndulo para alcanzar una intensidad de pulso de aproximadamente dos atmósferas estándar y conecte la cánula de lesión al dispositivo de lesión de percusión fluida lateral. Apriete el gatillo para liberar el péndulo, induciendo la lesión cerebral.
A continuación, obtenga y transmita un pulso a la dura a través de todo el sistema de tubos cerrado y lleno de líquido. Después de la inducción de la lesión cerebral, retire la cánula y sutura la incisión. A continuación, coloque el ratón sobre una almohadilla de calefacción con supervisión hasta que esté ambulatorio, antes de devolver el animal a su jaula de origen con acceso ad libitum a alimentos y agua.
En los puntos de tiempo experimental indicados, exponga los intestinos de acuerdo con los protocolos estándar y utilice fórceps atraumáticos para separar suavemente el cecum de los otros tracto intestinales. Cuando el tejido ha sido localizado, cortar el cecum con tijeras afiladas y extraer manualmente el contenido de cecum en un apósito estéril. A continuación, transfiera el contenido a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, para un almacenamiento de menos 80 grados Celsius hasta el análisis del microbioma.
La secuenciación del ADN recombinante 16S demuestra una menor diversidad en la microbiota de cecum en ratones tres días después de una lesión cerebral traumática, con los taxones más abundantes dentro del contenido de cecum de los grupos de lesiones cerebrales falsas y traumáticas que se muestran en la figura. Además, la escala multidimensional no métrica revela cambios en la composición de la microbiota del cecum después de una lesión cerebral traumática. Recuerde mantener la dura intacta al perforar el cráneo, y ser suave al localizar y separar el caecum de otras vías intestinales.
Después de este procedimiento, se puede realizar la tinción y análisis de hematoxilina y eosina para examinar el cambio histológico y la respuesta inflamatoria dentro de las vías intestinales después de una lesión cerebral traumática.
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Resumen
Este estudio presenta un protocolo para inducir una lesión cerebral traumática (LCT) difusa utilizando un dispositivo de percusión lateral por fluido en ratones. Tras la lesión, el estudio investiga los cambios en la microbiota intestinal mediante la recolección de contenidos del ciego para su análisis. El enfoque tiene como objetivo esclarecer las interacciones entre la lesión cerebral y la composición de la microbiota intestinal.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Análisis del microbioma
- Investigación sobre lesiones cerebrales traumáticas
Antecedentes
- Comprender las relaciones entre el cerebro y la microbiota intestinal es fundamental en la investigación del TBI.
- El conocimiento actual sobre cómo el TBI afecta a la microbiota intestinal es limitado.
- El uso de ratones como organismo modelo permite condiciones experimentales controladas.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo confiable para inducir lesión cerebral traumática (TBI) y analizar los cambios posteriores en el microbioma intestinal.
- Investigar posibles correlaciones entre la lesión neurológica y la diversidad de la microbiota intestinal.
- Proporcionar información sobre los impactos de la lesión cerebral traumática (TBI) en la salud general y en las interacciones del microbioma.
Métodos Utilizados
- Se utilizó un dispositivo de percusión lateral del líquido para inducir la lesión cerebral traumática en ratones anestesiados.
- Se realizaron procedimientos quirúrgicos cuidadosos, incluyendo la penetración del cráneo y la implantación de la cánula.
- Después de la lesión, se recogieron los contenidos del ciego para el análisis del microbioma y se almacenaron adecuadamente.
- Se empleó la secuenciación del ADNr 16S para determinar los cambios en la diversidad y composición de la microbiota.
Resultados principales
- El análisis indicó una diversidad reducida en la microbiota del ciego dentro de los tres días posteriores a la lesión cerebral traumática.
- La escalamiento multidimensional no métrico demostró cambios significativos en la composición de la microbiota tras la lesión.
- El estudio destaca la necesidad de tener precaución al manipular tejidos y mantener condiciones estériles.
Conclusiones
- Este estudio establece una metodología para explorar el eje intestino-cerebro en el contexto del TCE.
- Los hallazgos sugieren que el TCE podría alterar la microbiota intestinal, lo cual podría tener implicaciones para la recuperación.
- El aumento del conocimiento sobre las interacciones entre el intestino y el cerebro podría orientar futuras estrategias terapéuticas para el TCE.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite la desactivación mecanicista del eje microbiota-intestino-cerebro en la investigación de lesiones cerebrales traumáticas al proporcionar un modelo reproducible para evaluar alteraciones del microbioma tras la lesión. Facilita la validación de dianas y el descubrimiento de biomarcadores al vincular el trauma neurológico con cambios cuantificables en la composición de la microbiota del ciego. El enfoque mejora la confianza predictiva en estudios preclínicos mediante la estandarización de los procedimientos de inducción de LCT y muestreo del microbioma.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la comprobación de hipótesis sobre el eje intestino-cerebro mediante la medición de los cambios en la diversidad de la microbiota tras la inducción controlada de TBI.
- Valor operativo: Proporciona un procedimiento quirúrgico y de muestreo estandarizado para la recolección consistente de microbiota del ciego en diferentes grupos experimentales.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera resultados cuantitativos de secuenciación de ARNr 16S para perfilar los cambios en la composición microbiana en muestras de ciego.
- Valor operativo: Establece un flujo de trabajo reproducible para el análisis del microbioma que puede integrarse en protocolos de cribado para terapéuticas dirigidas al intestino.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Apoya la modelización de sistemas relevantes para enfermedades mediante la correlación entre la gravedad del TCE y las alteraciones del microbioma en un modelo murino.
- Valor operativo: Permite el seguimiento longitudinal de los cambios en la microbiota para orientar decisiones de avance ajustadas al riesgo en programas preclínicos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método conecta la biología del descubrimiento y la validación preclínica mediante la estandarización de la inducción del TBI y del análisis del microbioma intestinal para la reducción de riesgos del objetivo.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis sobre las interacciones microbiota-intestino-cerebro mediante lesiones controladas y caracterización del microbioma.
- Selección: Proporciona muestras estandarizadas de microbiota del ciego adecuadas para secuenciación 16S y análisis de diversidad posteriores.
- Análisis: Permite la comparación cuantitativa de la composición microbiana mediante escalado multidimensional no métrico y métricas de diversidad.
- Investigación Traducional: Conecta modelos de lesión neurológica con biomarcadores del microbioma para garantizar continuidad preclínica.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para estudiar la modulación del eje intestino-cerebro en modelos de enfermedades neurológicas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en la investigación del eje intestino-cerebro al proporcionar lecturas cuantificables de la microbiota tras el TCE.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante protocolos estandarizados de cirugía, muestreo y secuenciación.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al vincular modelos de TCE con firmas de biomarcadores basadas en el microbioma.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de compuestos dirigidos a las interacciones intestino-cerebro en la recuperación del TCE.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en procedimientos quirúrgicos en ratones y manejo estéril de tejidos.
- Depende del acceso a dispositivos de lesión por percusión lateral del líquido y a infraestructura para secuenciación del ADN ribosómico 16S.
- Necesita estandarización entre equipos de análisis de neurociencia y microbioma.
- Implica consideraciones de adaptación para el muestreo del ciego en diferentes cepas de ratones o modelos de lesión.
- Limitado por la necesidad de técnica aséptica durante la disección del tejido intestinal para prevenir contaminación.
