Name: Realización de espectroscopía en nanopartículas Plasmónicas con microscopía de contraste de interferencia diferencial de tipo Nomarski basado en la transmisión (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Aprenda a realizar espectroscopía de nanopartículas plasmónicas mediante microscopía DIC de transmisión tipo Nomarski. Este protocolo detalla la preparación de muestras de nanopartículas de oro y la obtención de imágenes de alta resolución.

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El Dr. Anthony S. STENDER desea reconocer el apoyo técnico a través de la Nanoscale y el Instituto de fenómenos cuánticos (NQPI) en la Universidad de Ohio. Este artículo fue posible gracias a la financiación inicial proporcionada al Dr. STENDER por la Universidad de Ohio.

1. preparación de muestras con diapositivas de microscopía de vidrio estándar
<ol><li>Prepare diapositivas de microscopio de vidrio para la deposición de muestras. Nota: en algunas circunstancias, puede ser más apropiado almacenar el vidrio en agua ultrapura en lugar de etanol. Sin embargo, el almacenamiento en agua o aire hace que el vidrio hidrófobo con el tiempo.<ol>
<li>Para obtener los mejores resultados, compre portaobjetos de vidrio o cuarzo y vidrio de cubierta.</li>
		<li>Usando una pluma de trazado, coloque una marca de rasguño corto y superficial en el centro de cada resguardo de cubierta de vidrio.</li>
		<li>Limpie todo el vidrio del microscopio, incluso si se adquiere "pre-limpiado", para eliminar fragmentos de vidrio, polvo, polvo, residuos orgánicos y cualquier otro contaminante que afecte la calidad de la imagen o la deposición de la muestra. Nota: este método de limpieza a continuación funciona bien para los tipos de muestras descritas aquí y evita el uso de productos químicos agresivos. Los productos químicos harsher pueden grabar el vidrio y requieren más cuidado en el manejo y la eliminación.<ol>
<li>Coloque el cristal del microscopio en los estantes de almacenamiento y luego en un vaso de precipitados, o en un frasco de tinción. No coloque el cristal del microscopio en la parte inferior de los vasos de precipitados y otros cristalería de laboratorio sin aglomerado, ya que cada pieza y superficie del vidrio del microscopio debe estar completamente expuesta a los agentes de limpieza.</li>
			<li>Vierta ~ 1 mL de detergente líquido (tabla de materiales) en el recipiente y tapa el recipiente con agua. Sonicar durante 30 min. Nota: una vez que el proceso de limpieza comienza, sólo manipule el vidrio mientras lleva guantes, para evitar dejar residuos de huellas dactilares en el vidrio.</li>
			<li>Vierta el contenido líquido del recipiente de limpieza en un fregadero. Enjuague el recipiente varias veces con agua ultrapura para eliminar toda la apariencia de detergente. Rellene el recipiente con agua ultrapura. Someter a ultrasonidos el recipiente con vidrio del microscopio por otro 30 min.</li>
			<li>Repita el paso anterior al menos una vez más. Realizar rondas adicionales de sonicación en agua hasta que sea obvio que todos los rastros del detergente han sido removidos.</li>
			<li>Vierta el contenido del recipiente de limpieza. Enjuagar el recipiente con agua ultrapura. Rellene el envase con etanol. Sonicar vidrio del microscopio durante 30 min.</li>
			<li>Vierta el contenido del recipiente de limpieza en un recipiente de desechos. Rellenar con etanol. Cubra el recipiente para evitar la pérdida de etanol a través de la evaporación. Almacene el cristal del microscopio en este recipiente hasta el momento del experimento. Las diapositivas permanecen limpias y utilizables siempre y cuando permanezcan sumergidas en etanol dentro de un recipiente cubierto.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de la solución de nanopartículas
	<ol>
<li>Con una micropipetas, extraiga una alícuota de 100 μL de una solución de nanopartículas de oro de 0,05 mg/mL de su contenedor de almacenamiento original y expulse la solución en un tubo de centrifugación de 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifugar la muestra durante 10 min a 6.000 x g.</li>
		<li>Retire el sobrenadante con una micropila, con el fin de eliminar el exceso de surfactante.</li>
		<li>En el tubo de centrifugación, coloque 100 μL de agua ultrapura. Nota: Si no se puede eliminar todo el sobrenadante en el primer intento, repita los pasos de centrifugación y resuspensión.</li>
		<li>Torbellino brevemente la muestra para Resuspender el pellet. Sonicar inmediatamente después durante 20 minutos para resuspender completamente y romper agregados de nanopartículas. Nota: Si la muestra no se utiliza inmediatamente, se debe Sonicar de nuevo durante 20 minutos antes de depositar la solución en el vidrio del microscopio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Deposición de muestra
	<ol>
<li>Retire los resbalones de cubierta y los portaobjetos de sus recipientes de almacenamiento. Seque el vidrio con nitrógeno presurizado o argón.</li>
		<li>Utilizando una micropipetas, lanzar 6 μL de solución de nanopartículas del paso 1.2.5 en el resguardo de la tapa. Para extender la gota uniformemente, coloque cuidadosamente una segunda pieza más grande de vidrio del microscopio en la parte superior del resguardo de la cubierta, como un segundo resguardo de la cubierta o un portaobjetos de microscopio. Evite que las burbujas de aire se atrapen entre las dos piezas de vidrio.<ol>
<li>Gire el sustrato de la muestra y selle los bordes del resguardo de la cubierta con una estrecha línea de esmalte de uñas para evitar la evaporación de la solución mediana.</li>
			<li>Alternativamente, para la imagen de la muestra "seca", deje que la solución reposar durante 5 – 15 minutos en el resguardo de la tapa, antes de retirar la pieza de vidrio no deseada. Soplar suavemente el deslizamiento de la tapa seco con nitrógeno presurizado o argón.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Si es posible, muestras de imagen inmediatamente después de la preparación. Si no es posible, almacene las muestras en un recipiente cubierto, como una placa de Petri, hasta que se hagan imágenes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. la imagen DIC
<ol><li>Alinear objetivo y condensador.<ol>
<li>Después de colocar la muestra en el microscopio, encuentre el plano focal con la muestra en él. Primero Localice y céntrese en la marca de arañazos creada anteriormente. Luego afinar el enfoque hasta que las nanopartículas se ven en la vista.</li>
		<li>Para determinar la colocación precisa del condensador, utilice el método de iluminación Kohler. 5 la iluminación Kohler a alta magnificación (80x, 100x) se logra más fácilmente estableciendo primero la iluminación Kohler a una ampliación más baja, como 20x. Nota: normalmente, no es necesario volver a ajustar la iluminación de Kohler durante la toma de imágenes de una sola muestra. Sin embargo, es una buena práctica verificar que Kohler Illumination esté correctamente configurado al cambiar a una nueva diapositiva de microscopio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Optimice la configuración de contraste.<ol>
<li>Seleccione una región de interés dentro de la muestra para la creación de imágenes. Centre la región en el campo de visión de la cámara y ajuste el enfoque según sea necesario.<ol>
<li>Si el microscopio tiene el diseño de Senarmont, comience con el polarizador establecido cerca de la máxima extinción de fondo y gire gradualmente el polarizador hacia la extinción de fondo decreciente. La intensidad del fondo aumentará gradualmente.</li>
			<li>Si el microscopio no tiene un diseño de Senarmont, comience con el tren óptico fijado a la máxima extinción de fondo. En este caso, ajustar gradualmente la posición del prisma objetivo hacia la extinción de fondo decreciente. Nota: el ajuste ideal se logra cuando las nanopartículas alcanzan su mayor diferencia de intensidad (es decir, contraste) del valor de fondo local promediado. Para las nanopartículas plasmónicas, el contraste óptimo se logra normalmente con un fondo relativamente oscuro, por lo tanto en entornos cercanos a la extinción de fondo máxima.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imagen de la muestra.<ol>
<li>Apague la iluminación de la habitación para evitar que la iluminación perdida interactúe con el proceso.</li>
		<li>Mientras visualiza las nanopartículas con una cámara de imagen científica, determine el nivel de fondo óptimo. Utilizando un filtro de paso de banda de 10 Nm de ancho completo a medio máximo (FWHM) con su longitud de onda central colocalizada con la longitud de onda principal LSPR, ver la región de interés. Ajuste la intensidad de la lámpara o el tiempo de exposición hasta que el nivel de fondo esté en el rango de 15% – 40% del nivel de capacidad máximo de la cámara y ningún objeto dentro de la región de interés muestra intensidades de señal que excedan el 90% del nivel de intensidad máxima de la cámara. Nota: el objetivo del paso 2.3.2 es evitar saturar el sensor al cambiar entre filtros. El nivel de fondo ideal variará entre las muestras y las cámaras. Una vez finalizado este paso, se puede ajustar el tiempo de exposición, pero no la intensidad de la lámpara.</li>
		<li>Imagen de la muestra con una serie de filtros de paso de banda que cada uno tiene un FWHM de 10 nm y que como un todo permiten la toma de imágenes a través de todo el rango de longitud de onda de interés. Asegúrese de que la intensidad del fondo permanezca consistente de la imagen a la imagen (dentro del ~ 5% entre sí) ajustando el tiempo de exposición. Después de cambiar los filtros, vuelva a enfocar la muestra antes de capturar la imagen.</li>
		<li>Guarde las imágenes como archivos TIFF sin comprimir y/o en el formato de archivo nativo del software, con el fin de preservar toda la información.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gire la muestra.<ol>
<li>Después de recoger las imágenes de la muestra en su posición original, la muestra ahora se puede rotar e imágenes en orientaciones adicionales en la trayectoria de la luz. Realice la rotación a intervalos regulares (p. ej., 10 ° o 15 °) a través de un rango de 180 ° o 360 °. Nota: la rotación requiere una etapa de muestra giratoria.</li>
		<li>Como en las secciones 2.1-2.3, ajuste la configuración de la cámara para proporcionar un nivel de fondo consistente de imagen a imagen. Nota: no se debe realizar ningún ajuste a la iluminación Kohler.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Análisis de datos utilizando ImageJ
Nota: los siguientes cálculos se pueden realizar en una variedad de paquetes de software, y a veces en el programa nativo utilizado para recoger las imágenes. ImageJ es un software de libre disposición de los institutos nacionales de la salud (NIH).
<ol><li>Calcule el contraste o la intensidad de las partículas.<ol>
<li>Abra la imagen con ImageJ.</li>
		<li>Seleccione la herramienta rectángulo y dibuje un rectángulo alrededor de la región principal de interés.</li>
		<li>En la barra de herramientas, seleccione imageny, a continuación, zoomy, a continuación, selección. La ventana de imágenes se acercará al área seleccionada.</li>
		<li>En la barra de herramientas, seleccione imagen, luego ajustey, a continuación, brillo/contraste. Aparecerá una nueva ventana. Para permitir una mejor visualización de la región de muestra, ajuste los cuatro parámetros: mínimo, máximo, brillo y contraste. Estos ajustes no alteran los datos científicos, sino que simplemente permiten una mejor visibilidad de la región de muestreo. Nota: los pasos 3.1.3 y 3.1.4 se pueden realizar varias veces y en orden inverso.</li>
		<li>Usando la herramienta rectángulo de nuevo, dibuja un cuadro alrededor de la primera nanopartícula a medir. La caja debe ser ligeramente más grande que el disco aireado de la nanopartícula.</li>
		<li>En la barra de herramientas, seleccione analizary, a continuación, medir. Aparece una nueva ventana que notifica las intensidades mínima, máxima y media de los píxeles ubicados dentro del cuadro seleccionado.</li>
		<li>Arrastre el cuadro utilizado para medir la nanopartícula a un área inmediatamente adyacente a la partícula, donde el contraste de fondo es relativamente incluso y no hay partículas o contaminantes están presentes. Conserve el tamaño original de la caja.</li>
		<li>Utilice la herramienta medir para determinar la intensidad media del área de fondo.</li>
		<li>Mida las partículas restantes y un área de fondo adyacente para cada una.</li>
		<li>Repite el proceso para cada partícula en todas las imágenes de la serie.</li>
		<li>Exporte los datos a una hoja de cálculo para calcular el contraste o la intensidad de cada partícula, en todas las longitudes de onda y ángulos.</li>
		<li>Calcule el contraste de cada partícula, utilizando la siguiente ecuación13,14,15: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq1.jpg"> Nota: usando esta ecuación, el contraste de partículas siempre debe ser &gt; 0.</li>
		<li>Calcule el valor máximo ajustado del fondo de la partícula dividiendo la intensidad de partícula máxima medida por la media de fondo: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq2.jpg">
</li>
		<li>Del mismo modo, calcule el valor mínimo ajustado en segundo plano dividiendo la intensidad mínima de partícula medida por el medio de fondo: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq3.jpg"> Nota: como se calculó, el máximo debe tener un valor mayor que uno, mientras que el mínimo será menor que uno. Es aceptable restar cada valor por "1", de modo que el fondo medio es esencialmente cero, el máximo se representa como un valor positivo, y el valor mínimo se asigna un valor negativo16. Este último enfoque permite al analista considerar por separado lo que está ocurriendo a lo largo de cada uno de los campos de polarización, lo cual es útil cuando se estudian partículas anisotrópicas.</li>
		<li>Para graficar el perfil espectral en una posición de nanopartícula determinada, trace los datos con la longitud de onda a lo largo del eje x y el contraste o la intensidad a lo largo del eje y.</li>
		<li>Para graficar el perfil rotacional en una longitud de onda determinada, trace el ángulo de rotación a lo largo del eje x y el contraste o la intensidad a lo largo del eje y.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

El autor no tiene nada que revelar.

Cuando se toma imágenes con microscopía DIC, es fundamental optimizar los componentes ópticos antes de recopilar datos. Incluso ajustes menores en el polarizador en medio de un experimento pueden resultar en impactos significativos en los datos finales6. Además, diferentes materiales requieren diferentes ajustes polarizadores. Aunque aquí se utilizaron grandes tamaños de paso para demostrar el efecto del ángulo de polarización, en un experimento real, es imprescindible optimizar el ajuste del pola...

Desde la década de 1980, la microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) se ha visto en gran medida como un importante método de imagen reservado para los objetos de microescala dentro de las ciencias biológicas. Sin embargo, durante su desarrollo en los años 1950 y 1960, fue concebido como una técnica para la ciencia de los materiales1. Con los recientes avances en las Ciencias materiales relacionados con las nanopartículas plasmónicas, se ha realizado un mayor interés en la caracterización de materiales con microscopía óptica.
Muchas técnicas ópticas están sin duda disponibles para la caracterización de nanomateriales (por ejemplo, campo oscuro, campo claro, luz polarizada, fluorescencia, etc.). El campo oscuro es muy popular en la investigación de nanopartículas, pero se basa únicamente en la colección de dispersión y proporciona información limitada sobre muestras complejas2. La fluorescencia puede ser útil, pero sólo con muestras que luminesce o que pueden ser debidamente teñidas. La microscopía DIC tiene varios rasgos que la convierten en una herramienta valiosa para el análisis de nanopartículas. Las ventajas más frecuentemente indicadas de la DIC en comparación con otros métodos y en lo que respecta a las nanopartículas plasmónicas son: no se requiere tinción de muestras, no hay efectos de Halo, profundidad de campo superficial y alta resolución lateral3. El DIC tiene fortalezas adicionales que son valiosas para la investigación de nanopartículas plasmónicas. En primer lugar, dos campos de polarización inherentes y ortogonales están presentes, y se pueden medir simultáneamente para fines de espectroscopía2. En segundo lugar, la señal depolarizada de las nanopartículas no se captura en la imagen final2, que puede ser una causa de grave preocupación en las mediciones de espectroscopía de campo oscuro.
El propósito de este artículo es proporcionar una metodología clara para la utilización de microscopía de Nomarski de luz transmitida para realizar espectroscopía en nanopartículas plasmónicas. Aunque la DIC es una técnica poderosa que se puede aplicar a materiales muy diversos, también es una técnica que requiere una gran habilidad y comprensión para operarla correctamente cuando se imaginan nanopartículas. La microscopía de la transmisión Nomarski con base en transmisiones tiene un camino ligero complejo1 que solo se revisará brevemente aquí. El tren óptico de DIC se visualiza en la figura 1. La luz se transmite a través del microscopio, primero se pasa a través de un polarizador y un prisma de Nomarski que divide el haz antes de ser centrado por el condensador en el plano de la muestra. Después de pasar por el objetivo, la luz se encuentra con un Haz que combina el prisma Nomarski y un analizador antes de salir al detector. Los dos polarizadores y prismas de Nomarski son críticos para la formación de la imagen de DIC y son responsables de producir los dos campos de polarización ortogonal1de Dic. Para el lector interesado en saber más sobre los principios de trabajo y la trayectoria óptica de los microscopios de Nomarski DIC, o las diferencias entre Nomarski DIC y otros estilos de DIC, por favor refiérase a otras cuentas bien escritas sobre estos temas1, 4 , 5 , 6 , 7.
Es igualmente importante entender la naturaleza básica de las nanopartículas plasmónicas antes de intentar realizar espectroscopía en ellas, ya sea con Nomarski DIC, campo oscuro, o cualquier otra técnica de microscopía. En el campo de los plasmónicos, las nanopartículas se definen como partículas con dimensiones en la escala de 10-100 nm8,9. Las nanopartículas pueden adoptar muchas formas (por ejemplo, esferas, varillas, estrellas, mancuernas, etc.), y la mayoría de sus propiedades importantes surgen de las interacciones con la luz en el rango infrarrojo ultravioleta-visible-cercano del espectro electromagnético. El término "plasmónico" no se restringe a las nanopartículas10; sin embargo, cuando se discuten las nanopartículas, se utiliza en referencia a la resonancia de Plasmon superficial localizada (LSPR). LSPR es un fenómeno en el que los electrones de conducción en una nanopartícula oscilan debido a una interacción Coulombic con la radiación electromagnética de una banda de frecuencias8muy específica y relativamente estrecha. A estas mismas frecuencias, las nanopartículas plasmónicas exhiben una mayor absorción y dispersión de la luz, haciéndolos observables con microscopía óptica. En muchos casos, se prefiere observar las nanopartículas mientras se colocan filtros de paso de banda antes del condensador2, para mejorar el contraste de imagen y para eliminar la luz que no induce el efecto LSPR. El uso de filtros también hace posible realizar experimentos de espectroscopía de partículas individuales.
El comportamiento óptico relacionado con LSPR depende en gran medida del tamaño y la forma de las nanopartículas, y se puede investigar con muchas técnicas de microscopía óptica. Sin embargo, con el fin de descifrar la información de orientación de las nanopartículas plasmónicas con una forma anisotrópico (es decir, no esférica), es necesario utilizar la polarización del campo de luz. Al rotar cuidadosamente el campo de polarización o el sustrato de la muestra en pequeños incrementos, es posible monitorear las propiedades espectroscópicas dependientes de la orientación de las nanopartículas individuales. La rotación y la polarización también pueden ayudar a determinar si una característica espectral se debe a una oscilación de orden dipolares o superior de los electrones superficiales de la nanopartícula. Sin embargo, en el caso de nanopartículas isotrópicas (es decir, esféricas), el perfil espectral permanece esencialmente sin cambios al rotar la muestra bajo luz polarizada.
Cuando se ve a través de un microscopio DIC (figura 2), las nanopartículas tienen un disco aireado con un aspecto blanco y negro fundido a la sombra contra un fondo gris. Las nanopartículas esféricas mantendrán esta apariencia bajo rotación y con el cambio de filtros de paso de banda; sin embargo, las partículas se desvanecerán gradualmente de la vista a medida que la longitud de onda central del filtro se separa más de la única longitud de onda LSPR de la esfera11. La aparición de nanorods puede cambiar drásticamente a medida que se giran2. Los nanorods tienen dos bandas LSPR con comportamiento dipolares, cuya ubicación se basa en las dimensiones físicas de los nanorods. Cuando el eje longitudinal de un nanorod está orientado paralelo a uno de los campos de polarización DIC, el disco aireado aparecerá todo blanco o negro Si se visualiza con un filtro de paso de banda asociado con esa longitud de onda LSPR. Después de rotar la muestra 90 °, tomará el color opuesto. Alternativamente, dado que el eje transversal de un nanorod es perpendicular al eje longitudinal, la varilla tomará el color opuesto al cambiar entre filtros que coincidan con las longitudes de onda LSPR para los dos ejes. En otras orientaciones y configuraciones de filtro, las nanorods aparecerán más como esferas, presentando una variedad de patrones de disco aireados de sombra. Para nanorods con un eje transversal &lt; 25 nm, puede ser difícil detectar la señal en la longitud de onda de LSPR utilizando la microscopía DIC.
Para realizar la espectroscopía de una sola partícula, es importante utilizar los componentes ópticos correctos y alinearlos correctamente. Se debe utilizar un objetivo capaz de microscopía DIC. Para experimentos de partículas individuales, los objetivos de aceite de 80x o 100x son ideales. Los prismas de Nomarski DIC normalmente vienen en tres variedades: estándar, alto contraste y alta resolución. El tipo ideal depende altamente del propósito del experimento y del tamaño de las nanopartículas. Los prismas estándar están bien para muchos experimentos; pero cuando se trabaja con nanopartículas más pequeñas (&lt; 50 nm), los prismas de alto contraste pueden ser beneficiosos, ya que el contraste de partículas disminuye a medida que las partículas disminuyen en el tamaño11. El ajuste del contraste DIC se consigue girando un polarizador o traduciendo uno de los prismas DIC, dependiendo de la marca del microscopio o del modelo6.
Después de configurar la iluminación de Kohler y los ajustes del polarizador, es fundamental no reajustar estos ajustes mientras se recopilan datos de espectroscopía. Además, se debe mantener una señal de fondo promedio constante en todo momento durante la recopilación de datos, incluso cuando se cambia entre los filtros y los ajustes de ángulo. El valor real de fondo ideal depende del rango dinámico de la cámara científica, pero en general, el fondo debe estar en el rango de 15% – 40% del nivel de detección máximo de la cámara. Esto reduce la probabilidad de saturar el sensor de la cámara al tiempo que permite un contraste de partículas óptimo. Para recopilar datos de espectroscopía, es necesario trabajar con una cámara científica que Capture imágenes en blanco y negro, en contraposición a una cámara a color.
La preparación de muestras es otro aspecto crítico de las nanopartículas plasmónicas por imágenes. Es imperativo que los operadores de la microscopía DIC tengan una comprensión de las propiedades ópticas de la muestra y del sustrato de la muestra. El cristal del microscopio "precaseados" no está suficientemente preparado para las nanopartículas de imagen, y debe volver a limpiarse correctamente antes de la deposición de la muestra para garantizar la observación sin obstrucciones de la muestra. Muchos protocolos de limpieza para las diapositivas de microscopio han sido documentados previamente12, pero no es un paso que se divulga normalmente en estudios experimentales.
Finalmente, los métodos de análisis de datos son el componente final de la espectroscopía de partículas individuales. Se deben medir las intensidades máximas y mínimas para cada nanopartícula, así como la media de fondo local. Las partículas de interés deben estar ubicadas en áreas sin residuos de fondo, defectos de sustrato o iluminación irregular. Un método para determinar el perfil espectral de una nanopartícula es calculando el contraste de las partículas en cada longitud de onda, utilizando la ecuación inferior a11,13,14,15:
<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq1.jpg">
Alternativamente, el espectro de una sola partícula se puede dividir en sus componentes individuales de señal máxima y mínima, que representan los dos campos de polarización de DIC, mostrando así los dos espectros dependientes direccionalmente que se recogen simultáneamente, a través de las dos ecuaciones:
<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq2.jpg">
<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq3.jpg">

<table><tbody><tr><td>Contrad 70</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>1002</td><td>Para la limpieza del vidrio del microscopio, disponible a través de muchos proveedores de productos químicos</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A962-4</td><td>Para la limpieza y el almacenamiento del vidrio del microscopio</td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio para microscopio</td><td>Ted Pella</td><td>260148</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio para microscopio</td><td>Ted Pella</td><td>26007</td><td></td></tr><tr><td>Nanovarillas de oro</td><td>Nanopartz</td><td>DIAM-SPR-25-650</td><td></td></tr><tr><td>Nanoesferas de oro (80 nm)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>742023-25ML</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>N/A</td><td>Software gratuito disponible para el análisis de datos de NIJ</td></tr><tr><td>Esmalte de uñas</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Nikon Ti-E</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Gas nitrógeno</td><td>Airgas</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ORCA Flash 4.0 V2+ cámara digital sCMOS</td><td>Hamamatsu</td><td>77054098</td><td></td></tr><tr><td>Bolígrafo de escritura</td><td>Amazon</td><td>N/A</td><td>Muchas opciones disponibles en línea por menos de $ 10. No es necesario comprar una versión cara.</td></tr><tr>Agua <td></td><td></td><td>ultrapura</td><td>18 megaohmios</td></tr></tbody></table>

realización de espectroscopía en nanopartículas plasmónicas con microscopía de contraste de interferencia diferencial de tipo nomarski basado en la transmisión

Performing Spectroscopy on Plasmonic Nanoparticles with Transmission-Based Nomarski-Type Differential Interference Contrast Microscopy

La microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) es una potente herramienta de imagen que se emplea con mayor frecuencia para objetos de microescala de imagen utilizando luz de rango visible. El propósito de este protocolo es detallar un método probado para preparar muestras de nanopartículas plasmónicas y realizar espectroscopía de partícula única en ellas con microscopía DIC. Varios pasos importantes deben seguirse cuidadosamente para realizar experimentos de espectroscopía repetible. Primero, los hitos pueden ser grabados en el sustrato de la muestra, que ayuda a localizar la superficie de la muestra y en el seguimiento de la región de interés durante los experimentos. A continuación, el sustrato debe limpiarse adecuadamente de escombros y contaminantes que de otro modo pueden obstaculizar u oscurecer el examen de la muestra. Una vez que una muestra se prepara correctamente, la trayectoria óptica del microscopio debe alinearse, utilizando Kohler Illumination. Con un microscopio DIC de estilo Nomarski estándar, la rotación de la muestra puede ser necesaria, especialmente cuando las nanopartículas plasmónicas exhiben propiedades ópticas dependientes de la orientación. Debido a que la microscopía DIC tiene dos campos de polarización ortogonal inherentes, el patrón de contraste DIC dependiente de la longitud de onda revela la orientación de las nanopartículas plasmónicas en forma de varilla. Finalmente, la adquisición de datos y los análisis de datos deben realizarse cuidadosamente. Es común representar datos de espectroscopía basada en DIC como un valor de contraste, pero también es posible presentarlo como datos de intensidad. En esta demostración de la DIC para la espectroscopía de una sola partícula, el foco se centra en las nanopartículas de oro esféricas y en forma de varilla.

Cuando se trabaja con muestras que son lo suficientemente grandes como para ser vistos a simple vista, no se requiere normalmente colocar puntos de referencia en el sustrato de vidrio. Sin embargo, cuando se trabaja con nanomateriales o cuando se requiere la rotación de la muestra, los puntos de referencia pueden proporcionar un método fácil para ubicar, distinguir y rastrear la orientación de la muestra. Aunque se pueden utilizar técnicas más sofisticadas para dejar puntos de referencia ...

El objetivo de este protocolo es detallar un enfoque comprobado para la preparación de muestras de nanopartículas plasmónicas y para realizar espectroscopía de partícula única en ellas con microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC).

Realización de espectroscopía en nanopartículas Plasmónicas con microscopía de contraste de interferencia diferencial de tipo Nomarski basado en la transmisión

Differential interference contrast (DIC) microscopy is a powerful imaging tool that is most commonly employed for imaging microscale objects using ...

La microscopía DIC es superior al campo oscuro en nanopartículas plasmónicas de imagen en entornos complejos. Sin embargo, DIC también requiere un mayor conocimiento y habilidad para obtener resultados reproducibles. La microscopía DIC proporciona alta resolución lateral y poca profundidad de campo.Ambos rasgos son extremadamente importantes al monitorear nanopartículas dentro de las células o en entornos complejos. Para comenzar, utilice un lápiz garabato para colocar una marca de arañazos poco profunda y corta en el centro de cada tapa de vidrio y, a continuación, limpie el vidrio como se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, utilice una micropipeta para eliminar 100 microlitros de una solución de nanopartícula de oro de 05 miligramos por mililitro de su contenedor de almacenamiento original, y expulse la solución en un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros.Centrifugar la muestra durante 10 minutos a 6.000 veces la gravedad. Cuando haya terminado, retire el sobrenadante con una micropipeta para eliminar el exceso de surfactante de la solución de nanopartículas. A continuación, añada 100 microlitros de agua ultrapura al tubo centrífugo.Vórtice brevemente la muestra para romper el pellet, y luego sonicarla durante 20 minutos inmediatamente después para resuspender completamente los agregados de nanopartículas. Usando una micropipeta, lanzar seis microlitros de solución de nanopartículas en el cubreobjetos de vidrio limpio y rayado. A continuación, voltee cuidadosamente el cubreobjetos y colóquelo encima de una segunda pieza más grande de vidrio del microscopio.La gota debe extenderse rápidamente uniformemente entre los dos trozos de vidrio. Tenga cuidado de evitar que las burbujas de aire queden atrapadas entre los dos trozos de vidrio. Utilice una línea estrecha de esmalte de uñas para sellar los bordes del cubreobjetos para evitar la evaporación del líquido.Coloque la muestra en la etapa del microscopio y alinee el objetivo y el condensador del microscopio. Ajuste el enfoque para encontrar el plano focal con la muestra y localice la marca de rayado creada anteriormente. Concéntrese en él y ajuste el enfoque hasta que las nanopartículas se vean.Para determinar la colocación precisa del condensador, utilice el método de iluminación Kohler comenzando con el objetivo 20x y luego pasando a aumentos altos como 80 o 100x. A continuación, seleccione una región de interés dentro de la muestra para obtener imágenes. Centre la región en el campo de visión de la cámara y ajuste el enfoque según sea necesario.Si el microscopio tiene el diseño de Senarmont, comience con el polarizador establecido cerca de la máxima extinción de fondo y gire gradualmente el polarizador hacia la disminución de la extinción de fondo. La intensidad del fondo aumentará gradualmente. El entorno ideal se logra cuando las nanopartículas alcanzan su mayor diferencia de intensidad en comparación con la media de fondo local.Para las nanopartículas plasmónicas, el mayor contraste se logra típicamente con un fondo relativamente oscuro en o cerca de la extinción de fondo máxima. Apague la iluminación de la habitación para evitar que la iluminación perdida interactúe con el proceso. Poner en su lugar un ancho completo de 10 nanómetros a medio máximo de filtro de paso de banda con su longitud de onda central co-ubicada con la longitud de onda de resonancia de plasmon de superficie localizada principal con el fin de ver la región de interés.A continuación, ajuste la intensidad o el tiempo de exposición de la lámpara hasta que el nivel de fondo esté en el 5% al 40% del nivel de capacidad máxima de la cámara. Ningún objeto dentro de la región de interés debe exhibir intensidades de señal que excedan el 90% del nivel de intensidad máxima de la cámara. I imagen de la muestra con una serie de filtros de paso de banda que cada uno tiene un ancho completo a medio-máximo de 10 nanómetros, y que en su conjunto permiten la creación de imágenes en todo el rango de longitud de onda de interés.Asegúrese de que la intensidad de fondo en las imágenes se mantenga dentro del 5% de la una de la otra ajustando el tiempo de exposición y no la potencia de la lámpara. Después de cambiar de filtro, vuelva a enfocar la muestra antes de capturar imágenes. Guarde las imágenes como archivos TIFF sin comprimir y/o en el formato de archivo nativo del software para conservar toda la información relevante.Para comenzar el análisis, abra la imagen con ImageJ. Utilice la herramienta rectángulo para dibujar un rectángulo alrededor de la región principal de interés. A continuación, en la barra de herramientas, seleccione la imagen, vaya al zoom y seleccione la selección.La ventana de imágenes ampliará el área seleccionada. A continuación, seleccione la imagen, vaya a ajustar y seleccione brillo/contraste. Para mejorar la vista de la región de muestra, ajuste el mínimo, el máximo, el brillo y el contraste de la imagen.Estos ajustes no alteran los datos científicos, sino que simplemente permiten una mejor visibilidad de la región de la muestra. Ahora, utilice la herramienta rectángulo de nuevo y dibuje un cuadro alrededor de la primera nanopartícula que se va a medir. La caja debe ser sólo un poco más grande que el disco ventilado de la nanopartícula.Una vez seleccionado, vaya a analizar y seleccione medir. Aparece una nueva ventana que informa de las intensidades mínimas, máximas y medias de los píxeles situados dentro del cuadro seleccionado. Conservando el tamaño original del cuadro, arrastre el cuadro a un área inmediatamente adyacente a la partícula donde el contraste de fondo es relativamente uniforme y no hay partículas ni contaminantes presentes.Utilice de nuevo la herramienta de medida para determinar la intensidad media del área de fondo. Repita este proceso para cada partícula en todas las imágenes de la serie. A continuación, exporte los datos a una hoja de cálculo para calcular el contraste o la intensidad de cada partícula en todas las longitudes de onda y ángulos.Introduzca la siguiente ecuación para calcular el contraste de cada partícula. Por último, grafica el perfil espectral en una posición de nanopartícula determinada trazando datos con la longitud de onda a lo largo del eje X y el contraste o intensidad a lo largo del eje Y. Para determinar el ajuste óptimo de la imagen, estas nanoesferas de oro fueron imágenes en varios ajustes del polarizador.En cero grados, las partículas aparecen en su mayoría blancas con una franja oscura que corre a través de su sección media. Esto es indicativo de polarización cruzada para muestras de nanoesfera. Cuando el polarizador se gira a diferentes ángulos, las partículas proyectan sombras oscuras hacia una esquina.Sin embargo, los valores de contraste de partículas cambian drásticamente. Para esta muestra, el ajuste de imagen óptimo es con un desplazamiento polarizador de 10 grados. Aquí la longitud de onda se traza contra el contraste de las nanoesferas de oro.Cada punto de datos representa un promedio de 20 nanoesferas para cada diámetro de partícula. El contraste máximo de cada partícula cambia ligeramente dependiendo de su tamaño. La intensidad y rotación es aún más importante con formas anisotrópicas como esta nanorod de oro.Aquí la longitud de onda se traza contra la intensidad en dos configuraciones de polarizador diferentes. En cada caso, la intensidad del lado brillante es mucho más fuerte que la del lado oscuro. El perfil de intensidad de una sola nanorod de oro en su longitud de onda de resonancia de plasmón de superficie localizada durante la rotación de la etapa muestra una gran diferencia de intensidad entre los lados oscuros y brillantes a medida que la muestra gira a través de 180 grados.La toma de imágenes de muestras es extremadamente importante. Requiere diligencia y paciencia por parte del microscopista. Si está realizando un experimento que requiere reinventar la muestra durante una serie de días, los puntos de referencia, como las marcas de arañazos, son fundamentales para reubicar la región de interés.La microscopía DIC está creciendo en interés por los investigadores que estudian nanopartículas, especialmente en entornos dinámicos y celulares. Porque DIC ofrece una resolución espacial óptima, especialmente en entornos de muestreo complejos.

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Investigación

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Chemistry

Química

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Realización de espectroscopía en nanopartículas Plasmónicas con microscopía de contraste de interferencia diferencial de tipo Nomarski basado en la transmisión

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