Name: Procedimiento Operativo Estándar para la Vigilancia de Lyssavirus de la Población Bat en Taiwán (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: Aprenda el procedimiento operativo estándar para la vigilancia de Lyssavirus en poblaciones de murciélagos de Taiwán. Este protocolo detalla la recolección de muestras, pruebas diagnósticas y análisis de datos para investigadores en virología.

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Agradecemos a Tien-Cheng Li, Yi-Tang Lin, Chia-Jung Tsai y Ya-Lan Li por su ayuda durante este estudio. Este estudio fue apoyado por la concesión No. 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) de la Oficina de Inspección y Cuarentena de Sanidad Animal y Vegetal, Consejo de Agricultura, Yuan Ejecutivo, Taiwán.

1. Precauciones de seguridad al manipular lissavirus
<ol><li>Asegúrese de que todos los trabajadores de laboratorio que manipulan muestras de murciélagos reciban profilaxis antirrábica17antes de la exposición. Controlar los niveles de anticuerpos de rabia de los trabajadores de antemano y volver a examinarlos cada 6 meses17. La vacunación contra la rabia de seguimiento es necesaria para aquellos cuyos niveles de anticuerpos son inferiores a 0,5 UI/ml17.</li>
	<li>Dependiendo de las regulaciones de seguridad de la biotecnología del país donde se encuentra el laboratorio, asegúrese de que los siguientes procedimientos se realizan en laboratorios adecuados de nivel de bioseguridad (por ejemplo, laboratorios BSL-2 en Taiwán y laboratorios BSL-3 en Australia), y que los trabajadores están actualmente calificados y usan el equipo de protección personal adecuado18. NOTA: La vacunación contra la rabia proporciona poca o ninguna protección contra los lissavirus pertenecientes a los filogrupos II y III18. Se debe informar a los trabajadores de que se han identificado varios patógenos zoonóticos en los murciélagos19 y deben manipular muestras en condiciones de laboratorio adecuadas a nivel de bioseguridad con el equipo de protección personal adecuado.</li>
</ol>2. Recogida de muestras
<ol><li>Utilice murciélagos o cadáveres débiles o enfermos encontrados. NOTA: Los murciélagos débiles o enfermos se entregan a la Sociedad de Conservación de Murciélagos de Taipei para la atención veterinaria o la investigación, mientras que los cadáveres se presentan directamente al Instituto de Investigación de Sanidad Animal. No se han eutanasiado murciélagos sanos en este programa de vigilancia.</li>
	<li>Hacer que un ecologista de murciélagos identifique las especies de murciélagos a través de las características morfológicas20.</li>
	<li>Realizar la codificación de barras de ADN de la especie de murciélago cuando se diagnostica el lissavirus positivo, utilizando los procedimientos publicados previamente21.</li>
	<li>Envíe una hoja informativa de cada canal de murciélago (sitio de recolección, especies, signos clínicos, etc.).</li>
</ol>3. Necropsia de especímenes de murciélagos
<ol><li>Preparar materiales.<ol>
<li>Prepare una tabla de disección limpia y coloque una almohadilla absorbente estéril para la necropsia.</li>
		<li>Preparar tubos de recolección para recoger órganos de murciélagos.</li>
		<li>Prepare pinzas y bisturíes desechables para la necropsia. Cambia las herramientas entre la necropsia de cada murciélago. Prepare las bolas de algodón humedecidas con 70% de etanol para limpiar pinzas y bisturíes durante el muestreo.</li>
		<li>Prepare dos diapositivas de microscopio para el FAT. Recoger especímenes frescos y fijarlos en solución de formalina para el examen histopatológico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Examine todos los orificios externos antes de la necropsia. Fotografíe las características externas del murciélago, especialmente la cabeza, las orejas y las alas, para la diferenciación de especies.</li>
	<li>Recoger una muestra de hisopo oral. Coloque el murciélago en la recumbencia ventral en el tablero y fije la cabeza del murciélago con pinzas. Cortar la piel a lo largo de la línea media de la calvaria con un bisturí y tirar de la piel hacia los lados laterales. Cortar el cráneo a lo largo de la línea media de la calvaria con un bisturí y abrirlo con pinzas para exponer el tejido cerebral.</li>
	<li>Retire el tejido cerebral del cráneo y colóquelo en un depresor de lengua estéril y haga manchas de impresión del tejido cerebral (ver paso 4.2). Recoger un pequeño pedazo de tejido cerebral fresco y fijarlo en formalina para el examen histopatológico. Contener el tejido cerebral restante en un tubo para la extracción de ácido nucleico.</li>
	<li>Limpie las pinzas y el bisturí con bolas de algodón humedecidas con 70% de etanol para eliminar los tejidos retenidos entre la recolección de muestras.</li>
	<li>Coloque el murciélago sobre la tabla en la recumbencia dorsal y fíjelo en la tabla con agujas a ambos lados de la axila y el talón de cola.</li>
	<li>Incise la piel a lo largo de la línea media del cuerpo de la mandíbula al ano. Levante y separe la piel y los tejidos musculares subyacentes con pinzas. Recoger las glándulas salivales, que están cerca del hueso mandibular.</li>
	<li>Levante el esternón ligeramente con pinzas y corte el esternón y la pared abdominal a lo largo de la línea media con un bisturí. Corta las clavículas con un bisturí. Fije las costillas izquierda y derecha a la placa con agujas para abrir la cavidad torácica.</li>
	<li>Registre las lesiones graves y el grado de cambio post mortem.</li>
	<li>Retire los tejidos viscerales (es decir, corazón, pulmones, hígado, riñones, intestinos) de la canal utilizando pinzas y un bisturí. Recoger los especímenes viscerales según sea necesario para futuras investigaciones. NOTA: Se recomienda la recopilación de muestras duplicadas. Uno debe ser recogido para el diagnóstico molecular, y el otro debe ser congelado a -80 oC con o sin medio de transporte viral para el cultivo viral22.</li>
</ol>4. Prueba directa de anticuerpos fluorescentes (FAT)
<ol><li>Haga manchas de impresión del tejido cerebral para el FAT. Realice el FAT como se describió anteriormente18,23 con las siguientes modificaciones.</li>
	<li>Separe suavemente el tejido cerebral del tejido nervioso conectado con pinzas y transfiera el tejido cerebral a un depresor de lengua estéril. Cortar la sección transversal del cerebro, incluyendo el tallo cerebral y el cerebelo18,23. Haga manchas de impresión del tejido cerebral tocando ligeramente la superficie cortada del tejido cerebral, y presione la diapositiva sobre el tejido de la lente para eliminar el exceso de tejido.</li>
	<li>Fijar las diapositivas con acetona a -20 oC durante 30 minutos. Seque las diapositivas probadas y los controles positivos y negativos antes de manchar con conjugado.</li>
	<li>El uso de cada uno de los dos anticuerpos antirrábico conjugados por el FITC disponibles comercialmente para la tinción del antígeno del lissavirus es muy recomendable23. Determinar la concentración de trabajo del conjugado comercial antes de la primera tinción. Suelte los conjugados diluidos a través de un filtro de jeringa de 0,45 m sobre las diapositivas e incubar las diapositivas a 37 oC durante 30 minutos dentro de una cámara húmeda.</li>
	<li>Escurra el exceso de conjugado de los portaobjetos y lave los portaobjetos con solución salina con fosfato (PBS) después de la incubación.</li>
	<li>Suelte una pequeña cantidad de 10% de glicerol en las diapositivas y cubra con diapositivas de cubierta.</li>
	<li>Examine las diapositivas con un microscopio fluorescente.</li>
</ol>5. Extracción de ácido nucleico
<ol><li>Añadir el volumen adecuado de MEM-10 (medio esencial mínimo complementado con 10% de suero bovino fetal) al tejido cerebral (10% p/v).</li>
	<li>Homogeneizar el tejido cerebral con una perla de acero de 5 mm en un instrumento homogeneizador y centrifugar a 825 x g durante 10 min.</li>
	<li>Extraiga el ácido nucleico, cuyo volumen final es de 50 l, dentro de los 200 l del sobrenadante utilizando el kit de extracción total de ácido nucleico disponible comercialmente con instrumento.</li>
</ol>6. RT-PCR y análisis filogenético
NOTA: Se han publicado varios conjuntos de imprimación para detectar todos los lissavirus conocidos o los lissavirus específicos. El protocolo descrito aquí es un ejemplo que nuestro laboratorio utiliza y puede no adaptarse a todas las necesidades experimentales. Seleccione imprimaciones adecuadas de acuerdo con las necesidades del laboratorio.
<ol><li>Preparar el reactivo RT-PCR de un solo paso de la siguiente manera: añadir 5 l de ácido nucleico extraído a la mezcla de reacción que contenga 2,5 ml de tampón de reacción de 10x, 0,5 l de imprimaciones delanteras y inversas (10 m de cada una), 4 ml de dNTP de 1,25 mM, 0,3 ml de inhibidor de la rnalosa (40 U/L) , 0,3 l de transcriptasa inversa (10 U/L), 0,4 ml de adn polimerasa (5 U/L) y 11,5 ml de agua tratada con DEPC. NOTA: El conjunto de imprimación utilizado en este protocolo es JW12 (5'-ATGTAACACCYCTACAATG-3') y N165-146 (5'-GCAGGGTAYTTRTACTCATA-3')24. Modificar la preparación de los reactivos y las condiciones de ciclo de acuerdo con los conjuntos de imprimación utilizados.</li>
	<li>Realizar el ciclismo en las siguientes condiciones: incubación a 42oC durante 40 min; desnaturalización inicial a 94oC durante 10 min; 35 ciclos de 94oC para 30s, 55oC para 30s y 72oC para 30s; y, por último, una nueva extensión a 72oC durante 10 min.</li>
	<li>Utilice otros o más conjuntos de imprimación para aumentar la sensibilidad de diagnóstico.<ol>
<li>Utilice N113F (5'-GTAGGATGCTATATGGG-3') y N304R (5'-TTGACGAAGATCTTGCTCAT-3')25,26 para preparar el reactivo RT-PCR de un solo paso de la siguiente manera: añadir 5 l de ácido nucleico extraído a una mezcla de reacción que contenga 5 ol de 10x tampón, 5 l de imprimaciones hacia adelante y hacia atrás (4 m de cada una), 5 ml de 1,25 mM de dNTP, 0,5 ml de inhibidor de la RNase (40 U/L), 0,2 ml de transcriptasa inversa (10 U/L), 1 l de adnpoliasa (5 U/L) y 23,3 ml de agua tratada con DEPC.</li>
		<li>Realizar el ciclismo en las siguientes condiciones: incubación a 42oC durante 40 min; desnaturalización inicial a 95oC durante 5 min; 35 ciclos de 95oC durante 1 min, 55oC durante 1 min y 20 s, y 72oC durante 1 min; y, por último, una nueva extensión a 72oC durante 10 min. NOTA: Dependiendo de las necesidades de laboratorio, elija imprimaciones adecuadas para el diagnóstico. N113F fue diseñado originalmente para la amplificación del virus de la rabia, pero puede no funcionar bien para otros lissavirus. El conjunto de N113F y N304R funciona bien para el virus de la rabia (variante del tejón de hurón de Taiwán) y el lissavirus del murciélago de Taiwán. Será más fácil obtener secuencias enteras de nucleoproteínas utilizando el conjunto de imprimaciones JW12 y N304R si el lissavirus es amplificado por los dos conjuntos de imprimación anteriores.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analice el producto PCR en electroforesis de gel de agarosa al 2% y visualice mediante iluminación uv.uv light.</li>
	<li>Secuenciar el producto PCR mediante el servicio de secuenciación comercial.</li>
	<li>Introduzca o cargue la secuencia en la página web de la Herramienta de Búsqueda básica de alineación local (BLAST) de Nucleotide. Seleccione la base de datos "otros (nr etc.)" e introduzca el organismo como Lyssavirus. Seleccione el algoritmo MegaBlast y ejecute BLAST.</li>
</ol>7. Aislamiento de virus
NOTA: Realice el aislamiento de virus cuando 1) el FAT o 2) el RT-PCR indica positividad.
<ol><li>Homogeneizar la muestra cerebral en una suspensión del 10% (p/v) en MEM-10. Centrífuga a 825 x g durante 10 min.</li>
	<li>Inocular 200 l de sobrenadante con una suspensión de 3 x 106 MNA (neuroblastoma de ratón) en 1 ml de MEM-10 para 1 h a 37 oC con 1% de CO2. Transfiera la suspensión de células homogenatas cerebrales a un matraz de 25 cm2 y añada 6 ml de MEM-10.</li>
	<li>Cultivar 1 ml de la suspensión de células homogeneizadas cerebrales en un portaobjetos de vidrio recubierto de teflón de 4 pozos con 6 mm de diámetro al mismo tiempo.</li>
	<li>Después de 3-4 días de incubación a37 oC con 1% de CO 2, fije las células en la diapositiva de 4 pozos con 100% de acetona (v/v).</li>
	<li>Mancha los portaobjetos con dos anticuerpos antirrábico conjugados por el FITC siguiendo los pasos 4.4–4.7. Las células se infectan cuando se investigan las inclusiones intracitoplasmáticas. Registre el porcentaje de células infectadas.</li>
	<li>Realice la tripinización y la subcultura del cultivo celular inoculado cuando las diapositivas se tiñen como negativas:<ol>
<li>Retire el medio y enjuague el matraz con 5 ml de PBS.</li>
		<li>Añadir 1 ml de trippsina al matraz y golpear firmemente la parte inferior del matraz.</li>
		<li>Agregue 6 mL de MEM-10 y resuspenda las celdas.</li>
		<li>Coloque la suspensión celular en un matraz de tejido nuevo (6 ml) y en un portaobjetos de 4 pozos (1 ml).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Repita los pasos 7.4–7.6 hasta que se alcance la infectividad del 100%.</li>
	<li>Recoger el sobrenadante después de 24 h de incubación.</li>
</ol>

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<li>Robardet, E., Picard-Meyer, E., Andrieu, S., Servat, A., Cliquet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+interlaboratory+trials+on+rabies+diagnosis%3A+an+overview+of+results+and+variation+in+reference+diagnosis+techniques+%28fluorescent+antibody+test%2C+rabies+tissue+culture+infection+test%2C+mouse+inoculation+test%29+and+molecular+biology+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">International interlaboratory trials on rabies diagnosis: an overview of results and variation in reference diagnosis techniques (fluorescent antibody test, rabies tissue culture infection test, mouse inoculation test) and molecular biology techniques.</a> Journal of Virological Methods. 177 (1), 15-25 (2011).</li>
</ol>

No se declaran conflictos de intereses.

Este procedimiento operativo estándar de laboratorio (SOP) proporciona un proceso en serie para probar muestras de murciélagos para detectar la presencia de antígenos de lissavirus en Taiwán. Los pasos clave incluyen el empleo de FAT y RT-PCR. La selección de muestras adecuadas y el aislamiento exitoso del virus también son importantes. Además, se llevó a cabo algunos problemas de resolución durante el monitoreo de los lyssavirus de murciélagos. La principal diferencia fueron los animales objetivo. Inicialmente (2008-200...

Los virus del género Lyssavirus son patógenos zoonóticos. Hay al menos siete especies de lissavirus asociadas con casos humanos1. Además de las 16especies de este género 1,2,3, Taiwan bat lyssavirus (TWBLV)4 y Kotalahti bat lyssavirus5 han sido identificados recientemente en murciélagos, pero sus estados taxonómicos aún no han sido identificados en murciélagos, pero sus estados taxonómicos aún no han sido identificados en murciélagos, pero sus estados taxonómicos aún no han determinarse.
Los murciélagos son los huéspedes naturales de la mayoría de los lyssavirus, con la excepción de Mokola lyssavirus e Ikoma lyssavirus, que aún no han sido identificados en ningún murciélago1,2,3,6. La información sobre los lissavirus en los murciélagos asiáticos sigue siendo limitada. Se han notificado dos lissavirus no caracterizados en murciélagos asiáticos (uno en la India y el otro en Tailandia)7,8. Un caso de rabia humana asociado con una mordedura de murciélago en China se notificó en 2002, pero el diagnóstico se hizo sólo por observación clínica9. En Asia Central, Aravan lyssavirus fue identificado en el murciélago de orejas de ratón menor (Myotis blythi) en Kirguistán en 1991, y Khujand lyssavirus fue identificado en el murciélago bigote (Myotis mystacinus) en Tayikistán en 200110. En el sur de Asia, Gannoruwa murciélago lyssavirus fue identificado en el zorro volador indio (Pteropus medius) en Sri Lanka en 20153. En el Sudeste Asiático, varios estudios serológicos sobre murciélagos en Filipinas, Tailandia, Bangladesh, Camboya y Vietnam mostraron seroprevalencia variable11,12,13,14, 15. Aunque El irkut lyssavirus se identificó en el murciélago de nariz de tubo mayor (Murina leucogaster) en la provincia de Jilin, China en 201216, las especies exactas y lugares de lissavirus en las poblaciones de murciélagos de Asia oriental siguen siendo desconocidos.
Para evaluar la presencia de lissavirus en las poblaciones de murciélagos taiwaneses, se inició un programa de vigilancia que empleaba tanto FAT directo como RT-PCR. El lyssavirus del murciélago de Taiwán fue identificado en dos casos de la pipistrelle japonesa (Pipistrellus abramus)4 en 2016-2017. En el presente artículo, se introduce un procedimiento operativo estándar de laboratorio para la vigilancia del lissavirus de la población de murciélagos en Taiwán. El diagrama de flujo del diagnóstico de lissavirus murciélago en nuestro laboratorio se presenta en la Figura1.

<table><tbody><tr><td>2.5% Tripsina (10x)</td><td>Gibco</td><td>15090046</td><td>Tripsina</td></tr><tr><td>25 cm2 matraz</td><td>Greiner bio-one</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Honeywell</td><td>32201-1L</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa I</td><td>VWR Life Science</td><td>97062-250</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol</td><td>NIHON SHIYAKU REACTIVO</td><td>NS-32294</td><td></td></tr><tr><td>AMV Transcriptasa inversa</td><td>Promega</td><td>M5101</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico (100X)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>Cuchilla</td><td>Braun</td><td>BA215</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de quimioluminencia</td><td>TOP BIO CO.</td><td>MGIS-21-C2-1M</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de recogida</td><td>Qiagen</td><td></td> 990381 <td></td></tr><tr><td>Tubo de recogida</td><td>SSI</td><td>2341-SO</td><td></td></tr><tr><td>Corredera de cubierta</td><td>Muto Pure chemical Co., LTD.</td><td>24505</td><td></td></tr><tr><td>Analizador de ADN</td><td>Applied Biosystems</td><td>3700XL</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>FITC Globulina monoclonal antirrábica</td><td>Fujirebio Diagnostic Inc.</td><td>800-092</td><td>Anticuerpos antirrábicos conjugados por FITC: reactivo B</td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio con recubrimiento de teflón de cuatro pocillos</td> Sistema de electroforesis en gel <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>30-86H-WHITE</td> Major Science MJ-105-R <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1x)</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td>Incubadora de tripsina</td></tr><tr><td></td><td>Microscopio</td> invertido ASTEC <td>SCA-165DS</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>A2916801</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>LIGHT DIAGNOSTICS Reactivo de grasa antirrábica</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>5100</td><td>Anticuerpos antirrábicos conjugados con FITC: reactivo A</td></tr><tr><td>Instrumento MagNA Pure Compact</td><td>Roche</td><td>03731146001</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Pure Compact NA Kit de aislamiento 1</td><td>Roche</td><td>03730964001</td><td></td></tr><tr><td>MEM (10x)</td><td>Gibco</td><td>11430030</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>MEM NEAA (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>Solución vitamínica MEM</td><td>Gibco</td><td></td><td>11120052 MEM-10</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>1.06329.0500</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>Aguja</td><td>Terumo</td><td>NN*2332R9</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Medicago</td><td>09-8912-100</td><td></td></tr><tr><td>Síntesis de cebadores</td><td>Mission Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de la RNasina ribonucleasa</td><td>Promega</td><td>N2111</td><td></td></tr><tr><td>Servicio de secuenciación</td><td>Mission Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide</td><td>Thermo Scientific</td><td>AA00008032E00MNT10</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>Perlas de acero inoxidable</td><td>QIAGEN</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla absorbente estéril</td><td>3M</td><td>1604T-2</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa</td><td>Nalgene</td><td>171-0045</td><td></td></tr><tr><td>Polimerasa Taq</td><td>JMR Holdings</td><td>JMR-801</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Applied Biosystems</td><td>2720</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>QIAGEN</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Depresor lingual</td><td>HONJER CO., LTD.</td><td></td><td></td>122246</tr><tr><td>Pinza</td><td>Tennyson Instrumento médico en desarrollo CO., LTD.</td><td>A0601</td><td></td></tr><tr><td>Tartrato de tilosina</td><td>Sigma</td><td>T6271-10G</td><td>MEM-10</td></tr></tbody></table>

procedimiento operativo estándar para la vigilancia de lyssavirus de la población bat en taiwán

Standard Operating Procedure for Lyssavirus Surveillance of the Bat Population in Taiwan

Los virus del género Lyssavirus son patógenos zoonóticos, y al menos siete especies de lissavirus están asociadas con casos humanos. Debido a que los murciélagos son reservorios naturales de la mayoría de los lissavirus, se ha llevado a cabo en Taiwán un programa de vigilancia de los murciélagos de lissavirus para comprender la ecología de estos virus en los murciélagos. En este programa, organizaciones no gubernamentales de conservación de murciélagos y centros locales de control de enfermedades animales cooperaron para recoger murciélagos muertos o murciélagos que morían de debilidad o enfermedad. Los tejidos cerebrales de los murciélagos se obtuvieron a través de la necropsia y se sometieron a una prueba directa de anticuerpos fluorescentes (FAT) y a una reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) para la detección de antígenos de lissavirus y ácidos nucleicos. Para el FAT, se recomiendan al menos dos conjugados diferentes de diagnóstico de rabia. Para el RT-PCR, se utilizan dos conjuntos de imprimaciones (JW12/N165-146, N113F/N304R) para amplificar una secuencia parcial del gen del núcleo de glioproteína. Este programa de vigilancia monitorea los lissavirus y otros agentes zoonóticos en murciélagos. El lyssavirus del murciélago de Taiwán se encuentra en dos casos de la pipistrelle japonesa (Pipistrellus abramus) en 2016-2017. Estos hallazgos deben informar al público, a los profesionales de la salud y a los científicos de los riesgos potenciales de contactar murciélagos y otras especies silvestres.

De 2014 a mayo de 2017, se recogieron 332 cadáveres de murciélagos de 13 especies para su vigilancia. Dos dieron positivo. En el primer caso de murciélago, la impresión cerebral dio negativo usando el FAT con uno de los anticuerpos antirrábico conjugados por FITC comercial (Figura2), mientras que los RT-PCR que empleaban cada uno de los dos conjuntos de imprimación (JW12/N165-146, N113F/N304R) resultados positivos (Figura3). Se obtuvo una secuencia de 428 bp de ...

Este protocolo introduce un procedimiento operativo de laboratorio estándar para las pruebas de diagnóstico de antígenos de lissavirus en murciélagos en Taiwán.

Procedimiento Operativo Estándar para la Vigilancia de Lyssavirus de la Población Bat en Taiwán

Viruses within the genus Lyssavirus are zoonotic pathogens, and at least seven lyssavirus species are associated with human cases. Because bats are ...

El lyssavirus es un patógeno zoo-no-tic. Para evaluar la presencia de Lyssavirus en la población taiwanesa de murciélagos, iniciamos un programa de vigilancia. Y identificó con éxito cuatro Lyssavirus de 2016 a 2018.Este protocolo es una introducción paso a paso a la vigilancia de vi-al Lyssavirus en Taiwán. Esperamos que sea útil para las investigaciones que están interesadas en la vigilancia de vi-al Lyssavirus. Es importante conectar el símbolo de tac-keg correcto.Un murciélago muerto o moribundo es más adecuado que un murciélago vivo para la vigilancia del lyssavirus. Dependiendo de las regulaciones de biose seguro del país donde se encuentra el laboratorio;realizar los siguientes procedimientos en un laboratorio de nivel de biose seguro adecuado. Y asegúrese de que los investigadores están actualmente calificados y llevan el equipo de protección personal adecuado.Tras la recolección de murciélagos o cadáveres débiles o enfermos, pida a un ecologista de murciélagos que identifique la especie de murciélago por las características morfológicas del espécimen. Envíe una hoja de información al laboratorio, incluyendo el sitio de recolección, especies, signos clínicos y otros datos relevantes con cada muestra de murciélago. Antes de comenzar la necroscopia, examine todos los orificios externos y fotografíe las características externas de los murciélagos, especialmente la cabeza, las orejas y las alas para la diferenciación de las especies.Para recoger una muestra de hisopo oral, coloque el murciélago en la recumbencia ventral en una mesa de disección estéril y fije la cabeza con pinzas. Usa un bisturí para cortar la piel a lo largo de la línea media de la zona de la pantorrilla;y tira de la piel hacia los lados laterales, para hacer una incisión en el cráneo a lo largo de la línea media de la zona de la pantorrilla. Abre el cráneo con pinzas para exponer el tejido cerebral y usa las pinzas para separar suavemente el tejido cerebral del tejido nervioso conectado.Corta la sección transversal del cerebro, incluyendo el tronco cerebral y el cerebelo, y toca ligeramente la superficie cortada del tejido cerebral con diapositivas de vidrio para hacer impresiones de frotis. Presione la diapositiva sobre el tejido de la lente para eliminar el exceso de tejido y fijar las diapositivas de impresión de frotis en menos 20 grados celsius acetona durante 30 minutos. Luego prepara un pequeño pedazo de tejido cerebral fresco, en formalina, para el examen histopatológico.Y coloque el resto del tejido en emi-em 10 para la extracción de ácido nucleico. A continuación, incitar la piel desde el colector hasta el ano a lo largo de la línea media del cuerpo, y utilizar las pinzas para levantar y separar la piel y subrayar los tejidos musculares;para permitir la recolección de las glándulas salivales, situado cerca del hueso mandibular. Levantando ligeramente el esternón con las pinzas, usa el bisturí para cortar el esternón y la pared abdominal a lo largo de la línea media y corta las clavículas.Utilice agujas para fijar las jaulas torácicas izquierda y derecha a la mesa de disección, para abrir la cavidad torácica. Y registrar las legiones gruesas y el grado de cambio post mortem. Luego use las pinzas y el bisturí para extraer los tejidos viscerales según corresponda para el análisis descendente planeado.Para realizar una prueba de anticuerpos fluorescentes directos al final de la fijación, seque las diapositivas de impresión de frotis y seleccione al menos dos anticuerpos antirrábicos conjugados con fluorescencia para el análisis. Filtre un anticuerpo en cada diapositiva a través de un colador de 0,45 micrómetros. E incubar los toboganes durante 30 minutos a 37 grados centígrados en una cámara húmeda.Al final de la incubación, drenar el exceso de conjugado y lavar los portaobjetos con PBS. A continuación, utilice un pequeño volumen de 10% de glicerol para montar antideslizantes en las diapositivas e imagine las diapositivas mediante microscopía de fluorescencia. Cuando la prueba de anticuerpos fluorescentes o el análisis RT-PCR indiquen positividad, homogeneizar la muestra cerebral en la suspensión del 10% en emi-en 10 y sedimentar los tejidos fleu-rry por centrifugación.Inocular 200 microlitros de la super-nat-en con tres veces 10 a las 6a células de neuroblastoma de ratón y un mililitro de emi-en 10 durante una hora a 37 grados centígrados y 1%dióxido de carbono. Y transfiera la suspensión de células homogéneas del cerebro a un matraz cuadrado de 25 centímetros, que contiene seis mililitros de emi-en 10 fresco. A un mililitro de suspensión de células homogéneas del cerebro en un portaobjetos de vidrio recubierto de teflón de cuatro pozos, con un diámetro de seis milímetros y coloque la diapositiva a 37 grados centígrados y 1% de dióxido de carbono durante tres a cuatro días.Después de la fijación con 100%acetona, manche las diapositivas con los mismos dos anticuerpos antirrábicos conjugados con fluorescencia que se utilizan para la prueba de anticuerpos de fluorescencia. Y visualice las diapositivas por microscopía fluorescente para determinar el número de inclusiones intracida-plas-mic. Después de probar y sub-cultivar el cultivo celular inoculado de acuerdo con los protocolos estándar, devolver el cultivo en frío a la incubadora de cultivo celular durante otros tres a cuatro días con recuento repetido del número de células infectadas como se acaba de demostrar hasta que se alcanza una infectividad del 100%.De enero de 2014 a mayo de 2017, se recogieron 332 cadáveres de murciélagos de 13 especies para su vigilancia. En este análisis representativo de dos casos positivos de murciélagos, la impresión cerebral dio negativo utilizando la prueba de anticuerpos fluorescentes con uno de los anticuerpos antirrábicos conjugados comerciales, fit-sy, mientras que el RT-PCR empleando cada uno de los dos conjuntos de imprimación diferentes, produjo resultados positivos. La sujeción de la secuencia de cona expansión obtenida a la consulta explosiva en la base de datos del banco Gen reveló que la secuencia era similar a los Lyssavirus con identidades inferiores al 79% que soportaban las identidades de los Lyssavirus detectados.Posteriormente, dos lyssavirus se aislaron con éxito de los dos cerebros, según lo confirmado por la prueba de anticuerpos de fluorescencia y la secuenciación. El paso clave para determinar la positividad del lyssavirus son la prueba de anticuerpos de fluorescencia y el análisis RT-CPR. Se recomienda el uso de dos o más anticuerpos antirrábicos en los conjuntos de imprimación.Además de Lyssavirus, otros patógenos de murciélagos zoo-no-ical pueden ser monitoreados usando métodos de diagnóstico cerrados. Los datos se pueden utilizar para informar al público sobre cómo evitar el contacto con los murciélagos. Cuanto más podamos estudiar el Lyssavirus del murciélago, más podremos entender su evolución e impacto en la salud pública.

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Research

Investigación

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Aquí, presentamos los protocolos para identificar inmunomoduladores 1) virus-codificado que promueven la replicación de arbovirus y host 2) eucariotas factores que limitan la replicación de arbovirus. Estos métodos basados en fluorescencia y luminiscencia permiten a los investigadores obtener rápidamente lecturas cuantitativas de la replicación de arbovirus en análisis simplistas con proporciones bajas de señal a ruido.

Infecciones del arbovirus como herramientas de detección para la identificación de factores antivirales inmunomoduladores y anfitrión Viral

Se ha desarrollado una reacción en cadena de la polimerasa de la transcripción inversa de pan-lyssavirus para detectar específicamente todos los lyssavirus conocidos. La validación utilizando muestras cerebrales de rabia de diferentes especies animales demostró que este método tiene una sensibilidad y especificidad equivalente a la prueba de anticuerpos fluorescentes estándar de oro y podría ser utilizado para el diagnóstico de la rabia de rutina.

Evaluación de una reacción en cadena de la polimerasa de la transcripción inversa anidada universal para la detección de Lyssaviruses

Este es un protocolo para la preparación óptima del tejido para análisis genómicos, transcriptómicos y proteómicos de murciélagos atrapados en la naturaleza. Incluye protocolos para la captura y disección de murciélagos, la preservación de tejidos y el cultivo celular del tejido murciélago.

Colección de tejidos de murciélagos para análisis de émica y cultivo celular primario

Este RT-PCR en tiempo real que utiliza tinte intercalador dsDNA es adecuado para diagnosticar infecciones por lissavirus. El método comienza con el ARN extraído de la rabia sospechada de muestras ante mortem o post mortem, detallando la preparación de mezclas maestras, la adición de ARN, la configuración de la máquina en tiempo real y la correcta interpretación de los resultados.

Pan-lyssavirus en tiempo real RT-PCR para diagnóstico de rabia

Presentamos un protocolo completo para el diagnóstico postmortem de la rabia animal en condiciones de campo utilizando una prueba de diagnóstico inmunocromatográfico rápido (RIDT), desde el muestreo de biopsia cerebral hasta la interpretación final. También describimos otras aplicaciones que utilizan el dispositivo para el análisis molecular y el genotipado viral.

Prueba de diagnóstico inmunocromatográfico rápido postmortem de campo para la configuración de recursos limitados con otras aplicaciones moleculares

Este protocolo demuestra el ensayo de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) pan-lyssavirus LN34 en tiempo real desde la recolección de tejidos hasta la interpretación de los resultados, incluidas las actualizaciones de las secuencias de cebadores y formulaciones para mejorar el rendimiento del ensayo para algunos lyssavirus y lagomorfos no antirrábicos. También demostramos la configuración del ensayo para un formato multiplexado LN34 de un solo pocillo (LN34M).

Diagnóstico postmortem de la rabia en animales mediante el ensayo de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa LN34 en tiempo real multiplexado actualizado

Se desarrolló un enfoque para identificar las condiciones óptimas de concentración viral para muestras de agua de pequeño volumen utilizando picos de adenovirus humano. Las técnicas descritas aquí se utilizan para identificar parámetros de concentración para otros objetivos virales y se aplican a la experimentación de concentración viral a gran escala.

Un procedimiento de volumen pequeño para la concentración viral del Agua

Se requiere un cuidado especial al usar "técnicas limpias" para recolectar y procesar adecuadamente muestras de agua para estudios de metales traza en ambientes acuáticos. Se presenta un protocolo para procedimientos de muestreo, procesamiento y análisis con el objetivo de obtener datos de monitoreo ambiental confiables y resultados con alta sensibilidad para estudios detallados de metales traza.

Limpia Muestreo y Análisis de río y estuarios, aguas de trazas metálicas Estudios

Plancton y partículas en suspensión juegan un papel importante en los ciclos biogeoquímicos en el mar. Aquí, nos proporcionan un método ultra limpia y bajo estrés para la colección de varios tamaños de partículas y plancton en el mar con la capacidad de manejar grandes volúmenes de agua de mar.

Un aparato de múltiples capas ultra limpio para recoger plancton marino tamaño fraccionado y partículas en suspensión

Presentamos un protocolo para la síntesis de azúcares C5 (xilosa y arabinosa) de una biomasa lignocelulósica renovable de no comestibles (por ejemplo, yute) con la presencia de líquidos iónicos ácidos de Brønsted (fianzas) como el catalizador en agua. El catalizador de fianzas exhibió mejor catalizador rendimiento de catalizadores ácidos mineral convencionales (H2SO4 y ácido clorhídrico).

Un nuevo método para el análisis de este presente en la biomasa de yute y su transformación en monómeros de azúcar con ácido líquido iónico

Aprenda el procedimiento operativo estándar para la vigilancia de Lyssavirus en poblaciones de murciélagos de Taiwán. Este protocolo detalla la recolección de muestras, pruebas diagnósticas y análisis de datos para investigadores en virología.

Procedimiento Operativo Estándar para la Vigilancia de Lyssavirus de la Población Bat en Taiwán

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