Name: Evaluación del riesgo y la prevalencia del cáncer colorrectal mediante la detección de la integridad del ADN de las heces (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Aprende a evaluar el riesgo de cáncer colorrectal mediante la detección no invasiva de la integridad del ADN fecal con el kit FL-DNA. Este método mejora la precisión del cribado clínico.

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Los autores no tienen reconocimientos.

Los pacientes fueron reclutados en el Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) de Meldola (FC, Italia) entre 2013 y 2015. Los pacientes inscritos estaban en el protocolo IRSTB002, aprobado por el Comité de ética del IRST - IRCCS AVR (25/10/2012, ver. 1). Todos los métodos se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes.
1. Extracción de ADN de heces
<ol><li>Utilice un kit para preparar muestras de heces (consulte Tabla de materiales). Seleccione y trate el material fecal realizando la extracción de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Amplificar el ADN purificado directamente o almacenar a -20 oC para su posterior análisis.</li>
</ol>2. Preparación de control positivo, estándares, ADN con clavos y muestras clínicas
<ol><li>Preparación de normas y muestras<ol>
<li>Para preparar el control positivo, las normas, el ADN con espiga y todas las muestras clínicas, centrifugar una alícuota de control positivo, estándares y ADN con espiga, y luego resuspender cada reactivo añadiendo la cantidad correcta de agua proporcionada (ver más abajo). Luego, vórtice cuidadosamente el control positivo, estándar, y spike-in ADN, luego centrífuga para 10 s. Para lograr una resuspensión completa de los reactivos secos, almacene los reactivos líquidos a temperatura ambiente (RT) durante 30 minutos antes de su uso.<ol>
<li>El control positivo es el ADN humano en un formato seco. Resuspender cada alícuota con 750 ml de agua.</li>
			<li>El ADN de espiga es el ADN de salmón (Oncorhynchus keta), que se utiliza como un control interno exógeno para verificar la posible presencia de inhibidores en muestras de ADN extraídas de heces. Resuspender cada alícuota con 100 ml de agua.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para preparar la curva estándar, produzca cuatro diluciones 1:5 a partir de la solución de stock. Los puntos estándar deben ser 10 ng/reacción, 2 ng/reacción, 0,4 ng/reacción y 0,08 ng/reacción.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación del ADN de 1x espiga en<ol>
<li>Prepare el control de ADN de pico directamente antes de usarlo.</li>
		<li>Preparar el control de ADN de 1x pico-en mezclando 5 s de pico FL-DNa con 20 ml de agua estéril. El número de muestras de control de ADN 1x spike-in se preparará de acuerdo con el número de muestras a analizar, más el control positivo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de muestras<ol>
<li>Mezclar 75 l de las muestras (muestras clínicas o control positivo) con 25 ml de ADN de 1x espiga, lo que produce un volumen total de 100 l.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Amplificación y determinación del valor FL-DNA utilizando qPCR Easy PGX
NOTA: Las mezclas de amplificación completas que contienen imprimaciones y sondas específicas dirigidas al ADN humano y el control interno se proporcionan en un formato liofilizado en 8 tiras de pozo para FL-DNA Mix A y FL-DNA Mix B. Estándares, controles positivos y negativos, y las muestras deben amplificarse con ambas mezclas liofilizadas. Las muestras clínicas solo deben amplificarse por duplicado con ambas mezclas liofilizadas.
<ol><li>Consulte la Tabla de materiales para el instrumento qPCR y el software operativo.<ol>
<li>Abra el software de funcionamiento y configure la placa y el perfil térmico:<ol>
<li>Configure la placa como se muestra en la Tabla 1.<ol>
<li>Establezca el tipo de pozo para las ocho posiciones de la columna 1 como Estándar.</li>
				<li>Establezca el tipo de pozo para los pozos A2 y B2 como NTC.</li>
				<li>Establezca el tipo de pozo para C2 y D2 (los controles positivos) como Desconocido.</li>
				<li>Establezca el tipo de pozo para todas las demás posiciones como Desconocido.
</li>
				<li>Seleccione las 96 posiciones y agregue los tintes FAM y HEX. Haga clic en Sincronizar placa.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Establezca el perfil térmico según la Tabla 2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Centrifugar el número necesario de tiras durante 10 s para llevar el contenido a la parte inferior del tubo.</li>
		<li>Retire suavemente los sellos de las tiras, mientras presta atención a retener el contenido, y añadir a las tiras respectivas: control negativo: 20 l de agua; muestra: 20 l de ADN; curva estándar: 20 l de 1, 2, 3 o 4 de serie; control positivo: 20 ml de control positivo.</li>
		<li>Cierre cuidadosamente todas las tiras utilizando las tapas ópticas planas de 8 tiras y el vórtice durante unos segundos.</li>
		<li>Centrifugar las tiras durante 10 s y cargarlas en el instrumento. Entonces, comienza la carrera.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Análisis de datos
NOTA: El análisis de datos se puede realizar de forma automática o manual en función del software (consulte Tabla de materiales).
<ol><li>Al final de la ejecución, seleccione las columnas A, C, E, G para "FAM: FL-DNA-A" y"HEX: IC"y las columnas B, D, F, H para "FAM: FL-DNA-B" y"HEX: IC".</li>
	<li>Establezca lo siguiente para el Importe de inicio de cantidades estándar:10 ng/reacción para pozos A1 y B1, 2 ng/reacción para C1 y D1, 0,4 ng/reacción para E1 y F1, y 0,08 ng/reacción para G1 y H1.</li>
	<li>Establezca los valores de fluorescencia de umbral en 150 para los canales FAM (FL-DNA A y FL-DNA B) y HEX (IC).</li>
	<li>En el cuadro Tabla de resultados, haga clic en Opciones de columna . Seleccione Todo ? Ok para obtener los resultados en ambos canales con sus respectivos valores Cq (R) y R. NOTA: Estos valores son suministrados por el software de instrumentos PCR en tiempo real. El último valor de fluorescencia corresponde al último ciclo de amplificación.</li>
	<li>En el cuadro Tabla de resultados, haga clic con el botón derecho en la tabla para abrir el menú contextual y haga clic en Enviar a Excel para exportar los datos sin procesar.</li>
	<li>Compruebe los valores de las normas para verificar la idoneidad de la curva estándar.</li>
	<li>Para cada mezcla de FL-DNA, compruebe la R2 ["R2 (columna R)" y la eficiencia ["Eficiencia (%)" columna]. Si se encuentran en un rango aceptable, es posible proceder con el análisis de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Tabla 3).</li>
	<li>Si los resultados del canal FAM no están en el rango esperado, omita un punto de la curva estándar y vuelva a analizar la ejecución.</li>
	<li>Determine los valores de los controles negativos y positivos con la siguiente fórmula, considerando los valores "No Cq" como cero: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq2.jpg">
</li>
	<li>Compare los valores obtenidos con los reportados en la Tabla 4.</li>
	<li>Si los controles de reacción están en el rango de valores esperados, proceda con el análisis de las muestras. NOTA: Compruebe que los valores Cq obtenidos se generan a partir de una reacción de amplificación real (curva de fluorescencia sigmoidal) y no de un artefacto (curva de fluorescencia lineal).</li>
	<li>Para analizar la idoneidad de la muestra para cada mezcla FL-DNA, compare los valores Cq del canal HEX. Si el valor es 16, proceda con el análisis de las muestras. Si el valor es &lt;16 o no hay Cq, es probable que se deba a un error de dosificación del pico FL-DNA. Por lo tanto, no es posible analizar las muestras.</li>
	<li>Calcule el promedio de los valores Cq en el canal "HEX" del control positivo utilizando la siguiente fórmula: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq3.jpg">
</li>
	<li>Calcule el promedio de los valores Cq en el canal "HEX" de las réplicas de muestra utilizando la siguiente fórmula: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq4.jpg">
</li>
	<li>Calcule los valores de CqHEX de acuerdo con la siguiente fórmula: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq5.jpg">
</li>
	<li>Compare los valores de CqHEX de las muestras con los notificados en la Tabla 5.</li>
	<li>Para cada mezcla (Mix A y Mix B), compare los valores Cq del canal FAM con los reportados en la Tabla 6.
</li>
	<li>Para determinar el valor FL-DNA de cada muestra adecuada, utilice la siguiente fórmula, considerando los valores "No Cq" como cero: <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq6.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq2.jpg"> NOTA: El riesgo y la prevalencia del cáncer colorrectal es una función de las evaluaciones iFOBT y FL-DNA de acuerdo con los resultados del nomograma de Fagan obtenidos por Rengucci et al.12 (Tabla 7).</li>
</ol>

<ol><li>Fearon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Genetics+of+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Molecular Genetics of Colorectal Cancer.</a> Annual Review of Pathology. 6, 479-507 (2011).</li>
<li>Sears, C. L., Garrett, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbes%2C+Microbiota%2C+and+Colon+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Microbes, Microbiota, and Colon Cancer.</a> Cell Host and Microbe. 15, 317-328 (2014).</li>
<li>SEER Stat Fact Sheets: Colon and Rectum Cancer. National Cancer Institute. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://seer.cancer.gov/statfacts/html/colorect.html">http://seer.cancer.gov/statfacts/html/colorect.html</a> (2019).</li>
<li>Levin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+Surveillance+for+the+Early+Detection+of+Colorectal+Cancer+and+Adenomatous+Polyps%2C+2008%3A+A+Joint+Guideline+From+the+American+Cancer+Society%2C+the+US+Multi-Society+Task+Force+on+Colorectal+Cancer%2C+and+the+American+College+of+Radiology%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Screening and Surveillance for the Early Detection of Colorectal Cancer and Adenomatous Polyps, 2008: A Joint Guideline From the American Cancer Society, the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer, and the American College of Radiology.</a> Gastroenterology. 134, 1570-1595 (2008).</li>
<li>Bosch, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tests+for+colorectal+cancer+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Colorectal+Cancer%22%5BJournal%5D)">Molecular tests for colorectal cancer screening.</a> Clinical Colorectal Cancer. 10, 8-23 (2011).</li>
<li>Ahlquist, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+colorectal+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of colorectal neoplasia.</a> Gastroenterology. 138, 2127-2139 (2010).</li>
<li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+multiple+molecular+tests+to+detect+colorectal+cancer+in+stool%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Fecal multiple molecular tests to detect colorectal cancer in stool.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology. 1, 377-383 (2003).</li>
<li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+colorectal+cancer+by+a+quantitative+fluorescence+determination+of+DNA+amplification+in+stool%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Detection of colorectal cancer by a quantitative fluorescence determination of DNA amplification in stool.</a> Neoplasia. 6, 536-540 (2004).</li>
<li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fluorescence+determination+of+long-fragment+DNA+in+stool+as+a+marker+for+the+early+detection+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Quantitative fluorescence determination of long-fragment DNA in stool as a marker for the early detection of colorectal cancer.</a> Cellular Oncology. 31, 11-17 (2009).</li>
<li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+DNA+for+noninvasive+diagnosis+of+colorectal+cancer+in+immunochemical+fecal+occult+blood+test-positive+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiology+Biomarkers+and+Prevention%22%5BJournal%5D)">Fecal DNA for noninvasive diagnosis of colorectal cancer in immunochemical fecal occult blood test-positive individuals.</a> Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 19, 2647-2654 (2010).</li>
<li>De Maio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+and+stool+nucleic+acid+analysis+for+colorectal+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Circulating and stool nucleic acid analysis for colorectal cancer diagnosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20, 957-967 (2014).</li>
<li>Rengucci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+stool+DNA+integrity+method+for+early+colorectal+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiology+Biomarkers+and+Prevention%22%5BJournal%5D)">Improved stool DNA integrity method for early colorectal cancer diagnosis.</a> Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 23, 2553-2560 (2014).</li>
</ol>

Maura Menghi es empleada a tiempo completo de Diatech Pharmacogenetics srl.

Estudios anteriores han demostrado que el análisis de la integridad del ADN de las heces extraídas por enfoques manuales y semiautomáticos puede representar una herramienta alternativa para la detección temprana de lesiones colorrectales7,8,9,10,11,12. A lo largo de los años se han desarrollado pruebas de detección moleculare...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/59426/evaluation-colorectal-cancer-risk-prevalence-stool-dna-integrity">Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection</a>. An&#160;affiliation&#160;was&#160;updated.
The first&#160;affiliation was updated from:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST)
to:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/59426/evaluation-colorectal-cancer-risk-prevalence-stool-dna-integrity">Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection</a>. An&#160;affiliation&#160;was&#160;updated.

Erratum: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

El cáncer colorrectal (CRC) deriva de un proceso de varios pasos en el que el epitelio sano se convierte lentamente en adenomas o pólipos, que progresan en carcinomas malignos con el tiempo1,,2. A pesar de la alta tasa de incidencia de la CRC, se ha observado una tendencia a la baja en el porcentaje de muertes en la última década3. De hecho, las herramientas de diagnóstico temprano adoptadas en los programas de cribado han llevado a la detección y eliminación temprana de adenomas pre-neoplásicos o pólipos4. Sin embargo, debido a los diferentes límites técnicos, ninguno de estos métodos es óptimo. De hecho, con el fin de mejorar la sensibilidad y la especificidad, muchas pruebas de ADN de heces se han propuesto solo o en combinación con las pruebas diagnósticas de rutina actuales5,6.
Típicamente, la mucosa sana se arroja en los colonocitos apoptóticos de la corriente fecal, mientras que la mucosa enferma exfolia los colonocitos no apoptóticos. Fragmentos de 200 bp o más de longitud caracterizan el ADN no apoptótico. Este ADN se denomina ADN largo (ADN-L) y se ha convertido en un biomarcador utilizable para el diagnóstico temprano de la CRC. El L-DNA puede ser aislado de la muestra de heces y cuantificado por qPCR utilizando un kit de ADN FL de diagnóstico in vitro7,8,9,10,11,12.
La prueba consta de dos ensayos para la detección de fragmentos de FL-DNA que van desde 138 bp a 339 bp. Cada ensayo permite la amplificación de FL-DNA (FAM) así como el ADN de pico (HEX). Para garantizar una amplificación óptima de todos los fragmentos, la prueba se ha dividido en dos ensayos (denominados "A" y "B"). El ensayo A detecta dos regiones del exón 14 del gen APC (NM_001127511) y un fragmento del exón 7 del gen TP53 (NM_001276760). El ensayo B detecta un fragmento del exón 14 del gen APC (NM_001127511) y dos regiones de los exones 5 y 8 del gen TP53 (NM_001276760). Los ensayos no distinguen entre las regiones detectadas. El ADN de espiga corresponde al ADN salmón Oncorhynchus keta y permite verificar que el procedimiento se ha realizado correctamente y comprueba la posible presencia de inhibidores, lo que puede producir resultados falsos negativos. La concentración de FL-DNA se evalúa mediante cuantificación absoluta utilizando el método de curva estándar y se expresa como ng/reacción.
El método FL-DNA es una prueba de ADN de heces no invasiva y económica que, combinada con el análisis de sangre oculta en heces (iFOBT) basado en inmunoquímicos, se utiliza actualmente en los programas de cribado de CRC y permite mejores predicciones de lesiones de CRC y/o adenoma de alto riesgo12.

<table><tbody><tr><td>Tubos de polipropileno de 1,5 mL y 2 mL (sin inhibidores de DNasa, RNasa, ADN, PCR)</td><td></td><td></td><td>Consumibles necesarios para la extracción de ADN y PCR en tiempo real</td></tr><tr><td>Etanol absoluto (calidad del grado analítico)</td><td></td><td></td><td>Reactivo necesario para la extracción de ADN</td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Velocidad máxima de 20000 x g. Instrumento necesario para la extracción de ADN</td></tr><tr><td>Software de análisis EasyPGX versión 2.0.0</td> Software de análisis <td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT800-SW</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrífuga/vórtice EasyPGX Tiras de 8 pocillos</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT803</td><td>Instrumento recomendado para el ensayo de PCR en tiempo real</td></tr><tr><td>EasyPGX qPCR instrument 96&nbsp;</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT800-96</td><td>Instrumento recomendado para el ensayo de PCR en tiempo real</td></tr><tr><td>Preparado para EasyPGX FL-DNA</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT029</td><td>Kit necesario para el ensayo de PCR en tiempo real</td></tr><tr><td>Micropipetas (volúmenes de 1 a 1.000 y micro; L)</td><td></td><td></td> <td>Consumibles necesarios para la extracción de ADN y PCR en tiempo real</td></tr><tr><td>Guantes</td><td></td><td></td> desechables sin polvo <td>Consumibles necesarios para la extracción de ADN y PCR en tiempo real</td></tr><tr><td>QIAamp Fast DNA Stool</td><td>Qiagen</td><td>51604</td><td>Kit recomendado para la extracción y purificación de ADN de las heces</td></tr><tr><td>Puntas de filtro estériles DNasa-, RNasa (volúmenes de 1 a 1.000 y micro; L)</td><td></td><td></td> <td>Consumibles necesarios para la extracción de ADN y PCR en tiempo real</td></tr><tr><td>Bloque térmico, por ejemplo, bloque seco EasyPGX</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT801</td><td>Instrumento necesario para la extracción de ADN</td></tr><tr><td>Vórtice, por ejemplo, centrífuga/vórtice EasyPGX 1,5 ml&nbsp;</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT802</td><td>Instrumento necesario para la extracción de ADN</td></tr></tbody></table>

evaluación del riesgo y la prevalencia del cáncer colorrectal mediante la detección de la integridad del adn de las heces

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Hoy en día, el ADN de las heces puede ser aislado y analizado por varios métodos. Los fragmentos largos de ADN en las heces pueden ser detectados por un ensayo qPCR, que proporciona una probabilidad confiable de la presencia de lesiones colorrectales pre-neoplásicas o neoplásicas. Este método, llamado ADN largo de fluorescencia (FL-DNA), es un procedimiento rápido y no invasivo que mejora el sistema de prevención primaria. Este método se basa en la evaluación de la integridad del ADN fecal mediante la amplificación cuantitativa de objetivos específicos del ADN genómico. En particular, la evaluación de fragmentos de ADN de más de 200 bp permite la detección de pacientes con lesiones colorrectales con muy alta especificidad. Sin embargo, este sistema y todas las pruebas de ADN de heces disponibles actualmente presentan algunas cuestiones generales que deben abordarse (por ejemplo, la frecuencia con la que se deben llevar a cabo las pruebas y el número óptimo de muestras de heces recogidas en cada punto de tiempo para cada individuo). Sin embargo, la principal ventaja de FL-DNA es la posibilidad de utilizarlo en asociación con una prueba utilizada actualmente en el programa de cribado de CRC, conocido como análisis de sangre oculta en heces basada en inmunoquímicos (iFOBT). De hecho, ambas pruebas se pueden realizar en la misma muestra, reduciendo los costos y logrando una mejor predicción de la presencia final de lesiones colorrectales.

El flujo de trabajo de este protocolo se muestra en la figura 1. El flujo de trabajo proporciona dos pasos de control y acciones diferentes según estos resultados de paso. En primer lugar, si una muestra presenta controles inadecuados, la amplificación debe repetirse. En segundo lugar, si se inhibe la amplificación, la muestra debe ser reprocesada desde el principio o clasificada como no valiosa.
La Figura 2 muestra las curvas de fluorescencia producidas por m...

El kit de diagnóstico de FL-DNA presentado es un método fácil de ahorrar tiempo y fácil de usar para determinar la probabilidad confiable de la presencia de lesiones por cáncer colorrectal.

Evaluación del riesgo y la prevalencia del cáncer colorrectal mediante la detección de la integridad del ADN de las heces

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Este método permite detectar, mediante un enfoque no invasivo, al paciente con lesión neoplásica colorrectal. En particular, esta prueba permite, en asociación con las pruebas utilizadas actualmente en el programa de detección del cáncer colorrectal, para predecir mejor la presencia de cáncer o mayor riesgo de lesiones anormales. Para comenzar este protocolo, centrifugar una alícuota de cada control positivo, ADN estándar y ADN puntiagudo, en un formato seco durante 10 segundos en una mini centrífuga.Resuspender el control positivo con 750 microlitros de agua. Resuspender el ADN de espiga, utilizado como un control interno exógeno, para probar la presencia de inhibidores, con 100 microlitros de agua. Para la curva estándar, resuspender el estándar seco con 100 microlitros de agua y hacer cuatro diluciones 1:5 a partir de la solución de stock.Luego, vórtice cuidadosamente los reactivos durante 15 segundos, y centrifugar en una mini centrífuga durante 10 segundos. Para una resuspensión completa, almacene los reactivos líquidos a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de usarlos. Para preparar el control de ADN de 1x pico, mezcle cinco microlitros de pico de FL-DNA con 45 microlitros de agua estéril.Para las muestras, mezcle 75 microlitros de cada muestra con 50 microlitros de ADN de 1x espiga, produciendo un volumen total de 125 microlitros. En primer lugar, abra el software operativo qPCR. Para configurar la placa, establezca el Tipo de pozo para las ocho posiciones en la columna uno, como Estándar.Establezca el Tipo de pozo para los pozos A2 y B2 como NTC. Establezca el Tipo de pozo para los controles positivos, C2 y D2, como Desconocido. Y establezca el Tipo de pozo para todas las demás posiciones como Desconocido.Seleccione las 96 posiciones. Agregue los tintes, FAM y HEX y haga clic en Sincronizar placa. A continuación, establezca el perfil térmico, según lo dispuesto.Preparar el número deseado de tiras de 8 pocódicos que contienen mezclas completas de amplificación liofilizada, con imprimaciones y sondas específicas dirigidas al ADN humano, y el control interno. Para llevar el contenido a la parte inferior de los tubos, centrifugar las tiras durante 10 segundos. Retire suavemente los sellos de las tiras, asegurándose de no perder ningún pellet.A continuación, agregue 25 microlitros de agua a los pozos de control negativos. 25 microlitros de ADN de muestra para muestrear pozos y 25 microlitros de ADN de control positivo a los pozos de control positivo. Para la curva estándar, agregue 25 microlitros de estándar 1, 2, 3 y 4 en cada pozo dedicado.Utilice tapas ópticas planas de 8 tiras para cerrar cuidadosamente todas las tiras y el vórtice durante unos segundos. Centrifugar las tiras durante 10 segundos, cargarlas en el instrumento e iniciar la carrera. Al final de la ejecución, para FAM FL-DNA A y HEX IC, seleccione columnas, A, C, E y G.Para FAM FL-DNA B y HEX IC, seleccione columnas, B, D, F y H.Para la cantidad inicial de cantidades estándar, establezca 10 nanogramos por reacción para pozos A1 y B1, dos nanogramas por reacción para C1 y D1 punto cuatro nanogramos por reacción , y el punto cero ocho nanogramos por reacción para G1 y H1. A continuación, para los canales FAM y HEX, establezca los valores de fluorescencia de umbral en 150.En el cuadro Tabla de resultados, haga clic en Opciones de columna, luego, Seleccionar todo y, a continuación, Aceptar, para obtener los resultados en ambos canales con sus respectivos valores Cq y delta R, que son suministrados por el software de instrumentos qPCR en tiempo real. Delta R corresponde al valor de fluorescencia normalizado al último ciclo de amplificación. En el cuadro Tabla de resultados, haga clic con el botón derecho en la tabla para abrir el menú contextual.Haga clic en Enviar a Excel para exportar los datos sin procesar. Y luego cargue el archivo de Excel en el software de análisis dedicado para el cálculo automatizado de la cantidad de FL-DNA. A partir de la combinación de valores iFOBT y FL-DNA estimados para cada paciente, el riesgo de cáncer colorrectal.Las curvas de fluorescencia de una muestra positiva adecuada muestran la señal de muestra en el canal HEX, que es el control interno, dentro del rango aceptable. La señal positiva está por encima del umbral en el canal FAM, que muestra la amplificación de los genes diana. Las curvas de fluorescencia de una muestra negativa adecuada muestran la señal de muestra dentro del rango aceptable en el canal HEX.La señal de control negativa está por debajo del umbral en el canal FAM. Por otro lado, las curvas de una muestra no adecuada muestran la señal de muestra que no está dentro del rango aceptable en el canal HEX. Lo más probable es que se deba a una posible inhibición.Por lo tanto, esta muestra debe repetirse, a partir de la extracción. La tabla de resultados de análisis de software muestra datos para Mix A y Mix B en términos de concentración de FL-DNA para controles de reacción, muestras clínicas y resultados de control de calidad de ejecución. El número de muestra cuatro no tiene ningún resultado porque no pasó el control de calidad.Debe repetirse y volver a analizarse. Tenga cuidado cuando resusppended el ADN para el spike-in control a la curva estándar. Y al distribuir diferentes DNAs a tiras de 8 pozos, así como durante la detección molecular en la sección de análisis de resultados.Este método debe realizarse en combinación con la prueba iFOBT para permitir una mejor evaluación de las lesiones neoplásicas colorrectales, debe llevarse a cabo con la misma muestra fecal.

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Research

Investigación

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Cancer Research

Investigación del cáncer

Reducción de la expresión / ausente de PMS2 y / o ERCC1 en las criptas todo es un evento frecuente dentro de los 10 cm a cada lado de los adenocarcinomas de colon, probablemente la base de un defecto en el campo con gran capacidad de mutar y progresión del cáncer. La deficiencia en Ku86 o CCOI es mucho menos frecuente en estos defectos en el campo.

PMS2 deficiente, ERCC1, Ku86, CCOI en los defectos del campo durante la progresión de cáncer de colon

Se describe un procedimiento para la desagregación de cáncer colorrectal (CCR) para producir células viables único, que son capturados en microarrays de anticuerpos a medida el reconocimiento de los antígenos de superficie (CRC DotScan microarrays). Subpoblaciones de células obligado a los microarrays pueden ser perfiladas por multiplexación de fluorescencia utilizando anticuerpos monoclonales marcados con colorantes fluorescentes.

Celular del cáncer colorrectal superficie de la proteína perfiles con un microarray de anticuerpos y la multiplexación de fluorescencia

Este video describe el protocolo de aislamiento de ADN de muestras de heces de ratones portadores de tumores de colon. El ADN extraído se amplifica mediante PCR y el producto se limpia aún más mediante un enfoque basado en perlas magnéticas. Este método se puede utilizar para determinar el efecto del enriquecimiento ambiental sobre la microbiota del colon y la mortalidad animal.

Aislamiento de ADN microbiano en heces: estudio del efecto del enriquecimiento ambiental en la diversidad del microbioma en un modelo de tumor murino

Reportamos mejoras significativas para la medición reproducible de mutaciones somáticas de células madre colónicas después de la exposición de ratones a agentes potencialmente dañinos en el ADN.

La cuantificación de la madre del colon mutaciones celulares

Se propone un método para analizar la integridad del ADN en la fracción sobrenadante libre de células de las muestras de orina. El método es adecuado para la detección precoz de neoplasias urológicas malignas y ha demostrado ser preciso para el diagnóstico precoz del cáncer de vejiga.

Libre de células análisis de la integridad del ADN en muestras de orina

Enriquecimiento ambiental (EE) es un entorno de alojamiento de los animales que se utiliza para revelar los mecanismos que subyacen a las conexiones entre el estilo de vida, estrés y enfermedad. Este protocolo describe un procedimiento que utiliza un modelo de ratón de tumorigenesis colon y EE definir específicamente alteraciones en la biodiversidad de la microbiota que puede afectar la mortalidad de animales.

Un método para definir los efectos del enriquecimiento ambiental sobre la biodiversidad de microbioma de Colon en un modelo de Tumor de Colon murino

Reacción en cadena digital de la polimerasa (PCR) es una herramienta útil para la detección de alta sensibilidad de variantes de un solo nucleótido y ADN copia número variantes. Aquí, demostramos las más importantes consideraciones para la medición de variantes raras en el genoma mediante PCR digital con el formato de chip en tubo.

Digital de la reacción en cadena de polimerasa para la variación genética en un paciente de la poliposis adenomatosa familiar esporádico con el formato de Chip en tubo

Aquí se presenta un protocolo para descubrir los genes conductores sobreexpresados que mantienen las células similares al cáncer derivadas de las células HT29 colorrectales. RNAseq con bioinformática disponible se realizó para investigar y examinar las redes de expresión génica para esclarecer un mecanismo potencial implicado en la supervivencia de las células tumorales dirigidas.

Descubrimiento de genes conductores en tumores timos similares al cáncer de 29 años de origen colorrectal

Presentamos un protocolo flexible para generar metagenomas de fracciones de tamaño viral (viromes) de alta calidad a partir de muestras de heces humanas. Desarrollado originalmente para la virómica del suelo, aquí este protocolo se aplicó con éxito a muestras de heces, permitiendo una caracterización robusta de la virosfera intestinal humana.

Metagenómica de fracciones de tamaño viral del ADN para muestras de heces humanas

Describimos el establecimiento de tumores colorrectales ortotópicos mediante la inyección de células tumorales o organoides en el ciego de ratones y el subsiguiente aislamiento de células tumorales circulantes (CTC) de este modelo.

Aislamiento de células tumorales circulantes en un modelo de ratón ortotópico de cáncer colorrectal

Aprende a evaluar el riesgo de cáncer colorrectal mediante la detección no invasiva de la integridad del ADN fecal con el kit FL-DNA. Este método mejora la precisión del cribado clínico.

Evaluación del riesgo y la prevalencia del cáncer colorrectal mediante la detección de la integridad del ADN de las heces

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