Name: Procesamiento de líquido de lavado broncoalveolar y sangre emparejada para macrófago alveolar y CD4+ inmunofenotipado de células T y evaluación del embalse de VIH (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Aprende a procesar líquido de lavado broncoalveolar y sangre emparejada para aislar macrófagos alveolares y células T CD4+. Este método permite evaluar reservorios pulmonares de VIH mediante inmunofenotipado y PCR ultrasensible.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores desean reconocer a sus funderos: los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria (CIHR) (conceder #153082 a CC, MAJ, NC); el Réseau SIDA et maladies infectieuses du Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S) que otorgó fondos a CC y MAJ y a la Facultad de Medicina de la Universidad McGill que concedió fondos a CC. Este estudio también fue apoyado en parte por los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria (CIHR)- financiado por el equipo canadiense de la empresa de curación del VIH (CanCURE) Subvención HB2 – 164064 a MAJ, CC y NC. MAJ tiene la Cátedra de Investigación CIHR Canadá tier 2 en Inmunovirología y CC y NC poseen un premio de salario de investigación FRQ-S Junior 1 y Junior 2, respectivamente. ET posee un premio RI-MUHC Studentship MSc.
Además, los autores desean reconocer a Josée Girouard y a todo el personal clínico involucrado en la coordinación y obtención de las muestras, así como a los terapeutas respiratorios; Ekaterina Iourtchenko, Héléne Pagé-Veillette y Marie-Héléne Lacombe en la plataforma de inmunofenotipado RI- MUHC; y la Dra. Marianna Orlova para el suministro de las fotos de la microscopía. Lo más importante es que los autores desean dar las gracias a los muchos voluntarios sin los cuales esta investigación no sería posible.

<ol><li>Chun, T. W., Fauci, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latent+reservoirs+of+HIV%3A+obstacles+to+the+eradication+of+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Latent reservoirs of HIV: obstacles to the eradication of virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 10958-10961 (1999).</li>
<li>Finzi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latent+infection+of+CD4%2B+T+cells+provides+a+mechanism+for+lifelong+persistence+of+HIV-1%2C+even+in+patients+on+effective+combination+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Latent infection of CD4+ T cells provides a mechanism for lifelong persistence of HIV-1, even in patients on effective combination therapy.</a> Nature Medicine. 5, 512-517 (1999).</li>
<li>Costiniuk, C. T., Jenabian, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lungs+as+anatomical+reservoirs+of+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">The lungs as anatomical reservoirs of HIV infection.</a> Reviews in Medical Virology. 24, 35-54 (2014).</li>
<li>Center for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cluster+of+Kaposi%27s+sarcoma+and+Pneumocystis+carinii+pneumonia+among+homosexual+male+residents+of+Los+Angeles+and+Orange+Counties%2C+California%5BTitle%5D)+AND+%22Morbidity+and+Mortality+Weekly+Report%22%5BJournal%5D)">A cluster of Kaposi's sarcoma and Pneumocystis carinii pneumonia among homosexual male residents of Los Angeles and Orange Counties, California.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 31, 305-307 (1982).</li>
<li>Fitzpatrick, M., Crothers, K., Morris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Future+directions%3A+lung+aging%2C+inflammation%2C+and+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Chest+Medicine%22%5BJournal%5D)">Future directions: lung aging, inflammation, and human immunodeficiency virus.</a> Clinics in Chest Medicine. 34, 325-331 (2013).</li>
<li>Kunisaki, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Will+expanded+ART+use+reduce+the+burden+of+HIV-associated+chronic+lung+disease%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+HIV+and+AIDS%22%5BJournal%5D)">Will expanded ART use reduce the burden of HIV-associated chronic lung disease?</a> Current Opinion in HIV and AIDS. 9, 27-33 (2014).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22WHO+%7C+Tuberculosis+and+HIV%22">WHO | Tuberculosis and HIV</a>. , https://www.who.int/hiv/topics/tb/en (2018).</li>
<li>Jambo, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+alveolar+macrophages+are+infected+preferentially+by+HIV+and+exhibit+impaired+phagocytic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Small alveolar macrophages are infected preferentially by HIV and exhibit impaired phagocytic function.</a> Mucosal Immunology. 7, 1116-1126 (2014).</li>
<li>Yeligar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+Alveolar+Macrophage+PPAR%CE%B3%2C+NADPH+Oxidases%2C+and+TGF%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Research+and+Human+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of Alveolar Macrophage PPARγ, NADPH Oxidases, and TGFβ.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 33, 1018-1026 (2017).</li>
<li>Cribbs, S. K., Lennox, J., Caliendo, A. M., Brown, L. A., Guidot, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healthy+HIV-1-infected+individuals+on+highly+active+antiretroviral+therapy+harbor+HIV-1+in+their+alveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Research+and+Human+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Healthy HIV-1-infected individuals on highly active antiretroviral therapy harbor HIV-1 in their alveolar macrophages.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 31, 64-70 (2015).</li>
<li>Holt, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+immune+and+inflammatory+cells+from+human+lung+parenchyma%3A+evaluation+of+an+enzymatic+digestion+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Extraction of immune and inflammatory cells from human lung parenchyma: evaluation of an enzymatic digestion procedure.</a> Clinical & Experimental Immunology. 66, 188-200 (1986).</li>
<li>Brenchley, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequencies+of+polyfunctional+HIV-specific+T+cells+are+associated+with+preservation+of+mucosal+CD4+T+cells+in+bronchoalveolar+lavage%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">High frequencies of polyfunctional HIV-specific T cells are associated with preservation of mucosal CD4 T cells in bronchoalveolar lavage.</a> Mucosal Immunology. 1, 49(2007).</li>
<li>Mwandumba, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis%3B+Resides+in+Nonacidified+Vacuoles+in+Endocytically+Competent+Alveolar+Macrophages+from+Patients+with+Tuberculosis+and+HIV+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis; Resides in Nonacidified Vacuoles in Endocytically Competent Alveolar Macrophages from Patients with Tuberculosis and HIV Infection.</a> The Journal of Immunology. 172, 4592(2004).</li>
<li>Gordon, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhaled+delivery+of+23-valent+pneumococcal+polysaccharide+vaccine+does+not+result+in+enhanced+pulmonary+mucosal+immunoglobulin+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Inhaled delivery of 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine does not result in enhanced pulmonary mucosal immunoglobulin responses.</a> Vaccine. 26, 5400-5406 (2008).</li>
<li>Costiniuk, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+persistence+in+mucosal+CD4%2B+T+cells+within+the+lungs+of+adults+receiving+long-term+suppressive+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">HIV persistence in mucosal CD4+ T cells within the lungs of adults receiving long-term suppressive antiretroviral therapy.</a> AIDS. 32, 2279-2289 (2018).</li>
<li>American Thoracic Society. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22American+Thoracic+Society+-+Bronchoalveolar+Lavage%22">American Thoracic Society - Bronchoalveolar Lavage</a>. , https://www.thoracic.org/professionals/clinical-resources/critical-care/clinical-education/critical-care-procedures/bronchoalveolar-lavage.php (2004).</li>
<li>King, T. E. Jr <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKing%2C+TE+%22Basic+principles+and+technique+of+bronchoalveolar+lavage+-+UpToDate%22">Basic principles and technique of bronchoalveolar lavage - UpToDate</a>. , https://www.uptodate.com/contents/basic-principles-and-technique-of-bronchoalveolar-lavage?topicRef=105799&source=see_link (2018).</li>
<li>Lea, S., Dungwa, J., Ravi, A., Singh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophage+size+is+increased+in+COPD+patients+compared+to+controls%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophage size is increased in COPD patients compared to controls.</a> European Respiratory Journal. 50, (2017).</li>
<li>Kuse, R., Schuster, S., Schübbe, H., Dix, S., Hausmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+lymphocyte+volumes+and+diameters+in+patients+with+chronic+lymphocytic+leukemia+and+normal+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Blut%22%5BJournal%5D)">Blood lymphocyte volumes and diameters in patients with chronic lymphocytic leukemia and normal controls.</a> Blut. 50, 243-248 (1985).</li>
<li>Heron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+lavage+cell+pattern+from+healthy+human+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar lavage cell pattern from healthy human lung.</a> Clinical & Experimental Immunology. 167, 523-531 (2012).</li>
<li>Rheinländer, A., Schraven, B., Bommhardt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD45+in+human+physiology+and+clinical+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">CD45 in human physiology and clinical medicine.</a> Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).</li>
<li>Yu, Y. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometric+Analysis+of+Myeloid+Cells+in+Human+Blood%2C+Bronchoalveolar+Lavage%2C+and+Lung+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54, 13-24 (2015).</li>
<li>Geiser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+Macrophage+Clearance+of+Inhaled+Micro-+and+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Aerosol+Medicine+and+Pulmonary+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Update on Macrophage Clearance of Inhaled Micro- and Nanoparticles.</a> Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23, 207-217 (2010).</li>
<li>Costiniuk, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+predictors+of+airflow+obstruction+in+an+HIV+tertiary+care+clinic+in+Montreal%2C+Canada%3A+A+cross+sectional+study%5BTitle%5D)+AND+%22HIV+Medicine%22%5BJournal%5D)">Prevalence and predictors of airflow obstruction in an HIV tertiary care clinic in Montreal, Canada: A cross sectional study.</a> HIV Medicine. , (2019).</li>
<li>Balfour, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altruism+motivates+participation+in+a+therapeutic+HIV+vaccine+trial+%28CTN+173%29%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Care%22%5BJournal%5D)">Altruism motivates participation in a therapeutic HIV vaccine trial (CTN 173).</a> AIDS Care. 22, 1403-1409 (2010).</li>
<li>Vandergeeten, C., Fromentin, R., Chomont, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cytokines+in+the+establishment%2C+persistence+and+eradication+of+the+HIV+reservoir%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+%26+Growth+Factor+Reviews%22%5BJournal%5D)">The role of cytokines in the establishment, persistence and eradication of the HIV reservoir.</a> Cytokine & Growth Factor Reviews. 23, 143-149 (2012).</li>
<li>Rennard, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+volume+of+epithelial+lining+fluid+recovered+by+lavage+using+urea+as+marker+of+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Estimation of volume of epithelial lining fluid recovered by lavage using urea as marker of dilution.</a> Journal of Applied Physiology (1985). 60, 532-538 (1986).</li>
<li>Twigg, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+highly+active+antiretroviral+therapy+on+viral+burden+in+the+lungs+of+HIV-infected+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Effect of highly active antiretroviral therapy on viral burden in the lungs of HIV-infected subjects.</a> The Journal of Infectious Diseases. 197, 109-116 (2008).</li>
<li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Macrophage+Subpopulations+Characterize+Acute+Infection+and+Chronic+Inflammatory+Lung+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Distinct Macrophage Subpopulations Characterize Acute Infection and Chronic Inflammatory Lung Disease.</a> The Journal of Immunology. 189, 946(2012).</li>
<li>Garn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+aspects+of+flow+cytometric+analysis+of+cells+from+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Specific aspects of flow cytometric analysis of cells from the lung.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 57, 21-24 (2006).</li>
<li>Szaniawski, M. A., Spivak, A. M., Bosque, A., Planelles, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+influences+SAMHD1+activity+and+susceptibility+to+HIV-1+in+primary+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Sex influences SAMHD1 activity and susceptibility to HIV-1 in primary human macrophages.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li>
<li>Avalos, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+Productively+Infected+Monocytes+and+Macrophages+of+Simian+Immunodeficiency+Virus-Infected+Macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Quantitation of Productively Infected Monocytes and Macrophages of Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques.</a> Journal of Virology. 90, 5643-5656 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí describimos un método para procesar el líquido BAL para obtener células T CD4 y AM, junto con PBMCs emparejados, que se pueden estudiar para investigar el reservorio de VIH dentro de los pulmones. Recientemente informamos sobre la cuantificación del ADN del VIH en células T CD4 a partir de muestras de sangre periférica y BAL coincidentes, y nuestro grupo demostró que el VIH es 13 veces más abundante en los glóbulos T CD4 pulmonares que en los de sangre periférica15. Sin embargo, los niveles de ADN del VIH en los malens son dependientes de los donantes y, por lo tanto, hasta ahora, no ha habido una correlación constante entre los niveles de ADN del VIH en los linfocitos en comparación con los macrófagos15. El acceso a estos subconjuntos primarios de células macróforas, sin embargo, será una herramienta vital para interrogar esta pregunta y obtener una mejor comprensión de la carga viral en el pulmón en el contexto del reservorio del VIH.
En la era pre-ART y en varios otros estudios utilizando líquido BAL, los participantes se sometieron a broncoscopia con el fin de diagnosticar una sospecha de patología u obtener un diagnóstico microbiológico de los síntomas respiratorios3. Sin embargo, pudimos reclutar participantes sin ningún síntoma pulmonar activo o patologías y todos los participantes firmaron un formulario de consentimiento ético15. Pudimos reclutar participantes de nuestro centro que participaban en otros estudios, como un estudio de detección de espirometría para la enfermedad pulmonar obstructiva24,así como aquellos sometidos a otros procedimientos de investigación, como la leucoféresis y Colonoscopia. Investigaciones previas entre personas que viven con el VIH demostraron que el altruismo es un factor clave que motiva la participación en estudios de investigación25. Al igual que con muchos especímenes humanos, observamos una gran cantidad de variabilidad de persona a persona. No había manera de "predecir" de qué participantes obtendríamos BAL con rendimientos celulares buenos frente a los pobres. A diferencia de la sangre periférica, que produce un número bastante consistente de linfocitos, los números celulares en el líquido BAL son muy variables. Inyectar un mayor volumen de salina normal en los pulmones (con la esperanza de obtener un mayor retorno del líquido BAL) no siempre es posible, ya que los volúmenes más grandes de salina normal a menudo se asocian con más tos y un mayor riesgo de postbroncoscopia de fiebre. Nos dimos cuenta de que el uso de un broncoscopio de diámetro más pequeño (en lugar de mayor) permitió al relecionólogo llegar más profundamente a los bronquios y obtener líquido que contiene mayores cantidades de células. Un hallazgo consistente fue que los fumadores de tabaco tenían proporciones mucho mayores de AMs que los linfocitos dentro de su líquido BAL, lo que se espera cuando los AM envuelven escombros y partículas. Además, observamos que el líquido BAL de los fumadores contenía desechos que pueden bloquear el equipo utilizado, como las máquinas PCR y los citometros de flujo. Pueden observarse problemas similares en áreas de alta contaminación o en individuos expuestos con mayor frecuencia a la mala calidad del aire.
Con respecto a su papel en el establecimiento de los reservorios del VIH y la persistencia viral, la pureza de los células T CD4 y los AM es una consideración clave. Por esta razón, optamos por utilizar la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para obtener poblaciones celulares altamente puras. También es posible que el líquido BAL recogido pueda estar contaminado con sangre, ya que se espera un sangrado menor durante una broncoscopia; la presencia de células B ingenuas indicaría esto, y las células se pueden lavar en un tampón de lisis de glóbulos rojos para evitar este problema. Otro desafío con el estudio del líquido BAL se relaciona con la cuantificación de marcadores inflamatorios y citoquinas, que son importantes para entender la persistencia del VIH26. Como la salina inculcada diluye el líquido BAL, los niveles de mediadores inflamatorios y citoquinas pueden ser difíciles de medir. Aunque se ha propuesto un factor de corrección de la urea para dar cuenta de la dilución, hay relativamente poca literatura que describa su uso27,28.
Los aMs son altamente autofluorescentes, lo que plantea un problema durante la clasificación celular y el análisis fenotípico de citometría de flujo. En particular, el efecto es más pronunciado en los fumadores cuyos MAL pueden ser completamente de color negro, afectando significativamente a su autofluorescencia. Cuando se excita con un láser azul estándar de 488 nm, la autofluorescencia AM se encuentra en su apogeo en aproximadamente 540 nm, que se superpone con los espectros de fluorescencia de conjugados de uso común como FITC y PE29,30. Vale la pena señalar que dos láseres separados se pueden utilizar para excitar FITC y PE (por ejemplo, PE por el amarillo / verde y FITC por el láser azul 488). Para superar la autofluorescencia inherente con FITC, utilizamos AMs no manchados para determinar el fondo de autofluorescencia. Además, el uso de controles de fluorescencia menos uno (FMO) puede ser muy útil para combatir estos problemas técnicos. Se pueden utilizar perlas más grandes (p. ej., 7,5 m), que son más de tamaño para compensar las poblaciones de macrófagos, en comparación con las cuentas más pequeñas (por ejemplo, 3,0 m), que se pueden utilizar para compensar las poblaciones de linfocitos. Un enfoque aún más adecuado sería utilizar una pequeña fracción de celdas como los controles de una sola mancha, utilizando un marcador conocido y altamente expresado en el subconjunto, como HLA-DR o CD45, conjugado con cada uno de los fluorocromos deseados, lo que permitiría un marcador mucho más compensación precisa que se puede lograr con cuentas. En el caso de las muestras de los fumadores, esta táctica es particularmente útil ya que los macrófagos son mucho más grandes y más autofluorescentes. Además, a partir del paso de preparación, toda la muestra BAL podría ser cultivada en una placa antes de clasificarse como se describe en la sección 3 del protocolo, para permitir una separación de las poblaciones por adherencia. De esta manera, los macrófagos adherentes pueden aislarse de otras células no adherentes como los linfocitos. La compensación es mucho menos difícil si las poblaciones de linfocitos y AM se separan en lugar de examinarse juntas; sin embargo, confiar en la adherencia resultará en una pérdida de macrófagos, lo que es una consideración importante cuando los números de celda ya están limitando. También, un paso de adherencia podría resultar en la activación no deseada de monocitos adherentes, que puede afectar los resultados posteriores generados utilizando estas células. El valor de clasificar eficientemente las células en poblaciones más puras debe sopesarse frente a la restricción de tener menos de estas células para experimentos posteriores.
Otros modelos, sobre todo los modelos murinos, se han utilizado para estudiar las características inmunológicas de los macrófagos y la biología. Aunque estos modelos son extremadamente útiles y permiten una gran visión de un tipo de celda que es difícil de manipular, tienen limitaciones. Muchos de los marcadores de superficie celular varían entre ratones y humanos, de manera que el inmunofenotipo de los MAL humanos no se entiende completamente. Sin embargo, este sistema modelo requiere la agrupación de varios ratones para ensayos debido a los bajos números de celda disponibles de cada animal. Además, la necesidad de agrupar especímenes impide consideraciones de predisposición genética y sexo. Recientemente, se ha demostrado que el sexo juega un papel en la infectividad de los macrófagos por el VIH-1 debido a la expresión dispar del factor de restricción SAMHD-131. Los primates no humanos (NHP) representan el modelo más cercano a los seres humanos y facilitaron el estudio de la infección por el virus de inmunodeficiencia simio (SIV) y su efecto en el sistema inmunitario, proporcionando información sobre el papel de los macrófagos residentes en los tejidos en comparación con macrófagos derivados de monocitos. En los macacos de rhesus, también se ha demostrado que los macrófagos pulmonares se aíslan de BAL albergan un virus competente para la replicación; un ensayo de crecimiento viral (VOA) se utilizó para analizar el comportamiento del SIV en células residentes en tejidos32. Tal hallazgo es de un valor de investigación significativo, pero todavía debe ser validado en los seres humanos antes de que pueda ser aplicado, y el alto costo de usar NCP impide el uso de grandes poblaciones de muestras. Además, los MI humanos serán útiles para muchas otras aplicaciones, como los ensayos de infección viral/microbiana in vitro y en estudios de otros patógenos como la coinfección por tuberculosis/VIH.

Uno de los desafíos más importantes a los que se enfrenta una cura a la infección por el VIH es la presencia del reservorio latente del VIH, que provoca un rebote de la viremia plasmática tras la interrupción de la terapia antirretroviral (ART)1,2. Si bien el reservorio del VIH durante el TAR a largo plazo está bien documentado en varios compartimentos tisulares, incluidos los órganos linfoides secundarios, el tejido linfoide asociado al intestino (GALT) y el sistema nervioso central (SNC), los pulmones se han pasado por alto como un área de estudio desde la era pre-ART3. Sin embargo, los pulmones desempeñan un papel central en la patogénesis del VIH. De hecho, los síntomas pulmonares fueron uno de los primeros indicadores de infecciones oportunistas relacionadas con el SIDA4. Incluso en la era moderna del TAR, las personas con VIH corren un mayor riesgo de desarrollar enfermedades pulmonares infecciosas y no infecciosas que las personas sin VIH. Por ejemplo, las personas con infección por VIH tienen un riesgo elevado de infección invasiva por neumonía estreptocócica, así como de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC)5,6. Además, la coinfección de la tuberculosis (TB) y el VIH es un desafío importante de la salud pública en ciertas regiones del mundo, enparticular en el Africa subsahariana, ya que las personas infectadas por el VIH tienen entre 16 y 27 veces más probabilidades de tener tuberculosis que las personas sin VIH 7. Aunque se han propuesto algunas explicaciones para esta susceptibilidad a la infección pulmonar y a las enfermedades crónicas8,9,10, los mecanismos celulares precisos por los cuales las personas con VIH suprimido la carga viral plasmática sigue teniendo un mayor riesgo de que las complicaciones pulmonares no hayan sido completamente aclaradas. Es importante destacar que el VIH es un factor de riesgo muy fuerte para la infección pulmonar y las enfermedades crónicas, independientemente del estado de tabaquismo6.
Por lo tanto, el análisis del entorno inmunológico del pulmón es crucial para entender su papel en la salud y la enfermedad. Aunque no son invasivas, las muestras de esputo inducidas tienden a contener grandes cantidades de células epiteliales y desechos con linfocitos pulmonares raros y sin AM, limitando su papel a aplicaciones específicas. Por el contrario, no se pueden obtener grandes biopsias de tejido en ausencia de sospecha de enfermedad debido a los riesgos asociados de sangrado significativo y neumotórax (colapso pulmonar). Además, la mayoría de las células inmunitarias pulmonares se encuentran principalmente en el nivel de la mucosa, donde los pulmones son estimulados continuamente por antígenos durante la respiración. Para ello, la broncoscopia para obtener líquido BAL tiene la ventaja de proporcionar un acceso relativamente seguro a linfocitos y amantes (ver Figura 1). Los macrófagos constituyen la mayor proporción de células dentro del líquido BAL, seguidos de los linfocitos11. Por lo tanto, es útil establecer un método mediante el cual el líquido BAL pueda procesarse para su uso en aplicaciones posteriores, como inmunofenotipado, cultivo celular, transcriptomica o cualquier otra aplicación. El protocolo para el procesamiento del fluido BAL descrito aquí está adaptado de los procedimientos generales descritos previamente y optimizados para los diversos ensayos posteriores empleados. Esta metodología permite el aislamiento de las células inmunitarias de la mucosa linfoide pulmonar y mieloide para su caracterización fenotípica y funcional, así como una evaluación del reservorio de VIH en adultos que viven con vih.
Para establecer este protocolo, utilizamos los siguientes criterios para reclutar participantes del estudio15. Para que los participantes pudieran participar en este estudio, tenían que ser personas infectadas por el VIH que cumplieran los siguientes criterios: (1) sobre TAR durante al menos 3 años; (2) la carga viral suprimida (VL) durante un mínimo de 3 años; (3) Recuento de células T CD4 de 200/mm3; (4) dispuestoa a someterse a la espirometría de investigación y la broncoscopia. Los pacientes con los siguientes criterios fueron excluidos del estudio: (1) contraindicación(es) a broncoscopia; 2) alto riesgo de sangrado: coagulopatía o en terapia con warfarina o clopidogrel; (3) trombocitopenia (plaquetas bajas); (4) infección pulmonar activa u otro proceso pulmónico agudo; (5) embarazada/intentando quedar embarazada.

<table><tbody><tr><td>70 y micro; m Filtro de células estériles</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td>Filtros de malla de nailon con 70 y micro; m poros para eliminar las impurezas de la muestra de BAL antes de clasificar</td></tr><tr><td>las células ACH-2</td><td>NIH</td><td>349</td><td>clon de células T latentes del VIH-1 con una copia proviral integrada que no expresan CD4</td></tr><tr><td>BD FACSAria</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>Clasificador de células (configurado para detectar 16 colores simultáneamente)</td></tr><tr><td>BD LSRFortessa X-20</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A&nbsp;</td><td>Citómetro de flujo (configurado para detectar 14 colores simultáneamente)</td></tr><tr><td>Broncoscopio</td><td>Olympus</td><td>BF-1TH190&nbsp;</td><td>Broncoscopio terapéutico EEIII HD; ancho de canal 2,8 mm; diámetro exterior 6,0 mm</td></tr><tr><td>Solución de disociación celular</td><td>Sigma</td><td>C5914&nbsp;</td><td>Formulación no enzimática para desalojar suavemente los tipos de células adherentes de las superficies de plástico o vidrio.</td></tr><tr><td>CD169&nbsp; BB515</td><td>BD Biosciences</td><td>565353</td><td>Anticuerpo de molécula de unión al ácido siálico utilizado para citometría de flujo</td></tr><tr><td>CD14&nbsp; BV786</td><td>BD Biosciences</td><td>563698</td><td>Anticuerpo receptor de endotoxinas utilizado para citometría de flujo</td></tr><tr><td>CD206&nbsp; PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555954</td><td>Anticuerpo receptor de manosa utilizado para citometría de flujo</td></tr><tr><td>CD3&nbsp; Alexa700</td><td>BD Biosciences</td><td>557943</td><td>anticuerpo correceptor de células T utilizado para citometría de flujo</td></tr><tr><td>CD4&nbsp; PE-Cy5</td><td>BD Biosciences</td><td>555348</td><td>anticuerpo correceptor de células T utilizado para citometría de flujo</td></tr><tr><td>CD45&nbsp; PE Cy-7</td><td>BD Biosciences</td><td>557748</td><td>Anticuerpo de proteína tirosina fosfatasa ligado al receptor utilizado para la citometría de flujo</td></tr><tr><td>CD8&nbsp; BV605</td><td>BD Biosciences</td><td>564116</td><td>anticuerpo correceptor de células T utilizado para citometría de flujo</td></tr><tr><td>CompBead Plus</td><td>BD</td><td>560497</td><td>Anti-ratón&nbsp; Ig, &kappa; &nbsp; y micropartículas de poliestireno de control negativo utilizadas para optimizar la compensación de fluorescencia en citometría de flujo</td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>Invitrogen</td><td>18068015</td><td>digiere ADN monocatenario y bicatenario a oligodexiribonuleotides que contienen un fosfato 5' para eliminar la contaminación del ARN</td></tr><tr><td>dNTP Set 100 mM</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; 10297-018</td><td>Consta de cuatro desoxinucleótidos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) para su uso en PCR</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>&nbsp; Disolvente apolar y prótico utilizado para fabricar medios para la criopreservación de células vivas</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9912</td><td>Se utiliza para detener la actividad de la enzima Dnasa I</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>080-150</td><td>Suero fetal bovino de primera calidad para complementar los medios</td></tr><tr><td>Reactivo bloqueante FcR, humano</td><td>Miltenyi</td><td>130-059-901</td><td>Se une al receptor Fc en la superficie celular para evitar la unión inespecífica de los anticuerpos</td></tr> <tr><td>de flujoFlowJo v10</td><td>FlowJo LLC</td><td>N/A</td><td>Software de análisis de citometría de flujo utilizado para todos los análisis</td></tr><tr><td>HLA-DR&nbsp; BV650</td><td>BD Biosciences</td><td>564231</td><td>MHC anticuerpo receptor de superficie celular de clase II utilizado para citometría de flujo</td></tr><tr><td>HyClone solución HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3023701</td><td>Buffer que proporciona mantenimiento del pH fisiológico&nbsp;</td></tr><tr><td>Vivo/Muerto&nbsp; APC-H7</td><td>Invitrogen</td><td>L34975</td><td>Marcador de viabilidad utilizado para la citometría de flujo</td></tr><tr><td>Medio de separación de linfocitos (LSM)</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>350-000-CL</td><td>Polisacarosa para el aislamiento de PBMC de sangre total</td></tr><tr><td>Contenedor de congelación Mr. Frosty</td><td>ThermoFisher</td><td>5100-0001</td><td>Contenedor de congelación que garantiza una velocidad de enfriamiento muy cercana a -1 &deg; C/min, la tasa óptima para la preservación</td></tr><tr>celular<td>OneComp eBeads</td><td>Invitrogen</td><td>01-1111-41</td><td>Anticuerpos anti-ratón, rata y hámster para la compensación de muestras de PBMC</td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>311-010-CL</td><td>Solución salina tamponada con fosfato para el lavado y la tinción de células</td></tr><tr><td>Tubos de PCR Corbett Rotor-Gene</td><td>Axygen</td><td>PCR-0104-C</td><td>Tubos de PCR de 4 tiras con capacidad de 0,1 mL para su uso con Corbett Rotor-Gene</td></tr><tr><td>PerfeCTa qPCR ToughMix</td><td>Quantabio</td><td>95112</td><td>2x cóctel de reacción concentrado listo para usar para la amplificación por PCR de plantillas de ADN&nbsp;</td></tr><tr><td>QiaAmp DNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td>Kit para el aislamiento de ADN genómico, mitocondrial, bacteriano, parasitario o viral. Incluye QIAamp Mini Columnas de Centrifugado, QIAGEN Proteinasa K, Reactivos, Tampones, Tubos de Recolección</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Kit para la purificación de hasta 100 &micro; g de ARN total de células, tejidos y levaduras. Incluye Mini columnas de centrifugado RNeasy, tubos de recolección, reactivos y tampones sin RNasa</td></tr><tr><td>Rotor-Gene Q</td><td>Qiagen</td><td>9001550</td><td>Cíclicor de PCR en tiempo real</td></tr><tr><td>RPMI 1640 1x</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>350-000-CL Medios de</td><td>cultivo celular</td></tr><tr><td>Agua estéril</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>809-115-CL Libre de</td><td>DNasa, RNasa y proteasa</td></tr><tr><td>Superscript&trade; III Sistema RT-PCR de un solo paso&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>12574018</td><td>kit de RT-PCR que realiza tanto la síntesis de ADNc como la amplificación de PCR en un solo tubo. Incluye SuperScript III RT/Platinum Taq Mix, 2x Reaction Mix (que contiene 0,4 mM de cada dNTP, 3,2 mM de MgSO4), sulfato de magnesio</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerasa&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18038-042</td><td>Enzima termoestable que sintetiza ADN a partir de plantillas monocatenarias en presencia de dNTPs y un cebador. Incluye ADN polimerasa Taq, tampón PCR 10x, cloruro de magnesio,</td></tr><tr><td>conjunto de tampones de factor de transcripción</td>, <td>tampones de 562725 BD Biosciences</td><td></td><td>para tinción intracelular para citometría de flujo. Incluye tampón de fijación/permeabilización, tampón diluyente, tampón de permanente/lavado</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>Colorante de viabilidad para contar células mediante hematocitómetro&nbsp;</td></tr></tbody></table>

procesamiento de líquido de lavado broncoalveolar y sangre emparejada para macrófago alveolar y cd4+ inmunofenotipado de células t y evaluación del embalse de vih

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

La broncoscopia es un procedimiento médico por el cual se inyecta salina normal en los pulmones a través de un broncoscopio y luego se aplica la succión, eliminando el líquido de lavado broncoalveolar (BAL). El líquido BAL es rico en células y, por lo tanto, puede proporcionar una "instantánea" del entorno inmunológico pulmonar. Los cd4 t son los reservorios de VIH mejor caracterizados, mientras que hay pruebas sólidas que sugieren que los macrófagos tisulares, incluidos los macrófagos alveolares (AM), también sirven como reservorios virales. Sin embargo, todavía se desconoce mucho sobre el papel de los hombres de aMe en el contexto del establecimiento y el mantenimiento de los embalses de VIH. Por lo tanto, el desarrollo de un protocolo para procesar el líquido BAL para obtener células que pueden ser utilizadas en ensayos virológicos e inmunológicos para caracterizar y evaluar las poblaciones celulares y subconjuntos dentro del pulmón es relevante para entender el papel de los pulmones como VIH Embalses. Aquí, describimos este protocolo, empleando técnicas estándar como la centrifugación simple y la citometría de flujo. Las células T CD4 y los AM pueden utilizarse para aplicaciones posteriores, incluidos el inmunofenotipado y la cuantificación del ADN y ARN del VIH.

En la mayoría de los no fumadores, el líquido BAL se recibe en un recipiente estéril y es un líquido ligeramente turbio de color amarillo-naranja. El líquido puede ser de color más rosado si el donante se sometió a biopsias endobronquiales durante la broncoscopia y se produjo algo de sangrado. El líquido puede ser de color más oscuro si el donante es fumador. Después de la centrifugación, el sobrenadante BAL será casi claro y ligeramente naranja, mientras que el pellet celular puede variar en color de blanquecino a marrón muy oscuro, dependiendo de la condición de la muestra y si el donante era fumador o no.
Al contar toda la muestra de BAL, se pueden visualizar diferentes tipos de células, incluyendo macrófagos más grandes y redondos de alrededor de 17 m de diámetro y linfocitos redondos más pequeños de alrededor de 7,3 m de diámetro18,19 (ver Figura 2). Los macrófagos se agrandan en los fumadores en aproximadamente un 40%18. La distinción entre los tipos de células permite contar los macrófagos y linfocitos por separado. También puede haber algunos desechos visibles en el campo, especialmente en muestras de fumadores. Los macrófagos son el tipo celular más abundante en el BAL, representando aproximadamente el 85% de las células en los no fumadores20,y están enriquecidos en fumadores por lo que pueden parecer casi exclusivos.
Las células BAL tienen una tendencia a agregar, por lo que deben mezclarse bien durante todas las manipulaciones. El pellet puede aparecer oscuro incluso después de varios pasos de lavado. Si los desechos filamentosos son evidentes en la fracción después de la tinción para la clasificación celular, pase las células a través de un filtro de 70 m antes de ejecutarlas a través del clasificador de células.
La clasificación de las células BAL debe realizarse a baja presión para garantizar tamaños de gotas lo suficientemente grandes como para acomodar los macrófagos. Las celdas se bloquean primero para incluir todas las celdas CD45+21 y, a continuación, se basan en la viabilidad para asegurarse de que se excluyen todas las celdas muertas (consulte la figura3). A continuación, se eligen células singlet y, dentro de esta, dos poblaciones se agaran en función del tamaño y la morfología, a saber, células mieloides más grandes y linfocitos más pequeños (ver Figura 3). Dentro de las células más grandes, las células se anegan en CD20622,23 y CD16922 y las celdas doble-positivas se ordenan como AMs, mientras que dentro de las células más pequeñas, CD3+ las células se eligen y se anegan en CD4 y CD8; Las células unipositivas y CD8 de CD4 se ordenan (consulte la figura 3). Los marcadores utilizados se eligieron sobre la base de fenotipos descritos previamente de los AMs, como el receptor de la nonósa CD206, que se encuentra en las células fagocíticas23,y el receptor de sialoadhesina CD16922.
Al clasificar los PPM, las células se cierran primero en dispersión hacia adelante y lateral, lo que debe mostrar una población de linfocitos homogénea, todos los cuales se toman, excluyendo el ruido cerca del eje cero (datos no mostrados). La población está cerrada en viabilidad y CD45, y se utilizan células CD45+ en vivo. Esta población se cierra entonces en CD3; para aislar a los monocitos, la población CD3- se cierra posteriormente en CD14 y todas las células positivas individuales se clasifican. Para aislar los subconjuntos de linfocitos, las células CD3+ están cerradas en CD4 y CD8 y se ordenan las poblaciones positivas y celulares.
<img alt="Diagrama de aislamiento de células pulmonares y sanguíneas para el análisis de reservorios de VIH mediante el método de PCR ultrasensible." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1 : Visión general del protocolo. Esquema que muestra el flujo de trabajo del protocolo, incluidos los posibles usos posteriores de los ejemplos generados. PBMC - células mononucleares de sangre periférica; BAL - lavado broncoalveolar; LSM - medio de separación de linfocitos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Imagen de microscopio de frotis de sangre que muestra leucocitos (L), monocitos (M) y glóbulos rojos (RBC)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2 : Vista de campo del microscopio de todo el líquido BAL. Imágenes de microscopio de (A) un no fumador y (B) un fumador con linfocitos visibles (L), macrófagos (M) y glóbulos rojos (RBC). La ampliación es de 1.000x (10x ocular y 100x lente con inmersión en aceite). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Diagrama de citometría de flujo, activación de la población celular, marcadores: CD45, CD3, CD4, CD8, CD169, CD206." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3 : Estrategia de gating representativa para la clasificación celular de células BAL enteras. Estrategia de gating utilizada para clasificar los macrófagos alveolares (AM), CD4 y CD8 T de muestras de células BAL enteras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Muestra</td>
			<td>Anticuerpo</td>
			<td>Fluorocromo</td>
			<td>Clon</td>
			<td>Volumen por prueba (L)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">BAL y PBMC</td>
			<td>Live/Dead</td>
			<td>APC-H7</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>PE-Cy7</td>
			<td>HI30</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>Alexa700</td>
			<td>UCHT1</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4</td>
			<td>PE-cy5</td>
			<td>RPA-T4</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>BV605</td>
			<td>SK1</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>SÓLO BAL</td>
			<td>CD206</td>
			<td>Pe</td>
			<td>19.2</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>CD169</td>
			<td>BB515</td>
			<td>7-239</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sólo PBMC</td>
			<td>CD14</td>
			<td>BV786</td>
			<td>M5E2</td>
			<td>5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Panel de flujo para la clasificación de células BAL enteras y PMI aislados.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Objetivo</td>
			<td>Paso</td>
			<td>Primer nombre</td>
			<td colspan="4">Secuencia de primer</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">VIH ADN total o ARN LTR-Gag del VIH</td>
			<td>PCR de preamplificación</td>
			<td>UR1</td>
			<td colspan="4">5'-CCA TCT CTC TCC TTC TAG C-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Ulf1</td>
			<td colspan="4">5'-ATG CCA CGT AAG CGA AAC TCT GGG TCT CTC TGG TTA GAC-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>PCR en tiempo real</td>
			<td>UR2</td>
			<td colspan="4">5'-CTG AGG GAT CTC TAG TTA CC-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>LambdaT</td>
			<td colspan="4">5'-ATG CCA CGT AAG CGA AAC T-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>FamZen de UHIV:</td>
			<td colspan="4">5'-/56-FAM/CA CTC AAG G/ZEN/C AAG CTT TAT TGA GGC/3IABkFQ/-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>ADN CD3</td>
			<td>PCR de preamplificación</td>
			<td>HCD3 fuera 5'</td>
			<td colspan="4">5'-ACT GAC ATG GAA CAG GGG AAG-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>HCD3 fuera 3'</td>
			<td colspan="4">5'-CCA GCT CTG AAG TAG GGA ACA TAT-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>PCR en tiempo real</td>
			<td>HCD3 en 5'</td>
			<td colspan="4">5'-GGC TAT CAT TCT TCT TCA AGG T-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>HCD 3 en 3'</td>
			<td colspan="4">5'-CCT CTC TTC AGC CAT TTA AGT A-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>CD3 FamZen:</td>
			<td colspan="4">5'-/56-FAM/AG CAG AGA A/ZEN/C AGT TAA GAG CCT CCA T/3IABkFQ/-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>ARN GUSB</td>
			<td>PCR de preamplificación</td>
			<td>GUSB Forward 1:</td>
			<td colspan="4">5'-ACC TAG AAT CTG CTG GCT ACT A-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>GUSB Inverso 1:</td>
			<td colspan="4">5'- GTT CAA ACA GAT CAC ATC CAC ATA C-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>PCR en tiempo real</td>
			<td>GUSB Forward 2:</td>
			<td colspan="4">5'-TGC TGG CTA CTA CTT GAA GAT G-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>GUSB Inverso 2:</td>
			<td colspan="4">5'- CCT TGT CTG CTG CAT AGT TAG A-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>GUSB-HEX:</td>
			<td colspan="4">5'-/5HEX/TCGCTCACA/ZEN/CCAAATCCTTGGACC/3IABkFQ/-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Secuencias de imprimación y sonda para la cuantificación del ADN del VIH y el ARN.

Describimos un método para procesar el líquido de lavado broncoalveolar y la sangre periférica emparejada de individuos infectados crónicamente por el VIH en terapia antirretroviral para evaluar los reservorios pulmonares del VIH. Estos métodos dan lugar a la adquisición de células T CD4 altamente puras y macrófagos alveolares que posteriormente pueden utilizarse para inmunofenotipado y cuantificaciones de ADN/ARN de VIH por reacción en cadena de polimerasa ultrasensible.

Procesamiento de líquido de lavado broncoalveolar y sangre emparejada para macrófago alveolar y CD4+ inmunofenotipado de células T y evaluación del embalse de VIH

Bronchoscopy is a medical procedure whereby normal saline is injected into the lungs via a bronchoscope and then suction is applied, removing ...

El VIH es incurable debido a su persistencia en reservorios celulares y anatómicos. Este método permite una evaluación del depósito del VIH de células inmunitarias aisladas de los pulmones. Esta técnica permite el aislamiento de células T mucosas pulmonares y macrófagos alveolares del líquido BAL para una evaluación más fenotípica o virológica como reservorios celulares del VIH.Comprender la biología de los macrófagos alveolares y las células T CD4 positivas y su contribución al reservorio del VIH podría conducir a información importante sobre los desafíos que enfrentan una cura para el VIH. El aislamiento de los macrófagos primarios de LA BAL se puede aplicar a varias otras áreas de investigación, incluidas las enfermedades pulmonares inflamatorias o infecciosas como el asma y la tuberculosis. Después de obtener el líquido BAL de un paciente humano de acuerdo con los protocolos estándar, vórtice el líquido en el tubo de recogida original antes de transferir la muestra a un tubo de 50 mililitros dentro de un gabinete de bioseguridad.Si el líquido parece muy turbio o contaminado por tejido filamentoso, filtre la muestra a través de un filtro de malla de nylon de 70 micrómetros en un nuevo tubo de 50 mililitros. Después de la centrifugación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 50 mililitros y utilice una punta de pipeta para romper suavemente el pellet que contiene todas las células BAL. Resuspender el pellet en un mililitro de RPMI 1640 medio y añadir un mililitro del sobrenadante reservado de cada uno de 10 tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros.Agregue alícuotas de 10 mililitros del sobrenadante restante en tubos cónicos de 15 mililitros y coloque todas las muestras sobrenadantes en el almacenamiento de menos 80 grados centígrados. Diluir la suspensión de la célula de pellets en 10 mililitros de medio por cada 25 mililitros de muestra original y recoger las células BAL por centrifugación. A continuación, resuspender el pellet en un mililitro de medio complementado con 10%suero bovino fetal, o FBS, para el recuento.Para la clasificación de células mononucleares enteras de BAL y sangre periférica, agregue cinco veces 10 a las cinco células a cada uno de dos tubos de poliestireno de fondo redondo de cinco mililitros por subconjunto para los controles de compensación no manchados y manchados de viabilidad y agregue el resto de cada muestra de subconjunto en un tubo de cinco mililitros por muestra. Recoger las células por centrifugación y resuspender los pellets de control en 100 microlitros de PBS por tubo en hielo hasta que se utilicen. Resuspender los pellets de las células para la clasificación en 250 microlitros de una de cada 20 dilución del búfer de bloqueo del receptor Fc durante una hora a cuatro grados centígrados para bloquear cualquier unión no específica.Al final de la incubación de bloqueo, agregue el cóctel de anticuerpos adecuado de interés para una incubación adicional de una hora a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación primaria de anticuerpos, agregue un mililitro de PBS a cada tubo para la centrifugación y resusppend los pellets en 250 microlitros de tampón de clasificación en hielo protegido de la luz hasta la clasificación. Para preparar los controles de compensación, añada tres gotas cada una de las cuentas de compensación kappa de inmunoglobulina antiratón y las cuentas de compensación de control negativo por mililitro de PBS a un tubo de microcentrífuga y transfiera 100 microlitros de la solución de cuentas a cada muestra que se utilizará para la compensación.Agregue un microlitro de cada anticuerpo en el cóctel a cada tubo separado que contenga perlas y agregue un microlitro de mancha de viabilidad a cada tubo de control de compensación de manchas de viabilidad. Después de 20 minutos a cuatro grados centígrados protegidos de la luz, lave las muestras con un mililitro de PBS por tubo y resusppend los pellets en 250 microlitros de PBS fresco por tubo. Cargue la muestra de control sin mancha de la célula completa-BAL en el citómetro de flujo y configure la matriz de compensación.A continuación, cargue el tubo de muestra y clasifre las células a baja presión, gating para excluir el ruido, para incluir celdas vivas y CD45 positivas, y para excluir los dobletes. Dentro de la población mieloide más grande, clasifre las células de doble positivo CD206 y CD169 como macrófagos alveolares. Dentro de la población más pequeña de linfocitos, aísle las células CD3 positivas y clasifre las poblaciones de CD4 y CD8 de un solo positivo.Para ordenar la muestra de célula mononuclear de sangre periférica, puerta para excluir el ruido y dobletes e incluir las células CD45-positivas en vivo como se ha demostrado. Después de subir a CD3, acote las células CD3 negativas, CD14 positivas para clasificar los monocitos monopositivos positivos y acote las células CD3 positivas, CD4 y CD8 positivas para clasificar ambas poblaciones de un solo positivo positivo. Al contar toda la muestra de BAL, se pueden visualizar diferentes tipos de células, incluidos los macrófagos más grandes y redondos y los linfocitos más pequeños y redondos.Los macrófagos son el tipo de célula más abundante en el fluido BAL, representando aproximadamente el 85% de las células en los pulmones no fumadores. Estas células se enriquecen en fumadores hasta el punto de parecer casi exclusivas y tienden a ser ampliadas en aproximadamente un 40% en comparación con los macrófagos observados en los no fumadores. Los marcadores utilizados para la clasificación de macrófagos alveolares de muestras de fluidos BAL se eligieron sobre la base de fenotipos descritos previamente de macrófagos alveolares, como el receptor de manosa CD206 que está presente en las células fagocíticas y el receptor de sialoadhesina CD169.Después de su aislamiento, los macrófagos alveolares y otros tipos de células se pueden utilizar para el inmunofenotipado por citometría de flujo, ensayos funcionales inmunológicos o cuantificación de reservorios por PCR ultrasensible. Esta técnica permite el acceso a macrófagos altamente puros residentes en tejidos, que históricamente han sido difíciles de alcanzar, permitiendo el examen inalcanzable de la población significativa de células inmunitarias.

processing-bronchoalveolar-lavage-fluid-matched-blood-for-alveolar

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Tregs son supresores potentes del sistema inmune. Hay una falta de marcadores de superficie única para definir, por lo tanto, las definiciones de células T reguladoras son principalmente funcionales. A continuación se describe un...

Humano In Vitro Supresión como herramienta de cribado para el reconocimiento de un estado inicial de desequilibrio inmunológico

Se describe una técnica de investigación para la fibrobroncoscopia y el lavado broncoalveolar mediante succión baja presión. La técnica se utiliza para cosechar células inmunes de las superficies broncoalveolar de pulmón. Se utiliza anestesia local y sedación consciente leve (midazolam). Los sujetos toleran bien el procedimiento y experimentan efectos secundarios mínimos.

Lavado broncoalveolar (BAL) de Investigación; obtención de rendimiento adecuado de la muestra

Este video demuestra el uso de la citometría de flujo para identificar y contar varias células inmunitarias en el líquido de lavado broncoalveolar. Inicialmente, las células inmunitarias individuales se identifican utilizando un colorante de viabilidad, seguido de la tinción diferencial de las proteínas marcadoras de superficie, lo que permite la enumeración precisa de cada tipo de célula.

Identificación y enumeración de células inmunitarias en líquido de lavado broncoalveolar mediante citometría de flujo

Hemos desarrollado un ensayo in vitro para investigar el papel de las vías inmunorreguladoras en la regulación de la secreción de citoquinas por las células-T CD4 específicas del VIH.

Ensayo in vitro para evaluar el impacto de inmunoreguladoras Caminos de CD4 T función específica para el VIH efector celular

La respuesta inmune del huésped a la infección por patógenos es un proceso estrechamente regulado. Utilizando un modelo de exposición de pulmón lipopolisacárido en los ratones, es posible llevar a cabo las evaluaciones de alta resolución de los complejos mecanismos asociados con la patogénesis de la enfermedad.

La utilización de la orofaringe Intratraqueal PAMP Administración y lavado broncoalveolar para evaluar el anfitrión respuesta inmune en ratones

Un método para evaluar la capacidad de los macrófagos alveolares aislados de ratón para controlar el crecimiento de esporas de Aspergillus fagocitados por microscopía confocal.

La evaluación de la actividad anti-fúngica de aislados macrófagos alveolares por microscopía confocal

Aquí describimos el modelo y el enfoque para estudiar las funciones de los macrófagos alveolares pulmonares en la metástasis del cáncer. Para demostrar el papel de estas células en la metástasis, se utilizó el modelo singénico (4T1) de cáncer de mama junto con la depleción de macrófagos alveolares con liposomas de clodronato.

El estudio de la función de los macrófagos alveolares en cáncer de mama metástasis

El estado de salud de los pulmones se refleja por el tipo y número de células inmunitarias que están presentes en los bronquiolos del pulmón. Se describe una técnica de lavado broncoalveolar que permite el aislamiento y estudio de las células no adherentes y factores solubles en el tracto respiratorio inferior de los ratones.

Lavado broncoalveolar de los pulmones murinos para analizar infiltración de células inflamatorias

Esta comunicación describe modelos murinos para los propósitos experimentales y metodologías para el aislamiento y cultivo de macrófagos alveolares de los seres humanos.

Aislamiento y cultivo In Vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos

La leche materna transmite el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), aunque sólo el 15 % de los lactantes amamantados por madres infectadas por el VIH se infectan. Los lactantes amamantados ingieres diariamente de 105x 108 leucocitos maternos, aunque estas células están poco estudiadas. Aquí describimos el aislamiento de los leucocitos de la leche materna y un análisis de su capacidad fagocítica.

Aislamiento de leucocitos de la leche materna humana para su uso en un ensayo de fagococitosis celular dependiente de anticuerpos de metas de VIH

Aprende a procesar líquido de lavado broncoalveolar y sangre emparejada para aislar macrófagos alveolares y células T CD4+. Este método permite evaluar reservorios pulmonares de VIH mediante inmunofenotipado y PCR ultrasensible.

Procesamiento de líquido de lavado broncoalveolar y sangre emparejada para macrófago alveolar y CD4+ inmunofenotipado de células T y evaluación del embalse de VIH (Video) | JoVE Journal

Procesamiento de líquido de lavado broncoalveolar y sangre emparejada para macrófago alveolar y CD4⁺ inmunofenotipado de células T y evaluación del embalse de VIH

Explorar más videos