Procesamiento de líquido de lavado broncoalveolar y sangre emparejada para macrófago alveolar y CD4+ inmunofenotipado de células T y evaluación del embalse de VIH

El VIH es incurable debido a su persistencia en reservorios celulares y anatómicos. Este método permite una evaluación del depósito del VIH de células inmunitarias aisladas de los pulmones. Esta técnica permite el aislamiento de células T mucosas pulmonares y macrófagos alveolares del líquido BAL para una evaluación más fenotípica o virológica como reservorios celulares del VIH.

Comprender la biología de los macrófagos alveolares y las células T CD4 positivas y su contribución al reservorio del VIH podría conducir a información importante sobre los desafíos que enfrentan una cura para el VIH. El aislamiento de los macrófagos primarios de LA BAL se puede aplicar a varias otras áreas de investigación, incluidas las enfermedades pulmonares inflamatorias o infecciosas como el asma y la tuberculosis. Después de obtener el líquido BAL de un paciente humano de acuerdo con los protocolos estándar, vórtice el líquido en el tubo de recogida original antes de transferir la muestra a un tubo de 50 mililitros dentro de un gabinete de bioseguridad.

Si el líquido parece muy turbio o contaminado por tejido filamentoso, filtre la muestra a través de un filtro de malla de nylon de 70 micrómetros en un nuevo tubo de 50 mililitros. Después de la centrifugación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 50 mililitros y utilice una punta de pipeta para romper suavemente el pellet que contiene todas las células BAL. Resuspender el pellet en un mililitro de RPMI 1640 medio y añadir un mililitro del sobrenadante reservado de cada uno de 10 tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Agregue alícuotas de 10 mililitros del sobrenadante restante en tubos cónicos de 15 mililitros y coloque todas las muestras sobrenadantes en el almacenamiento de menos 80 grados centígrados. Diluir la suspensión de la célula de pellets en 10 mililitros de medio por cada 25 mililitros de muestra original y recoger las células BAL por centrifugación. A continuación, resuspender el pellet en un mililitro de medio complementado con 10%suero bovino fetal, o FBS, para el recuento.

Para la clasificación de células mononucleares enteras de BAL y sangre periférica, agregue cinco veces 10 a las cinco células a cada uno de dos tubos de poliestireno de fondo redondo de cinco mililitros por subconjunto para los controles de compensación no manchados y manchados de viabilidad y agregue el resto de cada muestra de subconjunto en un tubo de cinco mililitros por muestra. Recoger las células por centrifugación y resuspender los pellets de control en 100 microlitros de PBS por tubo en hielo hasta que se utilicen. Resuspender los pellets de las células para la clasificación en 250 microlitros de una de cada 20 dilución del búfer de bloqueo del receptor Fc durante una hora a cuatro grados centígrados para bloquear cualquier unión no específica.

Al final de la incubación de bloqueo, agregue el cóctel de anticuerpos adecuado de interés para una incubación adicional de una hora a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación primaria de anticuerpos, agregue un mililitro de PBS a cada tubo para la centrifugación y resusppend los pellets en 250 microlitros de tampón de clasificación en hielo protegido de la luz hasta la clasificación. Para preparar los controles de compensación, añada tres gotas cada una de las cuentas de compensación kappa de inmunoglobulina antiratón y las cuentas de compensación de control negativo por mililitro de PBS a un tubo de microcentrífuga y transfiera 100 microlitros de la solución de cuentas a cada muestra que se utilizará para la compensación.

Agregue un microlitro de cada anticuerpo en el cóctel a cada tubo separado que contenga perlas y agregue un microlitro de mancha de viabilidad a cada tubo de control de compensación de manchas de viabilidad. Después de 20 minutos a cuatro grados centígrados protegidos de la luz, lave las muestras con un mililitro de PBS por tubo y resusppend los pellets en 250 microlitros de PBS fresco por tubo. Cargue la muestra de control sin mancha de la célula completa-BAL en el citómetro de flujo y configure la matriz de compensación.

A continuación, cargue el tubo de muestra y clasifre las células a baja presión, gating para excluir el ruido, para incluir celdas vivas y CD45 positivas, y para excluir los dobletes. Dentro de la población mieloide más grande, clasifre las células de doble positivo CD206 y CD169 como macrófagos alveolares. Dentro de la población más pequeña de linfocitos, aísle las células CD3 positivas y clasifre las poblaciones de CD4 y CD8 de un solo positivo.

Para ordenar la muestra de célula mononuclear de sangre periférica, puerta para excluir el ruido y dobletes e incluir las células CD45-positivas en vivo como se ha demostrado. Después de subir a CD3, acote las células CD3 negativas, CD14 positivas para clasificar los monocitos monopositivos positivos y acote las células CD3 positivas, CD4 y CD8 positivas para clasificar ambas poblaciones de un solo positivo positivo. Al contar toda la muestra de BAL, se pueden visualizar diferentes tipos de células, incluidos los macrófagos más grandes y redondos y los linfocitos más pequeños y redondos.

Los macrófagos son el tipo de célula más abundante en el fluido BAL, representando aproximadamente el 85% de las células en los pulmones no fumadores. Estas células se enriquecen en fumadores hasta el punto de parecer casi exclusivas y tienden a ser ampliadas en aproximadamente un 40% en comparación con los macrófagos observados en los no fumadores. Los marcadores utilizados para la clasificación de macrófagos alveolares de muestras de fluidos BAL se eligieron sobre la base de fenotipos descritos previamente de macrófagos alveolares, como el receptor de manosa CD206 que está presente en las células fagocíticas y el receptor de sialoadhesina CD169.

Después de su aislamiento, los macrófagos alveolares y otros tipos de células se pueden utilizar para el inmunofenotipado por citometría de flujo, ensayos funcionales inmunológicos o cuantificación de reservorios por PCR ultrasensible. Esta técnica permite el acceso a macrófagos altamente puros residentes en tejidos, que históricamente han sido difíciles de alcanzar, permitiendo el examen inalcanzable de la población significativa de células inmunitarias.