Tecnología CRISPR/Cas9 en la restauración de la expresión de distrofina en progenitores musculares derivados de iPSC

Duchenne es una distrofia muscular que causa agotamiento prematuro de las células progenitoras musculares. Es una de las distrofias musculares más graves. Para promover una regeneración muscular funcional, utilizamos la edición de genes mediado por CRISPR/Cas9 para restaurar la expresión de distrofina en células progenitoras musculares derivadas de células madre pluripotentes inducidas.

La edición del gen CRISPR-Cas9 tiene el potencial de restaurar la expresión génica de la distrofina. Las células progenitoras musculares derivadas de iPSC autólogos pueden reponer el poro de las células madre, reparar el daño y prevenir complicaciones adicionales en la DMD sin causar una respuesta inmunitaria. Diferentes agentes de células iPS en células progenitoras miogénicas redujeron el riesgo de regénesis tumoral en las células iPS.

Varias terapias que combinan células progenitoras musculares derivadas de células madre inducidas inducidas por autólogos con corrección genética mediada por CRISPR-Cas9 están prometiendo estrategias de tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne. Esta tecnología se puede utilizar para tratar muchas enfermedades congénitas mediante la edición genética de células madre autólogas, incluyendo el corazón, el cerebro y las enfermedades de la sangre. Mostramos que la demostración de este enfoque puede proporcionar a los lectores experiencia en el manejo de la reprogramación celular y la edición de genes, lo que sigue siendo un desafío.

Bajo un microscopio invertido, examine las colonias de células madre embrionarias de ratón infectadas. Marque las colonias en la parte inferior del plato con el marcador de objeto autointinuada. Aplique anillos de clonación engrasados para cubrir las colonias celulares marcadas.

Agregue 100 microlitros de 0.05%Trypsin-EDTA a cada anillo de clonación y coloque la placa en una incubadora a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Luego, transfiera las células digeridas con puntas de pipeta de 100 microlitros a placas de cultivo de 48 pozos que contengan 250 mililitros de medio de crecimiento MES. Incubar las células en la incubadora de 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono y 85% de humedad.

Cuando leen 70%confluencia, seleccione los pozos con células bien cultivadas y agregue 250 mililitros de solución TVP para digerir durante 30 minutos. Luego, transfiera el cultivo celular de cada pozo a un plato de seis centímetros. Repita la aplicación de anillos de clonación e incubación varias veces hasta obtener clones uniformes en forma de dormitorio.

Ahora, digiere los iPSC de ratón preparados agregando un mililitro de solución TVP. Transfiera el cultivo celular a una placa de 24 pozos recubierta con Fibronectina y Gelatina e incubar a 37 grados celsius con 5% de dióxido de carbono. Después de que las células alcancen el 50% de confluencia, cambie a 500 microlitros de medio de cultivo fresco que contienen ocho microgramos por mililitro de polibrene.

A continuación, añada 100 microlitros de la solución de partículas lentivirales a los iPSC del ratón. Incubar las células durante tres días a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. A continuación, determinar la concentración mínima de Blasticidin y Hygromicina B que está a la mitad de la tasa de muerte dentro de 24 horas.

Agregue el medio de 2,5 microgramos por mililitro Blasticidin y 100 microgramos por mililitro de higromicina B a las células, espere tres días y seleccione las células que permanecen adherentes como células infectadas estables. Digerir los iPSC de ratón seleccionados con 0,5 mililitros de solución TVP, cada uno en una nueva placa de 24 pocillos, e incubar las células durante 30 minutos a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Luego, pipetee los iPSC en celdas individuales y cuente las células con una cámara de conteo de células.

Seleccione alrededor de 150 células individuales digeridas y diluya con mes medios en un plato de 10 centímetros, cultivo a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Después de unos 10 días, bajo un microscopio invertido, utilice 10 puntas de pipeta estériles microlitro para recoger colonias individuales y transferir cada colonia a 50 microlitros de solución TVP en una placa de 96 pozos. Digerir a 37 grados centígrados durante 30 minutos.

La recolección manual fiable de clonación es fundamental para el éxito de la cosecha de células madre pluripotentes inducidas por CRISPR/Cas9 editadas por CRISPR/Cas9. Luego, transfiera y divida las células digeridas de cada pozo en otras dos placas de cultivo de 96 pozos. Incubar a 37 grados centígrados hasta el 70% confluente.

Con las colonias celulares al 70% de confluencia, retire el medio en la placa de 96 pozos. Añadir 25 microlitros de reactivo de lysis que contengan 1%De solución de Proteinasa K a cada pozo y transferir el lisosato a otra placa PCR de 96 pozos. Sellar la placa PCR con sellos adhesivos e incubar la placa en un ciclor térmico a 55 grados Celsius durante 30 minutos y luego a 95 grados Celsius durante 45 minutos para angarizar las células y desnaturalizar la Proteinase K.Then, en un tubo PCR, añadir dos microlitros del lisosato, 10 microlitros de 2x DNA Polymerase Premix, 7 microlitros de DNase , y un microlitro de imprimaciones DMD Exon23.

Inicie la reacción PCR según el manuscrito. A continuación, cargue la reacción PCR suministrada con 2,2 microlitros de tampón de carga en un gel de 2% de agarosa. Ejecute el gel a 100 a 150 voltios durante 30 minutos e inspeccione el gel con luz UV.

En este protocolo, se diseñaron dos ARN guía que flanquean al mutante Exon23. Después de que Cas9 mediara roturas de doble cadena y unión final no homóloga, el mutante Exon23 fue eliminado, permitiendo la producción de distrofina truncada pero funcional. Para evitar la fuga de la solución de Trypsin, necesitamos aplicar grasa uniformemente en la parte inferior de los anillos.

La combinación de la edición del genoma CRISPR/Cas9 con un sistema de activación MyoD tachado proporciona una estrategia segura, factible y eficaz para el trasplante autólogo en pacientes con distrofia muscular de Duchenne con células progenitoras basales de recuperación génica.