Name: Estrategias no invasivas para la manipulación crónica de la actividad neuronal controlada por DREADD (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 s
Description: Aprende métodos no invasivos para el control crónico de la actividad neuronal mediante DREADD en ratones, utilizando gotas oculares y agua potable con CNO. Estas técnicas reducen el estrés animal y permiten una activación sostenida de neuronas.

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Este trabajo fue apoyado por el programa de investigación intramuros del Instituto Nacional de Salud Mental (ZIA MH002964-02). Nos gustaría agradecer el apoyo del NIMH IRP Rodent Behavioral Core (ZIC MH002952).

Todos los animales fueron manejados de acuerdo con las directrices de los Comités de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional de Salud Mental (NIMH). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el dolor y el número de animales utilizados.
1. Inyecciones de virus asociados a los adenos en el hipocampo
NOTA: Los ratones machos de tipo salvaje de fondo mixto (híbrido B6/129 F1, de 3 meses de edad) fueron inyectados estereotaxically con un AAV que codifica el receptor muscarínico M3 (hM3Dq) en el hipocampo. Durante todo el experimento, los ratones fueron de una sola casa, bajo una luz regular de 12 h: 12 h ciclo oscuro (T24), con acceso a alimentos y agua ad libitum.
<ol><li>Antes de realizar cirugías estereotaxicas, limpie y esterilice el marco estereotaxico y todos los instrumentos necesarios. NOTA: Las cortinas quirúrgicas se pueden utilizar para mantener un campo estéril y reducir la pérdida de calor del ratón.</li>
	<li>Anestetizar profundamente el ratón usando isoflurano. Para ello, primero ajuste el medidor de flujo de oxígeno a aproximadamente 1,5 L/ min, y luego ajuste el vaporizador de isoflurano a aproximadamente 3-5% para la inducción y aproximadamente 1-3% para el mantenimiento.<ol>
<li>Para asegurarse de que el animal está completamente inconsciente, pellizque la pata del ratón; el animal se anestesia adecuadamente cuando la respuesta estremezante al pellizcar está ausente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque el ratón sobre una almohadilla de calentamiento para mantener la estabilidad de la temperatura corporal del ratón.</li>
	<li>Afeitar la parte superior de la cabeza y fijar la cabeza del ratón al marco estereotaxico. Luego, aplicar lubricante protector ocular en los ojos, limpiar la superficie frotando con povidona-yodo y 70% de etanol, y exponer el cráneo usando un bisturí estéril.</li>
	<li>Calibrar el marco al punto bregma, luego perforar en una coordenada medial-lateral de 2,9 mm y una coordenada anterior-posterior -2,7 mm para apuntar al hipocampo. NOTA: Si es necesario inyectar otro objetivo cerebral, determine las coordenadas deseadas para la inyección utilizando el atlas de ratón Paxinos y Franklin16.</li>
	<li>Una vez que el cerebro está expuesto, inyectar unilateralmente 90 nL del AAV a la profundidad dorsal-ventral de -3,0 mm en el hipocampo utilizando un microinyector y pipetas microcapilares extraídas (Figura1A). NOTA: Consulte la Tabla de Materiales para el valorador de AAV utilizado en este experimento. Para otras áreas del cerebro, ajuste el volumen AAV de la inyección según sea necesario.</li>
	<li>Al final del procedimiento quirúrgico, cierre la incisión con suturas de nylon y aplique antibióticos tópicos en el sitio de la herida.</li>
	<li>Administrar analgésicos (buprenorfina, 0,1 mg/kg) sistémicamente inmediatamente después de la cirugía, y 4-6 horas después.</li>
	<li>A partir de 4 semanas después de la inyección, someten a los ratones a cualquiera de los paradigmas descritos en la siguiente sección para controlar crónicamente las neuronas que expresan el receptor excitatorio de diseño.</li>
</ol>2. Entrega repetitiva de CNO con gotas para los ojos
<ol><li>Aclimatar a los animales a manipular desalizando cada ratón 3 minutos al día durante 3-4 días antes de la administración de gotas para los ojos.</li>
	<li>Disolver clozapina-N-óxido (CNO, 5 mg) en 1 ml de solución salina estéril al 0,9% (solución en stock: 5 mg de CNO/ml). Mantener la solución refrigerada a 4oC.</li>
	<li>Pesar cada ratón antes de iniciar el experimento para determinar la cantidad de CNO que se entregará. Utilice 1-3 l de gota (por ojo) para alcanzar 1,0 mg de CNO/kg de peso corporal. NOTA: Por ejemplo, un ratón de 20 g debe recibir gotas oculares bilaterales (2 l cada una).</li>
	<li>Entregar las gotas oculares durante la fase inactiva (ligera) de los ratones, 2 h antes de que las luces se apaguen (hora dezeitgeber (ZT) 10). En los casos en que el CNO deba administrarse durante la fase activa (oscura) de los ratones, asegúrese de la presencia de luz roja tenue para un manejo adecuado de los animales. NOTA: Se deben tomar precauciones para evitar interrumpir el ciclo circadiano (y claro/oscuro) de los animales experimentales.<ol>
<li>Con una micropipeta P10, cargue la cantidad requerida (1-3 l) de solución de CNO para alcanzar 1,0 mg de CNO/kg. NOTA: Utilice una punta de pipeta nueva y estéril para cada gota para los ojos. En este conjunto de experimentos, se realizaron gotas oculares bilaterales de CNO; sin embargo, si se requiere una concentración más baja de CNO, también se podrían aplicar gotas oculares unilaterales.</li>
		<li>Inmovilizar el ratón a través de scruff.</li>
		<li>Expulse lentamente la solución hasta que se forme una gota estable en la punta de la pipeta.</li>
		<li>Lleve cuidadosamente la gota cerca de la córnea del ojo del ratón hasta que se entregue la solución. La punta de la pipeta nunca debe ponerse en contacto con el ojo del ratón.</li>
		<li>Suelte el ratón, colocándolo de nuevo en su jaula de casa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Repita este procedimiento todos los días durante 5 días. NOTA: Esta duración se puede ajustar según los requisitos experimentales.</li>
	<li>Para experimentos de control, utilice ratones inyectados con AAV/DREADD sometidos a tratamiento falso (gotas para los ojos que contengan solo solución salina) y ratones inyectados con un vector vacío (por ejemplo, AAV/mCherry) expuestos al protocolo cNO-drops descrito.</li>
</ol>3. Tratamiento crónico de CNO entregado a través del agua potable
<ol><li>Hacer botellas pequeñas usando tubos cónicos de 50 ml (plástico) y boquillas de tapón de goma; cubierta con papel de aluminio para evitar efectos mediados por la luz sobre la estabilidad de La CNO.</li>
	<li>Tres días antes de comenzar con el tratamiento de CNO, sustituya las botellas de agua regulares por botellas pequeñas, que contengan 10 ml de agua regular, para permitir que los ratones se aclimaten a ellas. Fije las botellas a las jaulas con cinta adhesiva.</li>
	<li>Mida el consumo diario de agua para cada ratón.</li>
	<li>Pesar cada ratón antes de iniciar el experimento.</li>
	<li>Disolver clozapina-N-óxido (CNO, 5 mg) en 1 ml de solución salina estéril al 0,9%. Refrigerar la solución de stock a 4oC.</li>
	<li>Utilice el peso corporal y la cantidad media de agua consumida para definir la concentración de solución CNO para alcanzar 1,0 mg de CNO/kg (peso corporal). NOTA: Los ratones machoadultos adultos (20 g de peso corporal) consumen 5 ml de agua al día (Figura2A). Por lo tanto, para lograr una concentración de CNO de 1 mg de CNO/kg, se debe añadir 6,4 l de solución de cno a un volumen final de 8 ml de agua (concentración final: 4 g de CNO/ml). Por lo tanto, la dosis de CNO para un animal de 20 g que bebe 5 ml de agua al día da como resultado 1 mg de CNO/kg.</li>
	<li>Determinar la dosis óptima de CNO que muestra la máxima eficacia con una concentración mínima de CNO mediante el ensayo de un rango de concentraciones. Realice un análisis de respuesta a la dosis para determinar la dosis óptima de CNO para el método de agua potable. NOTA: Se probaron las siguientes dosis de CNO para este experimento: 1,0 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,1 mg/ml y salina. Se probó por primera vez 1,0 mg de CNO/kg, basándose en protocolos i.p. y de gotas para los ojos.</li>
	<li>En el día 1, llenar la botella con 8 ml de agua regular y añadir la cantidad requerida de CNO. NOTA: Esta cantidad de agua es suficiente para 24 horas de acceso al agua ad libitum para un ratón macho adulto. En caso de que se utilicen otras especies de roedores, primero mida la cantidad de agua consumida diariamente para determinar el volumen necesario.</li>
	<li>Controlar la salud de los animales a lo largo del protocolo para asegurarse de que no hay efectos secundarios adversos causados por el consumo de agua + CNO.</li>
	<li>Después de 24 h, sustituya las botellas por agua dulce + solución de CNO. Registre el volumen consumido durante el día anterior.</li>
	<li>Deseche el agua + la solución CNO que no se consumió en los contenedores de residuos. Deseche las botellas de plástico y sustituya los tapones de goma todos los días, después de desinfectarlos de acuerdo con las directrices de las instalaciones para animales. NOTA: No mezcle residuos acuosos con disolventes orgánicos. Póngase en contacto con el Servicio de Eliminación De Productos Químicos para obtener instrucciones sobre el almacenamiento y la recogida.</li>
	<li>Sustituya las botellas a la misma hora todos los días durante 5 días. NOTA: Esta duración se puede ajustar según los requisitos experimentales.</li>
	<li>Incluya grupos de control, como se describe en el paso 2.6.</li>
</ol>4. Tratamiento restringido de CNO con preferencia de ratones por sacarosa
<ol><li>3 días antes de comenzar con el tratamiento con CNO, coloque una botella pequeña que contenga 10 ml de agua + 1% de sacarosa en la jaula, preferiblemente lejos de la botella de agua original. NOTA: Utilice las mismas botellas pequeñas descritas en el paso 3.1.</li>
	<li>Exponer a los animales al agua + 1% sacarosa durante la última porción de su fase activa (ZT 18 – 24). Después de esta exposición, retire la botella con agua + sacarosa de la jaula. NOTA: Se podrían utilizar diferentes ventanas de tiempo de entrega de CNO. Además, los ratones podrían colocarse bajo un ciclo invertido de luz/oscuridad, donde el inicio de la luz se produce en las horas de la noche para facilitar la entrega de CNO.</li>
	<li>Mida el consumo diario de agua + 1% de sacarosa para cada ratón.</li>
	<li>Pesar cada ratón antes de iniciar el experimento.</li>
	<li>Utilice el peso corporal y la cantidad media de agua + 1% de sacarosa consumida para determinar la dosis de solución de CNO para alcanzar 1,0 mg de CNO/kg (peso corporal). NOTA: Se debe probar la dosis óptima de CNO que muestre la máxima eficacia con una concentración mínima de CNO, como se explica en el paso 3.6.</li>
	<li>En el día 1, llenar botellas con 5 ml de agua + 1% sacarosa + CNO (1 mg de CNO / Kg) y colocarlas en la jaula (siempre en el mismo lugar) durante la ventana de tiempo determinada.</li>
	<li>Al final de la ventana de tiempo restringido, retire las botellas y mida la cantidad de agua + sacarosa + CNO consumida. NOTA: Los materiales y soluciones se desinfectan o descartan como se describió anteriormente en el paso 3.11.</li>
	<li>Repita este procedimiento todos los días durante 5 días. NOTA: Esta duración se puede ajustar según los requisitos experimentales.</li>
	<li>Incluya un grupo de control, como se describe en el paso 2.6.</li>
</ol>5. Análisis de datos
<ol><li>Ratones perfundidos por vía intracardial con 4% de paraformaldehído (PFA) 2 o 6 h después de recibir la última gota ocular CNO repetitiva (5o día). Cuando CNO se entregue a través de agua potable, sustituya CNO + agua por agua al final de la fase activa del ratón y, a continuación, percoe el ratón después de 2 o 6 h de acceso post-CNO. NOTA: Si la exposición a la luz podría afectar a la inducción de c-Fos en el área de interés, mantenga a los ratones en constante oscuridad durante el último día de los experimentos y antes de la perfusión.</li>
	<li>Disecciona cuidadosamente el cerebro y sumérgete en una solución de PFA al 4% durante 9-12h.</li>
	<li>Después de la fijación de la PFA, crioproteger el tejido cerebral usando una solución de sacarosa 30% (esperar hasta que el cerebro se hunde), luego seccionar el cerebro usando un criostato.</li>
	<li>Transfiera las secciones del cerebro coronal (35 m) en una solución que contenga 1x PBS, albúmina sérica 10% bovina y 0,3% De Tritón X-100 durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar las secciones cerebrales con una solución de anticuerpos anti-c-Fos (1:2500) a 4 oC durante la noche con agitación constante.</li>
	<li>Después de 3 lavados de 5 min cada uno con una solución que contiene 1x PBS y 0.3% Triton X-100, incubar las muestras con un anticuerpo secundario conjugado Alexa (1:500) solución para 1 h a temperatura ambiente lejos de la luz y con agitación constante.</li>
	<li>Obtenga imágenes digitales utilizando un microscopio confocal. Ensamble y procese imágenes capturadas con un software de edición y análisis de fotos (por ejemplo, Adobe Photoshop).</li>
	<li>Para el análisis de datos, esboce y mida el área infectada por AAV (células mCherry(+)) utilizando el software ImageJ, y cuantifique el número de células c-Fos(+) dentro de esta región para obtener el número de celdas activadas por área. Combinar los resultados obtenidos a partir de 3 secciones separadas por animal.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los DREADD han surgido como un enfoque popular y eficaz para manipular remotamente la actividad neuronal17. El diseño de estrategias alternativas para la entrega de CNO aumentará ampliamente el espectro de opciones disponibles para configuraciones experimentales específicas. Además, las estrategias no invasivas para la entrega de CNO minimizan cualquier posible interpretación errónea de los resultados mediante la reducción de los efectos secundarios adversos que pueden afectar directamente la salu...

Los avances técnicos en el campo de la neurociencia han permitido a los científicos identificar y controlar con precisión la actividad de determinadas poblaciones neuronales1. Esto ha contribuido a entender mejor la base de los circuitos neuronales ysu impacto en el comportamiento animal, así como, la revisión de dogmas establecidos 2,3. Entre estas nuevas herramientas, las estrategias optogenéticas y quimiogenéticas han tenido un profundo impacto no sólo en la calidad de los descubrimientos, sino también en la forma en que se conciben y diseñanlosexperimentos 4. En el presente manuscrito, nos centramos en estrategias quimiogenéticas para controlar la activación de las neuronas a través de estrategias de receptor-ligand diseñadas. Los receptores de diseño activados exclusivamente por los medicamentos de diseño (DREADD) representan una de las herramientas quimiogenéticas más populares para el control remoto de la actividad neuronal, según lo revisado por Roth 20165. Los DREADD utilizan receptores de acetilcolina muscarínicos modificados que son activados específicamente por un ligando inerte, clozapina-N-óxido (CNO)6.
La mayoría de los estudios utilizan CNO administrado por inyecciones intraperitoneales (i.p.), que controla eficazmente la dosis y el momento de la activación de receptores diseñados de una manera aguda. Sin embargo, cuando se requiere activación repetitiva o crónica DREADD, el uso de múltiples inyecciones de i.p. se vuelve inviable. Para abordar este problema, se han reportado diferentes estrategias para la entrega crónica de CNO, incluyendo minibombas implantadas7 y cánulas intracraneales8,9. En diferentes grados, todas estas estrategias causan el estrés y el dolor de los animales10,y requieren una intervención quirúrgica que también podría tener un impacto directo en las respuestas conductuales que se probarán11. Aquí, describimos tres estrategias no invasivas para el parto crónico de CNO.
Para ello, los ratones fueron inyectados estereotaxicamente en el hipocampo con un virus asociado a adeno (AAV) que codifica una versión de ingeniería del receptor muscarínico M3 excitatorio (hM3Dq) que cuando se activa por el ligando CNO conduce a la cocción en forma de ráfaga de neuronas6. Anteriormente se demostró que una sola gota ocular que contiene CNO puede efectivamente obtener una activación robusta de las neuronas que expresan DREADD12. Aquí describimos un método modificado para la entrega repetitiva de gotas para los ojos. Para lograr un control crónico y sostenido de los receptores de diseño, a continuación describimos una estrategia no invasiva para entregar CNO a ratones a través del agua potable. Por último, describimos un paradigma alternativo para la entrega de CNO en agua potable durante una ventana de tiempo restringida. La actividad locomotora de los ratones, así como el comportamiento de beber y el consumo de soluciones calóricas dulces, se limitan principalmente a la porción oscura del ciclo de luz/oscuridad13,14. Por lo tanto, adoptamos un protocolo basado en la preferencia del ratón por la sacarosa. Mediante la medición de la inducción del gen inmediato-temprano c-Fos en células infectadas por AAV, como una lectura para la activación neuronal12,15, encontramos que estas estrategias de administración de CNO activan de forma robusta las neuronas controladas por DREADD en Duraciones.

<table><tbody><tr><td>BSA</td><td>Sigma ciencias de la vida</td><td>#A2153-100G</td><td>Polvo liofilizado &ge; 96% (electroforesis en gel de agarosa)</td></tr><tr><td>Ratones C57BL/6J</td><td>El laboratorio Jackson</td><td>#000664</td><td>ratones machos, 3 meses de edad</td></tr><tr><td>Capilares Drummond</td><td>Scientific Company</td><td>#3-000-203-G/X</td><td>Diámetro exterior: 1,14 pulgadas</td></tr><tr><td>Clozapina-N-óxido</td><td>Sigma</td><td>#C0832</td><td>5 mg</td></tr><tr><td>Forano</td><td>Baxter</td><td>#NDC 10019-360-60</td><td>Isoflurano, USP</td></tr><tr><td>Microinyector III</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>#3-000-207</td><td>Nanoject III - Inyector de nanolitros programable</td></tr><tr><td>Medios de montaje</td><td>Invitrogen</td><td>#P36930</td><td>Reactivo antidecoloración Prolong Gold</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>#15710</td><td>Solución acuosa al 16% (sin metanol), 10 mL</td></tr> Tecnología <tr><td>de señalización celular</td> <td>de anticuerpos primarios c-Fos</td><td>#2250S</td><td>c-Fos (9F6) AcM de conejo ( 100&micro; L)</td></tr><tr><td>rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry</td><td>UNC Vector Core Titulador</td><td></td><td>: ~3 x 1012 vg/mL</td></tr><tr><td>rAAV5/hSyn-mCherry</td><td>UNC Vector Core Titro</td><td></td><td>: ~3x10e12 vg/mL</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario</td><td>Invitrogen</td><td>#A21206</td><td>Alexa Fluor TM 488 Burro anti-conejo IgG(H+L), 2mg/ml</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>americanbio.com</td><td>#AB02025-00100</td><td></td></tr></tbody></table>

estrategias no invasivas para la manipulación crónica de la actividad neuronal controlada por dreadd

Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity

Las estrategias quimiogenéticas han surgido como herramientas fiables para el control remoto de la actividad neuronal. Entre ellos, los receptores de diseño activados exclusivamente por fármacos de diseño (DREADD) se han convertido en el enfoque quimiogenético más popular utilizado en la neurociencia moderna. La mayoría de los estudios suministran el ligando clozapina-N-óxido (CNO) utilizando una única inyección intraperitoneal, que es adecuada para la activación/inhibición aguda de la población neuronal objetivo. Sin embargo, sólo hay algunos ejemplos de estrategias para la modulación crónica de las neuronas controladas por DREADD, la mayoría de las cuales se basan en el uso de sistemas de administración que requieren intervención quirúrgica. Aquí, ampliamos dos estrategias no invasivas para entregar el ligando CNO para manipular crónicamente la población neuronal en ratones. CNO se administró mediante el uso de gotas para los ojos repetitivas (diarias) o crónicamente a través del agua potable del animal. Estos paradigmas no invasivos dan como resultado una activación robusta de los receptores de diseño que persistieron a lo largo de los tratamientos de CNO. Los métodos descritos aquí ofrecen alternativas para el control crónico mediado por DREADD de la actividad neuronal y pueden ser útiles para experimentos diseñados para evaluar el comportamiento en animales en movimiento libre, centrándose en métodos de entrega de CNO menos invasivos.

Observamos que la administración repetitiva de CNO utilizando gotas para los ojos provocó una inducción robusta de la expresión c-Fos en la mayoría de las neuronas infectadas (Figura1C),lo que muestra que la eficacia de la administración de CNO se mantiene durante la exposición repetitiva. Además, se observó una inducción significativa de c-Fos en muestras recogidas 2 h después del tratamiento con CNO, en comparación con las muestras obtenidas 6 h después de la exposición a CNO (Figuras<stro...

Aquí describimos dos métodos no invasivos para controlar crónicamente la actividad neuronal utilizando quimiogenética en ratones. Se utilizaron gotas para los ojos para administrar clozapina-N-óxido (CNO) diariamente. También describimos dos métodos para la administración prolongada de CNO en agua potable. Estas estrategias para el control neuronal crónico requieren una intervención mínima reduciendo el estrés de los animales.

Estrategias no invasivas para la manipulación crónica de la actividad neuronal controlada por DREADD

Chemogenetic strategies have emerged as reliable tools for remote control of neuronal activity. Among these, designer receptors exclusively activated by ...

Los DREADD son el enfoque quimiogenético más popular para el control remoto de la actividad neuronal. Aquí ofrecemos nuevas alternativas para el control repetitivo o crónico de DREADD, centrándonos en métodos de administración de CNO menos invasivos. Describimos dos estrategias para el parto prolongado de CNO en ratones por gotas repetitivas, o crónicamente a través del agua potable del animal.Los protocolos descritos aquí son ejemplos de opciones crónicas y no invasivas para el parto CNO que se pueden adaptar a una variedad de diseños experimentales, incluyendo diferentes variantes DE DREADD, tejidos, o incluso especies. Un problema clave para un parto con CNO es el estrés y el dolor de un animal. Estos protocolos minimizan este problema y son fáciles de realizar y adaptar a diferentes configuraciones experimentales.Antes de realizar la cirugía, limpie y esterilizar el marco estereotaxico y todos los instrumentos necesarios. Cuando el marco esté listo, confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo en un ratón macho de tipo salvaje de fondo mezclado anestesiado, afeite la parte superior de la cabeza y fije la cabeza del ratón al marco. A continuación, aplique lubricante protector ocular en los ojos y, finalmente, limpie la piel expuesta con yodo povidona secuencial y exfoliantes de etanol al 70%.Usa un bisturí estéril para exponer el cráneo y calibrar el marco hasta el punto de bregma. Taladre en una coordenada medialateral de 2,9 milímetros, y una coordenada posterior anterior de menos 2,7 milímetros para apuntar al hipocampo. Cuando el cerebro esté expuesto, utilice un micro inyector y pipetas microcapilares para inyectar unilateralmente 90 nanolitros del virus adenoociado en el hipocampo a una profundidad ventral dorsal de menos tres milímetros.A continuación, cierre la incisión con suturas de nylon y retire al animal del marco para la administración de analgesia. Para el parto repetitivo de CNO, comenzando cuatro semanas después de la inyección, aclimatar a los animales a la manipulación desaliñando cada ratón tres minutos al día durante tres a cuatro días antes de la administración de las gotas para los ojos. Cuando los ratones se han aclimatado a la manipulación, pesar cada ratón para determinar la cantidad adecuada de CNO para ser entregado para lograr un un miligramo de CNO por kilogramo de concentración de peso corporal.Dos horas antes de apagar las luces durante la fase inactiva, cargue de una a tres microlitros de la solución CNO preparada en una micropipeta P10 e inmovilice el ratón a través de la desaliñada. Expulse lentamente la solución hasta que se forme una gota estable en la punta de la pipeta y lleve cuidadosamente la gota cerca de la córnea hasta que la solución se entregue sin tocar la punta de la pipeta al ojo del ratón. A continuación, devuelva el ratón a su jaula de origen antes de aplicar la gota de CNO en el ojo del siguiente animal.En los casos en que el CNO deba entregarse durante la fase activa del ratón, asegúrese de que se haya atenuado la luz roja para una manipulación adecuada del animal y la entrega de CNO. Para el tratamiento crónico de CNO, a partir de cuatro semanas después de la inyección y tres días antes de comenzar el tratamiento, sustituya las botellas de agua regulares por botellas pequeñas detenidas con boquillas de goma y cubiertas con papel de aluminio que contenga 10 mililitros de agua regular. Asegure a las jaulas con cinta adhesiva para permitir que los ratones se aclimaten a las botellas.Mida el consumo diario de agua para cada ratón y pese cada ratón. Pruebe un rango de concentraciones de CNO para determinar la dosis que muestra la máxima eficacia con la concentración mínima de CNO. A continuación, llene cada botella pequeña con ocho mililitros de agua regular más la cantidad requerida de CNO.Para el tratamiento restringido de CNO, comenzando cuatro semanas después de la inyección y tres días antes de comenzar el tratamiento, coloque un frasco pequeño que contenga 10 mililitros de agua más 1% sacarosa en la jaula lejos de la botella de agua original durante la última porción de la fase activa del animal. Al final de la exposición, retire el agua más las soluciones de sacarosa de cada jaula y mida el consumo de agua de sacarosa para cada animal. Para la entrega de CNO, llene las botellas con cinco mililitros de agua más 1%sacarosa y un miligramo por kilogramo de CNO.Coloque el frasco en la misma posición que durante el período de aclimatación del agua azucarada durante la última parte de la fase activa, retirando las botellas y midiendo la cantidad de agua, sacarosa y CNO consumida como se ha demostrado. Al final del experimento, cosecha el cerebro animal tratado en un fijador fresco. Después de 9 a 12 horas, crioproteger el tejido cerebral en una solución de 30%sacarosa.Cuando el cerebro se hunde, secciona la muestra en un criostato. Cuando se hayan obtenido todas las secciones cerebrales y se haya bloqueado la unión inespecífica, incubar las muestras de tejido con una solución de anticuerpos anti-c-Fos a cuatro grados Celsius durante la noche con agitación constante. A la mañana siguiente, lave las muestras con tres lavados de cinco minutos en PBS fresco por lavado antes de incubar las muestras con un anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia adecuado.Después de una hora a temperatura ambiente y agitación constante protegida de la luz, obtenga imágenes digitales de las secciones tisulares etiquetadas mediante microcroscopia confocal de fluorescencia. Después de cargar las imágenes en ImageJ, describa al medir las áreas de las células positivas mCherry infectadas asociadas a Adeno y cuantifique el número de celdas falsas positivas de C dentro de esta región para obtener el número de celdas activadas por área. La entrega repetitiva de CNO con gotas para los ojos provoca una sólida inducción de la expresión de cFos en la mayoría de las neuronas infectadas que demuestra que la eficacia del parto con CNO se mantiene durante la exposición repetitiva.Además, se observa una inducción significativa de cFos en muestras recogidas dos horas después del tratamiento con CNO en comparación con las muestras obtenidas seis horas después de la exposición a CNO, lo que indica que los cambios inducidos por CNO dependen del tiempo. El consumo diario de agua más CNO no es significativamente diferente en comparación con el volumen total de agua regular consumida. Del mismo modo, la cantidad de agua más el 1% de sacarosa consumida durante la noche no se ve afectada por la adición de CNO, ni las diferencias en el consumo diario de agua más CNO, y el agua más sacarosa más CNO se observan durante un período experimental de cinco días.Al igual que la aplicación de gotas para los ojos CNO, se observa una inducción robusta de cFos después de dos, pero no seis horas de acceso al agua potable CNO. Además, existe un umbral claro de eficacia para el CNO, ya que una dosis baja de CNO no provoca la activación de cFos en comparación con un control salino, mientras que dosis más altas inducen una inducción de cFos robusta y similar. Recomendamos realizar un análisis de respuesta a la dosis para definir la dosis más baja de CNO que no reduce significativamente la activación neuronal, y teniendo en cuenta el uso de clozapina como un ligando.Aquí demostramos el uso de la inducción de cFos mediada por CNO como resultado de la activación neuronal. Sin embargo, estos protocolos se pueden adoptar fácilmente para análisis electrofisiológicos o pruebas de comportamiento. La tecnología DREADD es una poderosa herramienta para el control remoto de la actividad neuronal y el diseño de estrategias alternativas para la entrega de CNO.Aumentaremos el espectro de opciones para entornos experimentales e intervenciones clínicas potenciales.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Fuente: Zhan, J., et al. Estrategias no invasivas para la manipulación crónica de la actividad neuronal controlada por DREADD. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra un método de administración de fármacos oftálmicos no invasivo para la neuromodulación dirigida. El fármaco se administra a través de gotas para los ojos, se absorbe en la circulación, cruza la barrera hematoencefálica y activa receptores neuronales específicos.

Administración de fármacos oftálmicos para la neuromodulación no invasiva en un modelo de ratón

El propósito es presentar un nuevo método, la respiración de control de la estimulación eléctrica (BreEStim) para la gestión del dolor neuropático y espasticidad.

Respiración controlada por la estimulación eléctrica (BreEStim) para el manejo del dolor neuropático y espasticidad

Aquí, creamos una pipeta de vidrio con doble función: inhibición de estructuras cerebrales profundas mediante microinyecciones de fármacos y monitorización en tiempo real de sus efectos mediante registros electrofisiológicos simultáneos.

Grabación simultánea electrofisiológico y micro-inyecciones de agentes inhibitorios en el cerebro de roedores

Este protocolo describe cómo silenciar temporal y remotamente la actividad neuronal en regiones discretas del cerebro mientras las ratas realizan tareas de aprendizaje y memoria. El enfoque combina la farmacogenética (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) con un paradigma conductual (precondicionamiento sensorial) que está diseñado para distinguir entre los diferentes componentes del aprendizaje.

Un método para Remotamente silenciamiento actividad neural en roedores Durante fases discretas de aprendizaje

Este artículo describe la administración de estimulación eléctrica intracraneal que está temporal y espacialmente separada del entorno de uso de drogas para el tratamiento de la dependencia de la metanfetamina intravenosa.

Un método general para evaluar los efectos de estimulación cerebral profunda en Intravenosa metanfetamina Auto-Administración

estimulación eléctrica cerebral no invasiva puede modular la función y el comportamiento cortical, tanto para fines de investigación y clínicos. Este protocolo describe diferentes enfoques de estimulación cerebral para la modulación del sistema motor humano.

No invasiva de estimulación cerebral eléctrica Montajes para la modulación de la función motora humana

Este protocolo describe un montaje quirúrgico para una toma de corriente del electrodo de epicranial permanente y un electrodo de pecho implantado en roedores. Al colocar un segundo electrodo en el zócalo, diferentes tipos de la estimulación eléctrica cerebral transcraneal pueden proporcionarse al sistema motor en animales alerta a través del cráneo intacto.

Estimulación eléctrica cerebral transcraneal en roedores alerta

Este protocolo detallado describe la colocación del electrodo de estimulación transcraneal en el hueso temporal para investigar los efectos a corto y largo plazo de la estimulación eléctrica transcraneal en mover libremente las ratas.

Estimulación eléctrica transcraneal crónica y grabación Intracortical en ratas

El objetivo del protocolo es proporcionar un método para producir lesiones neuronales no invasivas en el cerebro. El método utiliza ultrasonido focalizado guiado por resonancia magnética (MRgFUS) para abrir la barrera hematoencefálica de una manera transitoria y focal, con el fin de entregar una neurotoxina circulante al parénquima cerebral.

Lesión neuronal dirigida para la desconexión no invasiva del circuito cerebral

Este protocolo proporciona una técnica para cosechar y cultivar ganglios de raíz dorsal explantados (DRG) de ratas Sprague Dawley adultas en un dispositivo multicompartimento (MC).

Cosecha, incrustación y cultivo de ganglios de la raíz dorsal en dispositivos multicompartimentales para estudiar las características neuronales periféricas

Aquí, describimos un protocolo para diseñar células madre químicamente reprogramadas para lograr una modulación neuronal precisa mediante la diferenciación de estas células en células precursoras dopaminérgicas, trasplantándolas a modelos de ratón de la enfermedad de Parkinson y evaluando los resultados conductuales y electrofisiológicos para confirmar la integración exitosa y la efectividad funcional de las células trasplantadas.

Regulación quimiogenética en células precursoras derivadas de células madre reprogramadas en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas

Aprende métodos no invasivos para el control crónico de la actividad neuronal mediante DREADD en ratones, utilizando gotas oculares y agua potable con CNO. Estas técnicas reducen el estrés animal y permiten una activación sostenida de neuronas.

Estrategias no invasivas para la manipulación crónica de la actividad neuronal controlada por DREADD

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