Uso de óxido de deuterio como herramienta no invasiva y no letal para evaluar la composición corporal y el consumo de agua en mamíferos

Usando este protocolo, el óxido de deuterio, o D2O, un isótopo estable y no radioactivo de agua, se puede utilizar para estimar la composición corporal y el consumo de agua. Esta técnica no es invasiva y, por lo tanto, se puede utilizar para evaluar la composición corporal en especies en peligro de extinción, así como en humanos y especies domésticas. Una aplicación única de la técnica de dilución de óxido de deuterio es la capacidad de medir el consumo de agua de la vida silvestre de rango libre con altas tasas de recaptura o de animales alojados socialmente.

Si bien no se requiere anestesia, puede ser más fácil para aquellos que no están familiarizados con la administración de inyecciones subcutáneas para sedar a los animales antes de administrar el óxido de deuterio. Demostrando el procedimiento con Sarah Hooper y yo seremos Amanda Eshelman y Ashley Cowan, estudiantes de veterinaria, y Alicia Roistacher, una estudiante de posgrado de mi laboratorio. Para hacer una solución de 50 mililitros de óxido de deuterio salinizado de nueve gramos por litro, primero pese 450 miligramos de cloruro de sodio de grado farmacéutico y registre la cantidad exacta a cuatro decimales.

Transfiera toda la sal a un vaso de precipitado esterilizado de 100 mililitros y mida 50 gramos de más o igual al 99,8% de óxido de deuterio en un cilindro estéril graduado. Registre la cantidad exacta de óxido de deuterio a cuatro decimales, y transfiera el óxido de deuterio al vaso de precipitados estériles de cloruro de sodio. A continuación, coloque una aguja de calibre 20 en un filtro de disco estéril no espía con poros submicrónicos equipados con un barril de jeringa de 10 mililitros e inserte la aguja en el tabique de un vial estéril, vacío de 100 mililitros.

Coloque un tubo de vacío en una aguja del calibre 22 e inserte la aguja en el tabique del vial de 100 mililitros. A continuación, cargue 10 mililitros de cloruro sódico de resistencia isosmótica en el barril de la jeringa y encienda lentamente el vacío hasta que la solución de óxido de deuterio comience a filtrarse lentamente en el vial. Continúe vertiendo la solución de material de óxido de deuterio en el barril de la jeringa hasta que se haya filtrado todo el volumen de 50 mililitros.

Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco en un murciélago anestesiado, utilice una almohadilla de preparación de alcohol para limpiar el uropatagium sobre la vena interfemoral y deje que la membrana de cola desinfectado se seque. Aplique una fina capa de vaselina sobre la vena interfemoral, y utilice una aguja del calibre 29 para perforar la porción dorsal de la vena interfemoral. Luego use tubos capilares de heparina sódica de plástico para recoger 100 microlitros de sangre.

Para asegurar una mezcla adecuada de toda la sangre con la heparina sódica, enrolle suavemente cada tubo después de la acumulación de sangre antes de etiquetar. Después de determinar la masa de óxido de deuterio en gramos para inyectar, cargue una jeringa de insulina equipada con una aguja de calibre 29 con el volumen adecuado de óxido de deuterio. Pesar la jeringa y la aguja de insulina cargadas de deuterio, registrando el peso en cuatro decimales, e inyectar todo el volumen de óxido de deuterio por vía subcutánea sobre la región dorsal de la cadera del murciélago anestesiado.

Recomendamos utilizar una báscula de precisión con un protector de corriente de aire antiestático y asegurarse de tirar hacia atrás en el émbolo para garantizar la presión negativa antes de la inyección. Inmediatamente después de la inyección, pese la jeringa y la aguja de insulina ahora vacías y registre el peso en cuatro decimales. Dentro de los 30 minutos después de la recolección de sangre, utilice una centrífuga de hematocrito para girar cada tubo capilar a 10.000 veces g durante cinco minutos.

Usando tijeras afiladas, corte el tubo capilar de plástico entre toda la sangre y el plasma, y utilice una pipeta de 200 microlitros para expulsar el plasma directamente en un tubo de almacenamiento etiquetado de 500 microlitros. Después del período de equilibrio, recoger y almacenar otros 100 microlitros de sangre de la vena interfemoral como acaba de demostrar. Para el análisis de espectrofotometría FTIR, ajuste la temperatura de un baño de arena a 60 grados centígrados para facilitar la destilación, y agregue 50 microlitros de cada muestra de plasma y de serie en tapas de microcentrífugas cónicas individuales de 1,5 mililitros.

Manteniendo la tapa de microcentrífuga boca abajo, atornille el tubo de microcentrífuga cónica de 1,5 mililitros en la tapa y coloque el tubo invertido en contacto con la arena en el baño de arena durante un mínimo de 12 horas. A la mañana siguiente, coloque una tapa nueva y limpia en cada tubo y pulse los tubos de microcentrífuga durante 10 segundos en una microcentrífuga. Instale una célula de transmisión líquida en el espectrómetro FTIR y llene la célula con metanol.

Conecte el puerto de inyección y llene lentamente la célula con agua de fondo mientras retira cuidadosamente la jeringa de metanol para reducir el riesgo de burbujas de aire. Conecte el tubo al puerto de salida para permitir la eliminación de las muestras después del análisis y abra el software del espectrómetro FTIR. Establezca los parámetros de acuerdo con la tabla y recoja una muestra de fondo utilizando el agua destilada filtrada por diluyente 0,22 micrómetros.

Inyecte 40 microlitros de un estándar de cero partes por millón de óxido de deuterio y registre y guarde los espectros como un archivo de valores separados por comas. Después de inyectar y guardar los espectros de todos los estándares para crear una curva estándar, inyecte 40 microlitros de cada muestra destilada en la célula de transmisión líquida y guarde los espectros. Con un tiempo de equilibrio conocido, se puede determinar el agua corporal total, la masa corporal magra y la masa grasa corporal para los murciélagos marrones grandes capturados salvajemente y los murciélagos marrones grandes cautivos.

Una masa grasa corporal negativa se puede calcular debido a una o más de las siguientes razones: no recibir la dosis completa de óxido de deuterio, volverse torpe durante la fase de equilibrio, tener masas grasas anormalmente grandes y masas magras mínimas, o tener menos de tres a 5% de grasa corporal según lo determinado por la absorción de rayos X dual. Aquí, se muestra un porcentaje representativo de grasa corporal determinada por la técnica de dilución de óxido de deuterio en comparación con la absorción de rayos X duales. Las dos técnicas están bien correlacionadas, con la masa grasa corporal mostrando fuertes correlaciones entre la grasa corporal y el peso corporal y con la técnica de dilución de óxido de deuterio no consistentemente sobre o subestimando la masa grasa corporal.

El método de dilución de óxido de deuterio ha sido previamente validado en gatos, y la técnica fue adaptada para permitir la medición del consumo diario de agua de gatos alojados socialmente durante cada bloque dietético del experimento. Recuerde que esta técnica debe realizarse sólo en animales sanos y que debe pesar, registrar y entregar con precisión la dosis completa de óxido de deuterio a cada animal. Se puede completar un método secundario para determinar la composición corporal, como el análisis completo de la carcasa o DEXA, para validar la técnica del óxido de deuterio.

Esta técnica nos permitió identificar un gato socialmente alojado que consumía cantidades anormalmente altas de agua sin separar a cada gato para medir sus consumos de agua.