Name: Uso de óxido de deuterio como herramienta no invasiva y no letal para evaluar la composición corporal y el consumo de agua en mamíferos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Aprende a usar la dilución de óxido de deuterio para evaluar la composición corporal y el consumo de agua en mamíferos de forma no invasiva. Esta técnica permite estudiar especies en peligro sin necesidad de anestesia.

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Esta investigación fue apoyada por el Acuerdo Cooperativo MDC (#416), el Acuerdo Cooperativo de Servicio Forestal de los Estados Unidos (16-JV-11242311-118), la Academia Americana de Nutrición Veterinaria y Waltham/Royal Canin, LA Subvención de los Estados Unidos (número de subvención: 00049049), la beca de capacitación NIH (número de subvención: T32OS011126) y el Programa de Estudios Otoros de Investigación Veterinaria de la Universidad de Missouri. Los autores agradecen a Shannon Ehlers por pre-revisar este manuscrito. Agradecemos al Dr. Robert Backus por proporcionar las normas D2O y permitir el uso de su laboratorio.

Todos los experimentos descritos aquí fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Missouri y llevados a cabo bajo el #17649 #16409 permiso de Colección Científica de Vida Silvestre del Departamento de Conservación de Missouri (MDC, por sus).
1. Preparación de solución estéril, isotónica y salinizada D2O
<ol><li>Haga una solución de stock de 50 ml de 9,0 g/L salinizado D2O.<ol>
<li>Pesar 450 mg de NaCl de grado farmacéutico y transferir todo el NaCl a un vaso esterilizado de 100 ml. Registre la cantidad exacta de NaCl a 4 decimales en el cuaderno de laboratorio.</li>
		<li>Usando un cilindro graduado estéril, mida 50 g de óxido de deuterio del 99,8% y transfiera al vaso de precipitados estéril que contiene el NaCl. Registre la cantidad exacta de óxido de deuterio en 4 decimales en el cuaderno de laboratorio u hoja de cálculo.</li>
		<li>Filtrar 10 ml de resistencia isosmótica NaCl (9,0 g/L) a través de un filtro de disco estéril no pirogénico con poros submicrométricos (0,2 m).</li>
		<li>Fije una aguja de 20 G al filtro de disco estéril no pirogénico con poros submicranos (0,2 m) equipados con un barril de jeringa de 10 ml. Inserte en el tabique de un vial vacío estéril de 100 ml.</li>
		<li>Coloque un tubo de vacío en una aguja de 22 G e inserte la aguja en el tabique del vial vacío estéril de 100 ml.</li>
		<li>Vierta 10 ml de la solución en el barril de la jeringa. Encienda lentamente el vacío hasta que la solución de stock D2O comience a filtrarse lentamente en el vial estéril. Continúe vertiendo la solución de stock D2O en el barril de la jeringa hasta que se filtren todos los 50 ml. NOTA: Es posible que sea necesario diluir o concentrar la solución en stock en función de la dosis requerida. La dosis de D2O variará en función de la especie y la sensibilidad del método analítico. En el caso de los gatos, se utilizó la solución de trabajo para administrar una dosis de 0,7 g/kg D2O. La solución de stock descrita anteriormente minimiza la cantidad de solución de NaCl introducida por vía subcutánea en el animal, al tiempo que permite una medición precisa de la dosis. Para mamíferos pequeños como murciélagos, esta concentración debe diluirse en una solución de trabajo como 0,1600 g/ml. Esta concentración permite medir y administrar con precisión la dosis de 0,75 g/kg D2O en aproximadamente 100 ml o menos de solución de NaCl.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparación de solución de trabajo estéril, isotónica y salinizada D2O para murciélagos
<ol><li>Pesar un vial estéril vacío de 10 ml y registrar el peso a 4 decimales más cercanos. Escala de tare.</li>
	<li>Utilice una jeringa de 1,0 ml para transferir 0,65 ml de la solución de stock D2O al vial estéril vacío de 10 ml al frasco estéril vacío de 10 ml. Peso récord de D2O a 4 decimales. Escala de tare.</li>
	<li>Calcule el volumen de D2O en el vial vacío de 10 ml. Utilice la siguiente ecuación. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq1.jpg"> donde W se registra peso y D es la densidad de 99,8% D2O (1.107 g/mL).</li>
	<li>Utilice el volumen calculado y el peso conocido de la D2O para determinar el volumen de solución salina isotónica necesaria para crear una solución de trabajo de 0,1600 g/ml.</li>
	<li>Inserte en el tabique del vial estéril de 10 ml, la aguja de 22 G (adjunta al tubo de vacío). Inserte en el tabique del vial estéril de 10 ml, la aguja de 20 G (adjunta a un filtro de jeringa de 0,22 m equipado con un barril de jeringa de 10 ml).</li>
	<li>Vierta la masa/volumen calculado de NaCl isotónico en el barril de la jeringa y encienda el vacío para permitir un goteo lento en el vial estéril de 10 ml.</li>
	<li>Registre el peso del vial y asegúrese de que se crea una solución de trabajo de 0,1600 g/ml.</li>
</ol>3. Determinación de la composición corporal de grandes murciélagos marrones (Eptesicus fucsus) con D2O
NOTA: La solución en stock de D2O utilizada en el protocolo es de 0,1598 g/ml. Antes de recolectar sangre, asegúrese de que la eliminación de hasta 200 l de sangre será del 10% del volumen total de sangre del murciélago y está dentro de las pautas establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC, por sus seno) para la extracción de sangre. Todos los animales deben ser ayunados o el abdomen palpado para asegurar un estómago vacío. Una comida reciente podría alterar el peso del animal resultando en resultados confusos ya que los cálculos para determinar la grasa corporal dependen de la masa corporal del animal.
<ol><li>Anestesia un gran murciélago marrón.<ol>
<li>Utilice 5.0% isoflurano para la inducción. Mantener un plano estable de la anestesia usando 0.5% -3.0% isoflurano.</li>
		<li>Determinar la profundidad de la anestesia adecuada mediante la prueba del reflejo de retirada del pedal (pinchando los dedos de los murciélagos). El murciélago no debe responder a la sensación y la frecuencia respiratoria debe permanecer lenta y estable. Ajuste el isoflurano según sea necesario para mantener un plano estable de la anestesia.</li>
		<li>Registre el nivel de isoflurano, la frecuencia cardíaca, la frecuencia respiratoria y otra información según lo requiera la IACUC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pesar el bate marrón grande y registrar el peso en 4 decimales.</li>
	<li>Limpie el uropatagium (membrana de la cola) sobre la vena interfemoral con una almohadilla de preparación de alcohol y deje secar. Aplique una fina capa de vaselina sobre la vena interfemoral.</li>
	<li>Utilice una aguja de 29 G para perforar la porción dorsal de la vena interfemoral y recoger 100 ml de sangre utilizando tubos capilares de heparina sódica de plástico. Asegurar una mezcla adecuada de toda la sangre con la heparina sódica enrollando suavemente cada tubo después de la recolección y etiquetando el tubo.</li>
	<li>Usando una máquina DXA calibrada para mamíferos pequeños, obtenga tres escaneos DXA del murciélago10.</li>
	<li>Determinar la masa (en g) de D2O para inyectar multiplicando el peso del murciélago en kg por la dosis de D2O de 0,75 g/kg. Determinar el volumen de la dosis de D2O (V) calculada dividiendo el peso de la dosis de D2O por la concentración de la solución de trabajo. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq3.jpg">
</li>
	<li>Utilice una jeringa de insulina con una aguja de 29 G unida para extraer el volumen de D2O calculado. Pese el D2O, la jeringa de insulina y la aguja. Grabar en 4 decimales.</li>
	<li>Inyecte el D2O por vía subcutánea sobre la región dorsal de la cadera del murciélago anestesiado.</li>
	<li>Permita que el murciélago se recupere de la anestesia y registre el tiempo de la inyección.</li>
	<li>Inmediatamente después de la inyección, pese la jeringa de insulina ahora vacía con la aguja de 29 G conectada. Registre el peso en 4 decimales.</li>
	<li>Determinar la dosis de D2O inyectada restando el peso posterior a la inyección de la jeringa de insulina de la jeringa de insulina preinyección D2O llena. Grabar en 4 decimales.</li>
	<li>Dentro de los 30 minutos después de la recolección de sangre, utilice una centrífuga hematocrito para girar cada tubo capilar durante 5 min. Si la centrífuga hematocrito permite múltiples velocidades, ajuste a 10.000 x g.</li>
	<li>Utilice unas tijeras afiladas para cortar el tubo capilar de plástico entre toda la sangre y el plasma. Utilice una pipeta de 200 ml para expulsar el plasma directamente en un tubo de almacenamiento etiquetado de 500 ml.</li>
	<li>Después del período de equilibrio, recoja otros 100 l de sangre de la vena interfemoral. NOTA: El período de equilibrio variará según la especie y si los murciélagos entran en torpor. Para los murciélagos marrones grandes, por lo general 2 h es suficiente para el período de equilibrio.</li>
	<li>Separe el plasma en un segundo tubo superior de tornillo de microcentrífuga etiquetado de 500 l repitiendo el paso 3.13. Almacene las muestras a -20 oC o más frío hasta su análisis.</li>
</ol>4. Análisis de espectrofotometría infrarroja de transformación de Fourier
<ol><li>Ajuste la temperatura de un baño de arena a 60 oC para facilitar la destilación (permitir la separación del agua y D2O de otros componentes sanguíneos).</li>
	<li>Pipetear 50 l de cada muestra de plasma y estándar en el interior de una tapa de tubo de microcentrífuga cónica de 1,5 ml. Incluyendo normas que contienen concentraciones conocidas de D2O como control de calidad. NOTA: Idealmente cada animal tendrá tres réplicas por muestra y el promedio de las tres réplicas reportadas. Debido al volumen limitado de la muestra y al volumen de muestra requerido para el equipo FT-IR utilizado por los autores, no se realizaron réplicas para las muestras de murciélagos. Si alguna muestra contiene menos de 50 ml de plasma, pipetee la cantidad de la muestra en la tapa del tubo de microcentrífuga cónica y registre el volumen.</li>
	<li>Mantenga la tapa de microcentrífuga boca abajo y atornille el tubo de microcentrífuga cónico de 1,5 ml en la tapa. Coloque el tubo invertido (al revés) con la tapa en contacto con la arena en el baño de arena durante un mínimo de 12 h (durante la noche).</li>
	<li>Después de las 12 h, retire la tapa y reemplácela con una tapa nueva y limpia. Pulse el tubo de microcentrífuga durante 10 s en una centrífuga.</li>
	<li>Crear las siguientes normas: 0 ppm (0 mg D2O en 1 L de agua destilada), 293 ppm (293 mg D2O en 1 L de agua destilada), 585 ppm (585 mg D2O en 1 L de agua destilada), 878 ppm (878 mg D2O en 1 L de agua destilada) y 1170 ppm D2O (1170 mg D2O en 1 L. NOTA: Los valores anteriores se sugieren para una curva estándar. Se pueden utilizar valores alternativos como 250 ppm, 500 ppm, 750 ppm, etc.</li>
	<li>Instale una célula de transmisión líquida en el espectrómetro de espectrofotometría infrarroja de transformación de Fourier (FTIR)(Tabla de materiales). Llene la célula con metanol y conecte el puerto de inyección. Llene lentamente la celda con agua de fondo mientras retira cuidadosamente la jeringa de metanol para reducir el riesgo de burbujas de aire. Conecte el tubo al puerto de salida para permitir la extracción de las muestras posteriores al análisis.</li>
	<li>Prepare el software del espectrómetro FTIR(Tabla de materiales)para el análisis de D2O en agua. La configuración de los parámetros para el software del espectrómetro utilizado en este protocolo se enumeran en la Tabla 1.</li>
	<li>Recoger una muestra de fondo utilizando el diluyente, 0,22 m de agua destilada. Debe ser el mismo agua utilizada para las normas.</li>
	<li>Inyectar 40 oL de la 0 ppm D2O y registrar los espectros. Guarde los espectros como un archivo de valores separados por comas (CSV).</li>
	<li>Continúe inyectando y guarde los espectros de todos los estándares para crear una curva estándar.</li>
	<li>Repita el fondo y la curva estándar cada 60 a 90 min.</li>
	<li>Inyectar 40 l de cada muestra destilada en la célula de transmisión líquida y guardar los espectros. NOTA: Modificar el volumen de inyección de las normas y las muestras destiladas en función del volumen de la célula de transmisión líquida. Utilice una celda de transmisión líquida de menor volumen si el volumen de la muestra es inferior a 40 ml o diluya 1:1 con agua destilada de fondo.</li>
	<li>Determinar la concentración de D2O de cada muestra de los espectros FTIR utilizando un programa de hoja de cálculo como se describe en Jennings et al.11 o el software espectral. Cuando se realizan réplicas, utilice la concentración media para calcular la composición corporal.</li>
</ol>5. Cálculo de la composición corporal
<ol><li>Convierta el enriquecimiento de deuterio (ppm) a concentración porcentual de átomos para cada muestra utilizando la siguiente ecuación12: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq4.jpg"> donde x es el enriquecimiento de deuterio medido (ppm) de la muestra y 0.0001557 es la fracción mole de deuterio reportada en Vienna Standard Mean Ocean Water (VSMOW)13.</li>
	<li>Calcular el agua corporal total para cada muestra utilizando la siguiente ecuación4,12,14: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq5.jpg">) donde E es el enriquecimiento medido (átomo%) dedeuterio en la muestra después de la corrección de fondo, B es la masa de inyección en g, y 0.998 es la concentración de D2O inyectado. NOTA: El intercambio de deuterio con hidrógeno lábil provoca una sobreestimación del 2% de la masa total de agua corporal. El agua corporal total debe corregirse reduciendo la estimación total de la masa de agua corporal en un 2% del peso corporal.</li>
	<li>Estimar la masa libre de grasa (masa corporal magra y todos los demás componentes no grasos) de cada murciélago utilizando la siguiente ecuación: <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq6.jpg"> NOTA: Utilice el valor convencionalmente aceptado de 0.732 para el contenido de humedad fraccionada de masa corporal magra para murciélagos sanos, euhidratados y no lactantes. El contenido de humedad fraccionada de masa libre de grasa puede cambiar en lactación de grandes marrones basados en la semana15post-parto. Para otras especies, utilice los valores publicados en la literatura o determine el contenido de humedad fraccionaria de la masa corporal magra antes de realizar cálculos de la masa corporal magra.</li>
	<li>Calcule la masa grasa corporal utilizando la siguiente ecuación: <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq7.jpg">
</li>
	<li>Convierta la masa grasa corporal en g en porcentaje de masa grasa corporal utilizando la siguiente ecuación: <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq8.jpg">
</li>
</ol>6. Determinación de la composición del agua en un carnívoro(Felis catus,gato doméstico)
<ol><li>Prepare la solución de stock como se describe en la sección 1.</li>
	<li>Pesar cada gato hasta los 3 decimales más cercanos y registrar el peso. Calcule la dosis para cada gato como se describe en el paso 3.6 utilizando una dosis de D2O de 0,70 g/kg.</li>
	<li>Prepare cada dosis como se describe en los pasos 3.7 a 3.8. utilizando una jeringa de 3 ml o 5 ml con una aguja de 22 G en lugar de una jeringa de insulina.</li>
	<li>Recoger 500 ml de sangre entera y posteriormente administrar por vía subcutánea los tubos superiores de tornillo de microcentrífuga de 0,7 g/kg D2O. Centrifuge a 2.000 x g durante 15 min y almacenar el plasma en tubos superiores de tornillo de microcentrífuga de 1,5 ml a -20 oC hasta el análisis.</li>
	<li>Recoger 500 l de sangre entera 4 h después de la inyección. Centrifugar sangre entera a 2.000 x g durante 15 min y almacenar plasma en tubos superiores de tornillo de microcentrífuga de 1,5 ml a -20 oC hasta el análisis.</li>
	<li>Recoger 500 l de sangre entera 14 días después de la inyección. Centrifugar sangre entera a 2.000 x g durante 15 min y almacenar plasma en tubos superiores de tornillo de microcentrífuga de 1,5 ml a -20 oC hasta el análisis. NOTA: El número de días entre la recolección de sangre puede basarse en las necesidades experimentales y el período posterior a la inyección en el que se puede detectar D2O por encima de los niveles de fondo. Catorce días fue la longitud de los bloques de tratamiento dietético de Hooper et al.9.</li>
	<li>Realice el análisis FT-IR de acuerdo con la sección 4 y calcule la composición corporal de acuerdo con la sección 5 de este protocolo.</li>
	<li>Calcule el consumo de agua en ml/día utilizando las siguientes ecuaciones: <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq9.jpg"> <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq10.jpg"> <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq11.jpg"> donde TBW es agua corporal total, la inicial D2O y la d2O final son las concentraciones medidas en ppm en las muestras de D2O post-inyección.</li>
</ol>

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<li>International Atomic Energy Agency. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Introduction+to+Body+Composition+Assessment+Using+the+Deuterium+Dilution+Technique+with+Analysis+of+Saliva+Samples+by+Fourier+Transform+Infrared+Spectrometry%22">Introduction to Body Composition Assessment Using the Deuterium Dilution Technique with Analysis of Saliva Samples by Fourier Transform Infrared Spectrometry</a>. , (2011).</li>
<li>Shimamoto, H., Komiya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Turnover+of+Body+Water+as+an+Indicator+of+Health%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiological+Anthropology+and+Applied+Human+Science%22%5BJournal%5D)">The Turnover of Body Water as an Indicator of Health.</a> Journal of Physiological Anthropology and Applied Human Science. 19 (5), 207-212 (2000).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El uso de óxido de deuterio para determinar TBW se ha utilizado desde la década de 194017 y se utiliza en los seres humanos y una variedad de especies domésticas y de vida silvestre4,6,7. Se han desarrollado otras técnicas no destructivas, como el análisis de impedancia bioeléctrica (BIA), DXA y la resonancia magnética cuantitativa (QMR). Cada método tiene ventajas y desventajas que deben tenerse en cuent...

Los sistemas de puntuación de condición corporal y los índices de condición corporal son técnicas comunes utilizadas para evaluar el estado de salud o la aptitud de una especie1,2. Muchas especies domésticas y zoológicas tienen sistemas únicos de puntuación de condición corporal (BCS) que se utilizan para evaluar el músculo de un animal y el tejido graso superficial3. Sin embargo, la evaluación de BCS se basa en el evaluador, lo que significa que el BCS es una medida objetiva o semicuantitativa cuando es evaluada por un evaluador capacitado. En las especies de vida silvestre, los índices de condición corporal se utilizan comúnmente en lugar de BCS y se basan en una proporción de masa corporal al tamaño del cuerpo o masa corporal al antebrazo2. Condición del cuerpo indicis son a menudo confundidos por los efectos de la forrajeo y pueden ser confundidos por el tamaño del cuerpo, así como los problemas estadísticos e inferenciales4.
Una alternativa a los sistemas de puntuación de condición corporal y los índices de condición corporal es utilizar un isótopo estable para determinar la composición corporal. Un isótopo estable comúnmente utilizado es el óxido de deuterio (D2O), una forma no radiactiva de agua en la que los átomos de hidrógeno son isótopos de deuterio. El método de dilución de óxido de deuterio descrito en este estudio puede ser una técnica no subjetiva, cuantitativa y repetible utilizada para estimar la composición corporal en humanos5 y una amplia gama de especies4,6,7. Esta técnica puede ser ventajosa para estudiar la composición corporal en la vida silvestre. Por ejemplo, se puede utilizar para evaluar los cambios longitudinales en la composición corporal, como antes y después de una acción de gestión. Sin embargo, en algunas especies de vida silvestre el óxido de deuterio puede sobreestimar el contenido real de agua8. Por lo tanto, al adaptar la técnica para una especie, es importante validar el método comparando el método de óxido de deuterio con el análisis de canales para especies no amenazadas. En el caso de las especies amenazadas y en peligro de extinción, un método no destructivo como la absortiometría de rayos X dual (DXA) debe considerarse como un método de comparación alternativo al método destructivo estándar del oro para el análisis completo de la canal.
Además de la composición corporal, la técnica de dilución D2O se puede utilizar para determinar el consumo de agua de un animal individual9. Esta aplicación única de D2O se puede utilizar para responder no sólo preguntas de investigación, pero puede ser útil para evaluar el consumo de agua de animales individuales alojados en grandes entornos sociales.
Aquí, describimos la adaptación de la técnica de dilución D2O para evaluar la composición corporal en un insectívoro, grandes murciélagos marrones (Eptesicus fuscus), y para evaluar el consumo de agua en un carnívoro, gatos (Felis catis).

<table><tbody><tr><td>Filtro de disco no pirogénico de 0,2 micras</td><td>Argos Technologies</td><td>FN32S</td><td>nylon, 30 mm de diámetro, 0,22 um, estéril</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga cónicos de 1,5 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1415-9701</td><td>Tubo de microcentrífuga autónomo de 1,5 ml, natural con tapa azul</td></tr><tr><td>Vial de vidrio estéril de 10 mL para inyección</td><td>Mountainside Medical Equipment</td><td>MS-SEV10</td><td>unidad</td></tr> <tr>de inyección de vidrio transparente y estéril<td>Jeringa de 10 mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>305219</td><td>estéril Jeringa de 10 mL envuelta individualmente</td></tr><tr><td>Frasco de vidrio estéril de 100 mL para inyección</td><td>Mountainside Medical Equipment</td><td>AL-SV10020</td><td>vidrio transparente y estéril unidad de inyección</td></tr><tr><td>aguja de calibre 20</td><td>Exel</td><td>26417</td><td>agujas hipodérmica 20g x 1" cubo de plástico (amarillo) / bisel regular</td></tr><tr><td>aguja de calibre 22</td><td>Exel</td><td>26411</td><td>agujas hipodérmicas 22g x 1" cubo de plástico (negro) / bisel regular</td></tr> óxido <tr><td>de deuterio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882-25G</td><td>99.9 átomo % D</td></tr><tr><td>isofluorano</td><td>Vetone</td><td>3060</td><td>fluriso isoflurano, USP</td></tr><tr><td>OMNIC Spectra Software</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>833-036200</td><td>FT-IR software estándar</td></tr><tr><td>vaselina</td><td></td><td>305212311006</td><td>Vaselina, vaselina 100% pura, original, protector de la piel</td></tr><tr><td>tubos capilares de plástico</td><td>Innovative Med Tech</td><td>100050</td><td>anticoagulante de heparina sódica, 50 &mu; Capacidad L, 30 mm</td></tr><tr><td>de longitud Espectrofotómetro de líquido sellado SL-3 FTIR CAF2 Cell</td><td>International Crystal Laboratory</td><td>0005D-875</td><td>0,05 mm Longitud de paso</td></tr><tr><td>cloruro de sodio</td><td>EMD Millipore</td><td>1.37017</td><td>adecuado para la producción biofarmacéutica</td></tr><tr><td>Espectrómetro Thermo Electron Nicolet 380 FT-IR</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>269-169400</td><td>modelo descatalogado, modelos más nuevos disponibles</td></tr></tbody></table>

uso de óxido de deuterio como herramienta no invasiva y no letal para evaluar la composición corporal y el consumo de agua en mamíferos

Using Deuterium Oxide as a Non-Invasive, Non-Lethal Tool for Assessing Body Composition and Water Consumption in Mammals

Los sistemas de puntuación de condición corporal y los índices de condición corporal son técnicas comunes utilizadas para evaluar el estado de salud o la aptitud de una especie. Los sistemas de puntuación de condición del cuerpo dependen del evaluador y tienen el potencial de ser altamente subjetivos. Los índices de condición corporal pueden confundirse por forrajeo, los efectos del peso corporal, así como problemas estadísticos e inferenciales. Una alternativa a los sistemas de puntuación de condición corporal y los índices de condición corporal es el uso de un isótopo estable como el óxido de deuterio para determinar la composición corporal. El método de dilución de óxido de deuterio es una técnica cuantitativa repetible que se utiliza para estimar la composición corporal en humanos, vida silvestre y especies domésticas. Además, la técnica de dilución de óxido de deuterio se puede utilizar para determinar el consumo de agua de un animal individual. Aquí, describimos la adaptación de la técnica de dilución de óxido de deuterio para evaluar la composición corporal en grandes murciélagos marrones (Eptesicus fuscus) y para evaluar el consumo de agua en gatos (Felis catis).

La técnica de dilución de óxido de deuterio se puede utilizar para evaluar la composición corporal de una variedad de especies. Para demostrar la adaptabilidad, estamos reportando el primer uso de la técnica de dilución de óxido de deuterio en una especie de murciélago insectívoro norteamericano, Eptesicus fuscus, el gran murciélago marrón para resultados representativos. Se completó una meseta de cronometraje tomando muestras de sangre de inyección de 2 O antes y después de D<su...

Este artículo describe la técnica de dilución de óxido de deuterio en dos mamíferos, un insectívoro y carnívoro, para determinar el agua corporal total, la masa corporal magra, la masa grasa corporal y el consumo de agua.

Uso de óxido de deuterio como herramienta no invasiva y no letal para evaluar la composición corporal y el consumo de agua en mamíferos

Body condition scoring systems and body condition indices are common techniques used for assessing the health status or fitness of a species. Body ...

Usando este protocolo, el óxido de deuterio, o D2O, un isótopo estable y no radioactivo de agua, se puede utilizar para estimar la composición corporal y el consumo de agua. Esta técnica no es invasiva y, por lo tanto, se puede utilizar para evaluar la composición corporal en especies en peligro de extinción, así como en humanos y especies domésticas. Una aplicación única de la técnica de dilución de óxido de deuterio es la capacidad de medir el consumo de agua de la vida silvestre de rango libre con altas tasas de recaptura o de animales alojados socialmente.Si bien no se requiere anestesia, puede ser más fácil para aquellos que no están familiarizados con la administración de inyecciones subcutáneas para sedar a los animales antes de administrar el óxido de deuterio. Demostrando el procedimiento con Sarah Hooper y yo seremos Amanda Eshelman y Ashley Cowan, estudiantes de veterinaria, y Alicia Roistacher, una estudiante de posgrado de mi laboratorio. Para hacer una solución de 50 mililitros de óxido de deuterio salinizado de nueve gramos por litro, primero pese 450 miligramos de cloruro de sodio de grado farmacéutico y registre la cantidad exacta a cuatro decimales.Transfiera toda la sal a un vaso de precipitado esterilizado de 100 mililitros y mida 50 gramos de más o igual al 99,8% de óxido de deuterio en un cilindro estéril graduado. Registre la cantidad exacta de óxido de deuterio a cuatro decimales, y transfiera el óxido de deuterio al vaso de precipitados estériles de cloruro de sodio. A continuación, coloque una aguja de calibre 20 en un filtro de disco estéril no espía con poros submicrónicos equipados con un barril de jeringa de 10 mililitros e inserte la aguja en el tabique de un vial estéril, vacío de 100 mililitros.Coloque un tubo de vacío en una aguja del calibre 22 e inserte la aguja en el tabique del vial de 100 mililitros. A continuación, cargue 10 mililitros de cloruro sódico de resistencia isosmótica en el barril de la jeringa y encienda lentamente el vacío hasta que la solución de óxido de deuterio comience a filtrarse lentamente en el vial. Continúe vertiendo la solución de material de óxido de deuterio en el barril de la jeringa hasta que se haya filtrado todo el volumen de 50 mililitros.Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco en un murciélago anestesiado, utilice una almohadilla de preparación de alcohol para limpiar el uropatagium sobre la vena interfemoral y deje que la membrana de cola desinfectado se seque. Aplique una fina capa de vaselina sobre la vena interfemoral, y utilice una aguja del calibre 29 para perforar la porción dorsal de la vena interfemoral. Luego use tubos capilares de heparina sódica de plástico para recoger 100 microlitros de sangre.Para asegurar una mezcla adecuada de toda la sangre con la heparina sódica, enrolle suavemente cada tubo después de la acumulación de sangre antes de etiquetar. Después de determinar la masa de óxido de deuterio en gramos para inyectar, cargue una jeringa de insulina equipada con una aguja de calibre 29 con el volumen adecuado de óxido de deuterio. Pesar la jeringa y la aguja de insulina cargadas de deuterio, registrando el peso en cuatro decimales, e inyectar todo el volumen de óxido de deuterio por vía subcutánea sobre la región dorsal de la cadera del murciélago anestesiado.Recomendamos utilizar una báscula de precisión con un protector de corriente de aire antiestático y asegurarse de tirar hacia atrás en el émbolo para garantizar la presión negativa antes de la inyección. Inmediatamente después de la inyección, pese la jeringa y la aguja de insulina ahora vacías y registre el peso en cuatro decimales. Dentro de los 30 minutos después de la recolección de sangre, utilice una centrífuga de hematocrito para girar cada tubo capilar a 10.000 veces g durante cinco minutos.Usando tijeras afiladas, corte el tubo capilar de plástico entre toda la sangre y el plasma, y utilice una pipeta de 200 microlitros para expulsar el plasma directamente en un tubo de almacenamiento etiquetado de 500 microlitros. Después del período de equilibrio, recoger y almacenar otros 100 microlitros de sangre de la vena interfemoral como acaba de demostrar. Para el análisis de espectrofotometría FTIR, ajuste la temperatura de un baño de arena a 60 grados centígrados para facilitar la destilación, y agregue 50 microlitros de cada muestra de plasma y de serie en tapas de microcentrífugas cónicas individuales de 1,5 mililitros.Manteniendo la tapa de microcentrífuga boca abajo, atornille el tubo de microcentrífuga cónica de 1,5 mililitros en la tapa y coloque el tubo invertido en contacto con la arena en el baño de arena durante un mínimo de 12 horas. A la mañana siguiente, coloque una tapa nueva y limpia en cada tubo y pulse los tubos de microcentrífuga durante 10 segundos en una microcentrífuga. Instale una célula de transmisión líquida en el espectrómetro FTIR y llene la célula con metanol.Conecte el puerto de inyección y llene lentamente la célula con agua de fondo mientras retira cuidadosamente la jeringa de metanol para reducir el riesgo de burbujas de aire. Conecte el tubo al puerto de salida para permitir la eliminación de las muestras después del análisis y abra el software del espectrómetro FTIR. Establezca los parámetros de acuerdo con la tabla y recoja una muestra de fondo utilizando el agua destilada filtrada por diluyente 0,22 micrómetros.Inyecte 40 microlitros de un estándar de cero partes por millón de óxido de deuterio y registre y guarde los espectros como un archivo de valores separados por comas. Después de inyectar y guardar los espectros de todos los estándares para crear una curva estándar, inyecte 40 microlitros de cada muestra destilada en la célula de transmisión líquida y guarde los espectros. Con un tiempo de equilibrio conocido, se puede determinar el agua corporal total, la masa corporal magra y la masa grasa corporal para los murciélagos marrones grandes capturados salvajemente y los murciélagos marrones grandes cautivos.Una masa grasa corporal negativa se puede calcular debido a una o más de las siguientes razones: no recibir la dosis completa de óxido de deuterio, volverse torpe durante la fase de equilibrio, tener masas grasas anormalmente grandes y masas magras mínimas, o tener menos de tres a 5% de grasa corporal según lo determinado por la absorción de rayos X dual. Aquí, se muestra un porcentaje representativo de grasa corporal determinada por la técnica de dilución de óxido de deuterio en comparación con la absorción de rayos X duales. Las dos técnicas están bien correlacionadas, con la masa grasa corporal mostrando fuertes correlaciones entre la grasa corporal y el peso corporal y con la técnica de dilución de óxido de deuterio no consistentemente sobre o subestimando la masa grasa corporal.El método de dilución de óxido de deuterio ha sido previamente validado en gatos, y la técnica fue adaptada para permitir la medición del consumo diario de agua de gatos alojados socialmente durante cada bloque dietético del experimento. Recuerde que esta técnica debe realizarse sólo en animales sanos y que debe pesar, registrar y entregar con precisión la dosis completa de óxido de deuterio a cada animal. Se puede completar un método secundario para determinar la composición corporal, como el análisis completo de la carcasa o DEXA, para validar la técnica del óxido de deuterio.Esta técnica nos permitió identificar un gato socialmente alojado que consumía cantidades anormalmente altas de agua sin separar a cada gato para medir sus consumos de agua.

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Investigación

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Análisis de contenido de grasa se realiza rutinariamente en los estudios que utilizan modelos murinos de obesidad. Métodos emergentes en pequeños animales y el análisis de imágenes de TC están proporcionando los detalles longitudinal rica análisis de contenido de grasa. A continuación le detallamos paso a paso los procedimientos para la realización de pequeños animales TAC, análisis y visualización.

La segmentación y la medición de los volúmenes de grasa en modelos murinos de obesidad Usando rayos X de tomografía computarizada

Fuente: Tokunou, Y., et al, Detección electroquímica del efecto del isótopo cinético de deuterio sobre el transporte de electrones extracelulares en Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (2018)Este video demuestra un método electroquímico de célula completa para evaluar cómo la transferencia de protones afecta el transporte extracelular de electrones (EET) en bacterias electroactivas. Al reemplazar los protones con deuterones usando óxido de deuterio, el método mide los cambios en la...

Medición del efecto cinético de los isótopos en el transporte microbiano de electrones mediante óxido de deuterio

Este protocolo describe el uso de un analizador de composición corporal y el sistema metabólico de control animal para caracterizar la composición corporal y parámetros metabólicos en ratones. Un modelo de obesidad inducido por la alimentación alta en grasas se utiliza como un ejemplo para la aplicación de estas técnicas.

Composición corporal y análisis jaulas metabólico en ratones de reserva grasa alta

Aquí presentamos un protocolo de los experimentos electroquímicos celulares para estudiar la contribución del transporte de protones a la velocidad de transporte de electrones extracelular a través de los citocromos de la membrana externa de Shewanella oneidensis MR-1.

Electroquímico detección de deuterio cinético isótopo efecto en extracelular transporte de electrones en la Shewanella oneidensis MR-1

Aquí, compartimos los métodos para medir el consumo de oxígeno mitocondrial, un concepto definitorio de nutrición energética y escape de protones, la principal causa de ineficiencia en generación mitocondrial de ATP. 30% de la energía perdida en la utilización de nutrientes para ayudar a evaluar la función mitocondrial pueden explicar estos resultados.

Medir consumo de oxígeno mitocondrial hepática y la cinética de pérdida de protón para estimar la respiración mitocondrial en el ganado de lechero Holstein

Aquí, presentamos un método cuantitativo de bajo costo que utiliza óxido de deuterio y cromatografía de gases (GCMS) para el análisis de la lipogénesis total de novo de ácidos grasos en tejido adiposo marrón in vivo.

Determinación cuantitativa de la síntesis de ácidos grasos de novo en tejido adiposo marrón mediante óxido de deuterio

Presentamos un protocolo para visualizar directamente las actividades metabólicas en células reguladas por aminoácidos utilizando microscopía de dispersión Raman estimulada con sonda de óxido de deuterio (agua pesada D2O) (DO-SRS), que se integra con microscopía de fluorescencia por excitación de dos fotones (2PEF).

Imagen química bioortogonal del metabolismo celular regulado por aminoácidos aromáticos

Aquí, presentamos una compilación de ensayos para medir directamente la función mitocondrial en células de mamíferos independientemente de su capacidad para consumir oxígeno molecular.

Ensayos independientes del oxígeno para medir la función mitocondrial en mamíferos

Aquí, presentamos en detalle el protocolo de medición del dispositivo ultrasónico de transmisión axial bidireccional (BDAT) y lo probamos en un estudio de reproducibilidad, considerando 14 participantes sanos y 3 operadores. La fiabilidad, medida con los coeficientes de correlación intraclase (CCI), fue de buena a excelente para cuatro parámetros de interés.

Evaluación del hueso cortical mediante ondas guiadas por ultrasonidos: un estudio de reproducibilidad en una población sana

Este procedimiento tiene como objetivo identificar los metabolitos transferidos de los espermatozoides a los ovocitos durante la fertilización mediante el uso de marcadores de isótopos estables con glucosa 2H2O oU 13C, seguido de un análisis metabolómico. Los sementales marcados con deuterio se aparean con madres no marcadas. Los embriones preimplantacionales recolectados se analizan mediante espectrometría de masas para separar los metabolitos paternos (deuterados) de los maternos (no...

Marcaje de isótopos estables in vivo para la identificación por espectrometría de masas de metabolitos paternos transferidos del espermatozoide al ovocito durante la fertilización

Aprende a usar la dilución de óxido de deuterio para evaluar la composición corporal y el consumo de agua en mamíferos de forma no invasiva. Esta técnica permite estudiar especies en peligro sin necesidad de anestesia.

Uso de óxido de deuterio como herramienta no invasiva y no letal para evaluar la composición corporal y el consumo de agua en mamíferos (Video) | JoVE Journal

Uso de óxido de deuterio como herramienta no invasiva y no letal para evaluar la composición corporal y el consumo de agua en mamíferos

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