Name: Mejorar el injerto de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por el hombre a través de una inhibición transitoria de la actividad de Rho Kinase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Aprende a mejorar el injerto de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas mediante inhibición transitoria de Rho Kinase. Este protocolo eficiente y de bajo costo aumenta la supervivencia celular en modelos de infarto de miocardio.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores agradecen al Dr. Joseph C. Wu (Universidad de Stanford) por proporcionar amablemente la construcción Fluc-GFP y al Dr. Yanwen Liu por su excelente asistencia técnica. Este estudio cuenta con el apoyo de las becas HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (a J.Z.), y HL121206A1 (a L.Z.), y una beca R56 HL142627 (a W.Z.), una Asociación Americana de Desarrollo del Corazón, una Beca de Desarrollo del Corazón 16SDG30410018, y la Universidad de Alabama en Birmingham Faculty Development Grant (a W.Z.).

Todos los procedimientos animales en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Alabama en Birmingham y se basaron en los Institutos Nacionales de Guías de Cuidado y Uso de Animales del Laboratorio de Salud (NIH Publication No 85-23).
1. Preparación de medios de cultivo y placas de cultura
<ol><li>
Preparación media
	<ol>
<li>Para el medio hiPSC, mezclar 400 mL de célula madre pluripotente humana (hPSC) medio basal (Tablade Materiales 1) y 100 mL de suplemento hPSC 5x; almacenar la mezcla a 4oC.</li>
		<li>Para RPMI 1640/B27 menos medio de insulina (RB-), mezclar 500 ml de RPMI 1640 y 10 mL de suplemento B27 menos insulina.</li>
		<li>Para rpmI 1640/B27 (RB+) medio, mezclar 500 ml de RPMI 1640, 10 mL de suplemento B27, y 5 mL de penicilina-estreptomicina (pen-strep) antibiótico.</li>
		<li>Para el medio de purificación16, mezclar 500 ml de RPMI sin glucosa 1640, 10 ml de suplemento B27, 5 ml de antibiótico de pluma-estreptococo, y 1.000 ml de solución de DL-lactato de sodio (a una concentración final de 4 mM).</li>
		<li>Para la solución neutralizante, mezcle 200 ml de RPMI 1640, 50 ml de suero bovino fetal (FBS), 2,5 ml de antibiótico de pluma y estreptococo y 50 ml de Y-27632 (a una concentración final de 10 m).</li>
		<li>Para medio de congelación, mezcle 9 ml de FBS, 1 ml de sulfóxido de dimetil (DMSO) y 10 ml de Y-27632 (a una concentración final de 10 m).</li>
		<li>Para la solución de matriz extracelular (EMS), descongelar la matriz extracelular concentrada (Tablade Materiales 1) a 4 oC hasta que haya alcanzado un estado líquido uniformemente consistente. Preenfriar las puntas y tubos de la pipeta antes de hacer alícuotas de matriz de 350 ol cada una en hielo, y almacenar las alícuotas a -20 oC. Antes de recubrir las placas, diluir una alícuota descongelada en 24 ml de medio DMEM/F12 helado (EMS); mantener el SME en 4 oC durante un máximo de 2 semanas. NOTA: Realice todos los pasos de recubrimiento en hielo para evitar la solidificación de la matriz de membrana del sótano.</li>
		<li>Para la solución de Tyrode, tome el 90% del volumen final requerido de agua de grado de cultivo tisular, agregue la cantidad adecuada de los siguientes reactivos y revuelva hasta que se disuelva. A continuación, utilice 1 NNaOH para ajustar el pH a 7.4. Añadir agua extra a una concentración final de cloruro de sodio de 140 mmol/L, cloruro de magnesio de 1 mmol/L, HEPES de 10 mmol/L, cloruro de potasio de 5 mmol/L, glucosa de 10 mmol/L y cloruro de calcio de 1,8 mmol/L. Esterilizar por filtración, utilizando una membrana de 0,22 m.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recubrimiento de placas de cultivo celular
	<ol>
<li>Para placas de cultivo hiPSC, aplicar 1 ml de EMS a cada pocal de una placa de 6 pocillos e incubar la placa durante al menos 1 h a 37 oC. Aspirar la solución DMEM/F12 antes de la sembración de células.</li>
		<li>Para el recubrimiento de gelatina, disolver 0,2 g de gelatina en polvo en agua de grado de cultivo tisular para hacer una solución de 0,2% (p/v). Esterilizar mediante autoclave a 121oC, 15 psi durante 30 min. Cubrir cada pocil de una placa de 6 pocillos con 2 ml de la solución e incubar durante 1 h a 37oC. Antes de pasar las células, aspirar la solución y dejar que la placa se seque durante al menos 1 h a temperatura ambiente dentro de la campana de cultivo de tejido.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Mantenimiento de hiPSC y diferenciación de cardiomiocitos
<ol><li>Cultivo de los hiPSC en medio hiPSC (ver paso 1.1.1) con un cambio medio diario hasta que las células alcancen 80%–90% de confluencia por pozo. NOTA: Para fines de mantenimiento, los hiPSC generalmente están listos para el paso cada 4 días.</li>
	<li>Para pasar hiPSCs, aspirar el medio y lavar el pozo 1x con 1x salina con fosfato (PBS). Añadir 0,5 ml de solución de desprendimiento de células madre (Tablade materiales 1) a cada poca y incubar a 37 oC durante 5-7 min. NOTA: El tiempo de incubación depende de la densidad de las células y de la tasa de disociación, que se puede observar bajo un microscopio.</li>
	<li>Neutralizar la solución de desprendimiento de células madre con 1 ml de medio hiPSC complementado con 5 M Y-27632. Recoger la mezcla en un tubo centrífugo de 15 ml. Centrifugar el tubo durante 5 min a 200 x g, aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular, y luego, resuspender las células en 1 ml de medio hiPSC que contiene 5 M Y-27632.</li>
	<li>Sofitee los hiPSC en una nueva placa de 6 pocillos recubierta de EMS en una relación entre 1:6 y 1:18. Cambie el medio a medio hiPSC sin Y27632 después de las 24 h.</li>
	<li>Para congelar las células, resuspenda los hiPSC disociados en medio de congelación a una concentración de 0,5–1 millones/500 l, coloque la suspensión en crioviales y guárdelas en un congelador de -80 oC. Transfiera los viales congelados a nitrógeno líquido después de 24 h.</li>
	<li>Para diferenciar, sustituya el medio hiPSC por 2 ml de medio RB- complementado con 10 m de inhibidor de GSK-3 ( inhibidor CHIR99021 (CHIR) en 80%–90% de confluencia celular. Sustituya el medio por 3 ml de medio RB después de 24 h e incubar durante 48 h adicionales (día 3).</li>
	<li>En el día 3, cambie el medio a 3 ml de rb-medio con 10 M Wnt inhibidor IWR1 durante 48 h (día 5), y luego reemplace el medio con 3 ml de RB- medio y manténgalo durante 48 h (día 7).</li>
	<li>En el día 7, sustituya el medio por 3 ml de medio RB y cambie el medio cada 3 días en el futuro. Se deben observar golpes espontáneos de hiPSC-CP entre los días 7–10.</li>
</ol>3. Purificación de hiPSC-CMs y pretratamiento de moléculas pequeñas
NOTA: Se utilizaron enzimas de disociación celular altamente purificadas y recombinantes (Tablade Materiales1) para disociar hiPSC-CP.
<ol><li>El día 21 después de la diferenciación hiPSC-CM, aspirar el medio y lavar las células 1x con PBS estéril. Incubar las células con 0,5 ml de enzimas de disociación celular por pozo durante 5-7 min a 37 oC. Pipetear repetidamente la suspensión celular utilizando una pipeta de 1 ml para disociar completamente las células.</li>
	<li>Después de disociar las células, añadir 1 ml de solución neutralizante a cada pocil, recoger la mezcla celular en un tubo centrífugo de 15 ml y centrifugar a 200 x g durante 3 min. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en una solución neutralizante.</li>
	<li>Replantar las células en placas de 6 pocillos recubiertas de gelatina a una densidad de 2 millones de células por pozo.</li>
	<li>Después de 24–48 h, reemplace el medio de cultivo por medio de purificación durante 3-5 días. NOTA: La purificación se completa cuando más del 90% de las células en cada campo de visión del microscopio están latiendo. Para evitar más daños a los cardiomiocitos, no extienda la duración de la purificación más allá de 5 días. Si la primera ronda no produce la pureza necesaria, sustituya el medio de purificación por el medio RB+ durante 1 día y, a continuación, complete una segunda ronda de purificación.</li>
	<li>Antes del trasplante, el cultivo de las células en el grupo de tratamiento durante 12 h en medio RB+ complementado con 10 M Y-27632. Del mismo modo, realizar tratamiento con verapamilo en las células del medio RB+ con 1 m de verapamilo durante 12 h (hiPSC-CP+VER).</li>
	<li>Después del tratamiento, lavar los HIPSC-CMs 1x con PBS e incubar las células con 0,5 ml de enzimas de disociación celular por pozo durante un máximo de 2 min. Pipeteo repetidamente la suspensión celular, utilizando una pipeta de 1 ml, para disociar completamente las células. Neutralizar las células con solución neutralizante, recoger la mezcla celular en un tubo centrífugo de 15 ml y centrifugar a 200 x g durante 3 min. Resuspender las células en PBS a una concentración de 0,1 millones de células/5 ml en preparación para la inyección.</li>
</ol>4. Infarto de miocardio y trasplante celular
NOTA: Todos los instrumentos quirúrgicos se preesterilizan con autoclave y se mantienen en condiciones asépticas durante múltiples cirugías a través de un esterilizador de cuentas calientes (Tablade materiales 2).
<ol><li>Anestetizar ratones NOD/scid (Tablade Materiales 2) con isoflurano inhalado (1,5%–2%). Supervise los niveles de anestesia mediante las respuestas de los ratones a un pellizco del dedo del dedo del dedo del sol. Coloque la pomada óptica de la venta en los ojos para evitar que se sequen durante la cirugía.</li>
	<li>Suministro por vía subcutánea de 0,1 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea para el tratamiento del dolor antes de la cirugía.</li>
	<li>Coloque y asegure el ratón en posición supina sobre una mesa de operación calentada, retire el cabello de la región del cuello ventral y el tórax izquierdo usando una crema depilatoria, exponga la piel y desinfecte con 70% de alcohol.</li>
	<li>Cortar una incisión de 0,5 cm en el centro del cuello con tijeras quirúrgicas, separar la grasa subcutánea con fórceps estériles y exponer la tráquea. Introducir oralmente la cánula de intubación en la tráquea, conectar la cánula a un respirador animal pequeño y ajustar los ajustes de ventilación (establecer el volumen de marea en 100-150 l y la velocidad de respiración en 100x–150x por min).</li>
	<li>Después de que el ratón se estabilice, corte una incisión de 0,5 cm en el centro de la piel del pecho izquierdo. Utilice fórceps para separar sin rodeos la capa muscular y hacer una pequeña incisión en el quinto espacio intercostal para exponer la cavidad torácica. Coloque el retractor en la incisión para abrir la cavidad torácica y localizar la arteria coronaria descendente izquierda (LAD). Bajo un microscopio quirúrgico disección, ligar el LAD con un 8-0 sutura inabsorbible.</li>
	<li>Inmediatamente después de la inducción de MI, inyectar 5 l de hiPSC-CP-RI, hiPSC-CP+RI, hiPSC-CP-VER, hiPSC-CP+VER,o un volumen igual de PBS en el miocardio del ratón en cada sitio (3 x 105 celdas/animal, 1 x 105 células/sitio), una en el área del infarto y dos en las áreas alrededor del infarto. NOTA: Dado que 5 l es un volumen muy pequeño, no es fácil controlar con precisión el volumen succionándolo directamente con una jeringa. La tapa de una placa estéril de Petri se puede girar, y 5 l de las células se pueden depositar primero en la tapa con una pipeta. Debido a la tensión superficial, no se extenderá, sino que se condensará en una pequeña masa líquida. Esto se puede absorber e inyectar fácilmente en el miocardio del ratón.</li>
	<li>Elimine el aire residual en la cavidad torácica llenándolo con solución salina isotónica caliente. Coser las costillas, los músculos y la piel en secuencia con una sutura absorbible 6-0. Apague la inyección de anestesia con isoflurano. Mantenga a los animales de cirugía en la almohadilla de calentamiento y observen de cerca mientras recuperan la plena conciencia. Luego, coloque a los animales en una jaula limpia. No devuelva los animales a la compañía de otros animales hasta que estén completamente recuperados.</li>
	<li>Después de la cirugía, inyectar a los ratones por vía intraperitoneal con buprenorfina (0,1 mg/kg) cada 12 h durante 3 días consecutivos e inyectarles ibuprofeno (5 mg/kg) cada 12 h durante un día. Realice estudios de análisis posteriores en puntos de tiempo especificados. NOTA: Siga las pautas de su comité local de cuidado de animales para la analgesia.</li>
</ol>5. Grabación transitoria y contractilidad del calcio
<ol><li>Autoclave cubiertas de 15 mm de diámetrolips (Tablade Materiales 2) y pinzas en un vaso de vidrio pequeño a 121 oC, 15 psi durante 15 min. Preenfríe los labios de las cubiertas y pinzas a 4 oC.</li>
	<li>Con las pinzas, coloque el cubreobjetos en una placa de 12 pocillos y una pipeta de 300 ml de matriz extracelular en cada cubreobjetos. NOTA: No deje que la matriz exceda el borde de la cubierta para evitar la reducción de la cantidad de recubrimiento de la matriz. Incubar la placa de 12 pocillos en una incubadora de cultivo celular de 37oC durante 1 h.</li>
	<li>Aspirar el medio en la placa de 6 pocillos recubierto de gelatina con hiPSC-CP purificados, lavarlo 1x con PBS, y luego digerirlo con 0,5 ml de enzimas de disociación celular durante 1,5 min. Añadir 1 ml de solución neutralizadora, pipeta repetidamente para no más de 5x–10x con una pipeta de 1 ml , y centrifugar la mezcla a 200 x g durante 3 min.</li>
	<li>Aspirar la matriz extracelular recubierta de los labios de las cubiertas. Cuente el número de celda y resuspenda las células de la solución neutralizante a una concentración de 40.000/300 l, y luego agregue 300 s de la suspensión celular a cada cubreobjetos. Cultivar la placa en una incubadora de 37oC.</li>
	<li>Después de 24 h, aspirar suavemente la solución neutralizada, añadir 500 ml de medio RB+ a cada pocal de la placa, y continuar a cultivar durante 2 días.</li>
	<li>Añadir Y-27632 (10 m), activador Rho quinasa (RA, 100 nM), verapamilo (1 m), o un volumen igual de PBS en el medio de cultivo de los CPDe, 12 h antes de que el calcio sea transitorio y la detección de contractilidad. NOTA: Además de la detección del calcio transitorio de las células y la contractilidad después de 12 h de tratamiento químico, la detección de estos parámetros también se probó a 12, 24, 48 y 72 h después de la retirada química.</li>
	<li>Saque la placa, deseche el medio y lave la placa 1x con PBS. Cambiar el medio a un DMEM libre de fenol-rojo que contenga 0,02% (p/v) de poliol tensioactivo (Tablade materiales 1), indicador de calcio de 5 m (Tablade materiales 1), y el correspondiente Y-27632 (10 m), RA (100 nM), verapamilo (1 m) o un volumen igual de PBS, e incubar la placa durante 30 min a 37 oC.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante, lave las células 3veces con medio DMEM sin tinte y deje reposar el medio durante 30 minutos para desestalificar el tinte cartográfico.</li>
	<li>Coloque la cubierta de la célula en una cámara de baño abierta e inserte la cámara en un sistema de microincubación equilibrado a 37 oC con un controlador automático de temperatura (Tablade materiales 2perfus), einsertarla con la solución de Tyrode, y añadir continuamente Inhibidor de Rho quinasa (RI), RA, o PBS a la solución de perfusión.</li>
	<li>Utilice un microscopio de fluorescencia invertida (Tablade materiales 2) y un cabezal de escaneo láser (Tablade materiales 2) para registrar un transitorio espontáneo de calcio mediante el uso de un escáner de línea x-t, utilizando un láser de argón de 488 nm para excitación de tinte y un 515 x 10 nm filtro de barrera para recoger la luz de emisión. Registrar la contracción espontánea de hiPSC-CM utilizando la funcionalidad de contraste de interferencia diferencial del microscopio confocal (Tablade materiales 2). NOTA: Las grabaciones transitorias de calcio se procesaron y analizaron utilizando el software MATLAB R2016A (Tablade materiales 4). Los ensayos de cambio de contracción celular se realizaron utilizando el software ImageJ (Tablade materiales 4).</li>
</ol>

<ol><li>Menasche, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+clinical+use+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiac+progenitors%3A+a+translational+experience%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience.</a> European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).</li>
<li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+de+novo+cardiomyocytes%3A+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li>
<li>Frisch, S. M., Francis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+epithelial+cell-matrix+interactions+induces+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis.</a> Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).</li>
<li>Haun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+anoikis+signalling+pathway+using+the+fungal+virulence+factor+gliotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin.</a> Nature Communications. 9 (1), 3524(2018).</li>
<li>Ohashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-associated+kinase+ROCK+activates+LIM-kinase+1+by+phosphorylation+at+threonine+508+within+the+activation+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).</li>
<li>Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-associated+kinase-dependent+contraction+of+stress+fibres+and+the+organization+of+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+The+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions.</a> Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).</li>
<li>Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoikis+molecular+pathways+and+its+role+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).</li>
<li>Legate, K. R., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+that+regulate+adaptor+binding+to+beta-integrin+cytoplasmic+tails%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails.</a> Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
<li>Emre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ROCK+inhibitor+Y-27632+improves+recovery+of+human+embryonic+stem+cells+after+fluorescence-activated+cell+sorting+with+multiple+cell+surface+markers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers.</a> PLoS One. 5 (8), e12148(2010).</li>
<li>Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+Inhibitor+Y-27632+Promotes+Human+Retinal+Pigment+Epithelium+Survival+by+Altering+Cellular+Biomechanical+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties.</a> Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).</li>
<li>Laflamme, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infarcted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts.</a> Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).</li>
<li>Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCND2+Overexpression+Enhances+the+Regenerative+Potency+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes%3A+Remuscularization+of+Injured+Ventricle%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle.</a> Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).</li>
<li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li>
<li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+Oxidation+Is+Indispensable+for+Survival+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).</li>
<li>Ong, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Single-Cell+Analysis+of+Transplanted+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+After+Acute+Myocardial+Infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction.</a> Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Y-27632+Preconditioning+Enhances+Transplantation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+in+Myocardial+Infarction+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice.</a> Cardiovascular Research. , (2018).</li>
<li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li>
<li>Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+inhibition+promotes+atypical+anoikis+in+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells.</a> Cell Death & Disease. 5, e1012(2014).</li>
<li>Lelievre, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-cadherin+mediates+neuronal+cell+survival+through+Bim+down-regulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation.</a> PLoS One. 7 (3), e33206(2012).</li>
<li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+cell+motility+by+carbon+ion+irradiation+via+the+Rho+signaling+pathway+and+its+inhibition+by+the+ROCK+inhibitor+Y-27632+in+lung+adenocarcinoma+A549+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells.</a> Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).</li>
<li>Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKC-beta+exacerbates+in+vitro+brain+barrier+damage+in+hyperglycemic+settings+via+regulation+of+RhoA%2FRho-kinase%2FMLC2+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los pasos clave de este estudio incluyen la obtención de hiPSC-CM puros, la mejora de la actividad de los hiPSC-CM a través del pretratamiento Y-27632 y, por último, el trasplante de una cantidad precisa de hiPSC-CM en un modelo de MI de ratón.
Las cuestiones clave que se abordaron aquí fueron que, en primer lugar, optimizamos los métodos de purificación sin glucosa19 y establecimos un novedoso sistema de purificación eficiente. El procedimiento del sistema incluyó la a...

Las terapias basadas en células madre han demostrado un potencial considerable como tratamiento para el daño cardíaco causado por MI1. El uso de hiPSC diferenciados proporciona una fuente inagotable de hiPSC-CP2 y abre la puerta al rápido desarrollo de tratamientos innovadores. Sin embargo, siguen existiendo muchas limitaciones a la traducción terapéutica, incluido el desafío de la tasa de injerto severamente baja de las células implantadas.
La disociación de células con trippsina inicia anoikis3, que sólo se acelera una vez que estas células se inyectan en ambientes hostiles como el miocardio isquémico, donde el ambiente hipóxico acelera el curso hacia la muerte celular. De las células restantes, una gran proporción se lava desde el sitio de implantación en el torrente sanguíneo y se extiende por toda la periferia. Una de las vías apoptoticas clave es la vía RhoA/ROCK4. Basado en investigaciones previas, la vía RhoA/ROCK regula la organización citoesquelética actina5,6, que es responsable de la disfunción celular7,8. El inhibidor DE ROCK Y-27632 es ampliamente utilizado durante la disociación somática y de célulasmadre y el passaging, para aumentar la adhesión celular y reducir la apoptosis celular 9,10,11. En este estudio, Y-27632 se utiliza para tratar hiPSC-CM antes del trasplante en un intento de aumentar la tasa de injerto celular.
Se han establecido varios métodos destinados a mejorar la tasa de injerto celular, como el choque térmico y el recubrimiento de matriz de membrana de sótano12. Aparte de estos métodos, la tecnología genética también puede promover la proliferación de cardiomiocitos13 o revertir las células no miocárdicas en cardiomiocitos14. Desde la perspectiva de la bioingeniería, los cardiomiocitos se asintan en un andamio biomaterial para mejorar la eficiencia del trasplante15. Desafortunadamente, la mayoría de estos métodos son complicados y costosos. Por el contrario, el método propuesto aquí es simple, rentable y eficaz, y se puede utilizar como tratamiento basal antes del trasplante, así como en conjugación con otras tecnologías.

<table><tbody><tr><td><reactivo fuerte></fuerte></td>Accutasa (solución de desprendimiento de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>células madre)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>#07920</td><td></td></tr><tr><td>B27 menos insulina</td><td>Fisher Scientific</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplemento</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-504-044</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72054</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x), alto contenido de glucosa, HEPES, rojo sin fenol</td><td>Thermofisher</td><td>20163029</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM (indicador de calcio)</td><td>Invitrogen/Thermofisher</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>RPMI sin glucosa 1640</td><td>Fisher Scientific</td><td>11879020</td><td></td></tr><tr><td>IWR1</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72562</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (matriz extracelular)</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40230C</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR (medio de células madre pluripotentes humanas)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico pen-estreptococo</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 (poliol tensioactivo)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Activador Rho II</td><td>Citoesqueleto</td><td>CN03 RPMI1640</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>DL-lactato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4263</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE (enzimas de disociación celular)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-605-010</td><td></td></tr><tr><td>Verapamilo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Compañía</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Equipos y suministros</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina III Bioluminis, Coverslips</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>15 mm</td><td>Warner</td><td>CS-15R15</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo Scientific</td><td>NX50</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura automático dual</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de alimentación de electroforesis</td><td>BIO-RAD</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia</td><td>Olympus</td>Cámara de alta velocidad <td>IX83</td><td></td></tr><tr><td></td><td>pco</td><td>1200 s</td><td></td></tr><tr><td>Cabezal de escaneo láser</td><td>Olympus</td><td>FV-1000</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de baño abierta de perfil bajo (se monta en el sistema de microincubación superior)Sistema de microincubación</td> Warner <td>Instruments</td><td>RC-42LP</td><td></td></tr><tr><td>Warner</td><td>Instruments</td><td>DH-40iL</td><td></td></tr><tr><td>Ventilador de ratón Minivent</td><td>Aparato de Harvard</td><td>845</td><td></td></tr><tr><td>ratones NOD/SCID</td><td>Laboratorio Jackson</td><td>001303</td><td></td></tr><tr><td>Geles de proteínas prefabricadas</td><td>BIO-RAD</td><td>4561033</td><td></td></tr><tr><td>Paquetes de transferencia de PVDF</td><td>Sistema Trans-Blot 1704156</td><td></td><td></td>BIO-RAD</tr><tr><td>Trans-Blot</td><td></td> Turbo Esterilizador de perlas calientes <td>Trans-Blot Turbo</td><td></td></tr><tr><td>Fine</td><td>Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td> Nombre</td><td>Compañía</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Anticuerpo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Nucleolina humana (Alexa Fluor 647)</td><td>Abcam</td><td>ab198580</td><td></td></tr><tr><td>Troponina Cardíaca T</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1874</td><td></td></tr><tr><td>Troponina cardíaca C</td><td>Abcam</td><td>ab137130</td><td></td></tr><tr><td>Troponina cardíaca I</td><td>Abcam</td><td>ab47003</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-burro anti-ratón</td><td>Laboratorio de Inmunoinvestigación Jackson</td><td>715-175-150</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-burro anti-conejo</td><td>Jackson Laboratorio de Inmunoinvestigación</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>Fitc-burro anti-ratón</td><td>Jackson Laboratorio de Investigación Inmunológica</td><td>715-095-150</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab22555</td><td></td></tr><tr><td>Troponina cardíaca humana T</td><td>Abcam</td><td>ab91605</td><td></td></tr><tr><td>Integrina y beta; 1</td><td>Abcam</td><td>ab24693</td><td></td></tr><tr><td>Ki67</td><td>EMD Millipore</td><td>ab9260</td><td></td></tr><tr><td>N-cadherin</td><td>Abcam</td><td>ab18203</td><td></td></tr><tr><td>Cadena ligera de fosfo-miosina</td><td>Tecnología de señalización de 2 celdas</td><td>3671s</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td>R2016A</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>1.52g</td><td></td></tr></tbody></table>

mejorar el injerto de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por el hombre a través de una inhibición transitoria de la actividad de rho kinase

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Un factor crucial en la mejora de la eficacia de la terapia celular para la regeneración miocárdica es aumentar de forma segura y eficiente la tasa de injerto celular. Y-27632 es un inhibidor muy potente de Rho-asociado, bobina enrollada-que contiene proteína quinasa (RhoA/ROCK) y se utiliza para prevenir la disociación inducida por la apoptosis celular (anoikis). Demostramos que el pretratamiento Y-27632 para cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por el hombre (hiPSC-MC+RI)antes de la implantación da como resultado una mejora de la tasa de injerto celular en un modelo de ratón de infarto agudo de miocardio (MI). Aquí, describimos un procedimiento completo de diferenciación hiPSC-CM, purificación y pretratamiento celular con Y-27632, así como la contracción celular resultante, mediciones transitorias de calcio y trasplante en modelos MI de ratón. El método propuesto proporciona un método simple, seguro, eficaz y de bajo costo que aumenta significativamente la tasa de injerto celular. Este método no sólo puede utilizarse junto con otros métodos para mejorar aún más la eficiencia del trasplante de células, sino que también proporciona una base favorable para el estudio de los mecanismos de otras enfermedades cardíacas.

Los hiPSC-CM utilizados en este estudio se derivaron de origen humano con el gen reportero de luciferasa; por lo tanto, la tasa de supervivencia de las células trasplantadas in vivo se detectó mediante imágenes de bioluminiscencia (BLI)17 (Figura 1A,B). Para las secciones histológicas del corazón, las células dobles positivas de la troponina cardíaca T (hcTnT) y del antígeno nuclear humano (HNA) se clasificaron como hi...

En este protocolo, demostramos y profundizamos en cómo utilizar células madre pluripotentes inducidas por el hombre para la diferenciación y purificación de cardiomiocitos, y más adelante, sobre cómo mejorar su eficiencia de trasplante con inhibidor de la proteína quinasa asociada a Rho pretratamiento en un modelo de infarto de miocardio de ratón.

Mejorar el injerto de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por el hombre a través de una inhibición transitoria de la actividad de Rho Kinase

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Nuestros datos demuestran que la inhibición transitoria de la actividad rho-quinasa mejora la adhesión, la supervivencia y el injerto de cardiomiocitos derivados de hiPSC después de ser trasplantados en los corazones animales infartos. Proporcionamos un método simple, de bajo costo, mientras que altamente eficiente para aumentar el injerto de cardiomiocitos derivados de hiPSC trasplantados en los corazones de los animales lesionados. Como esta técnica puede mejorar las tasas de injerto celular de forma segura y eficiente en el infarto cardíaco agudo y la insuficiencia cardíaca, contribuye a las mejoras resultantes en la función cardíaca, vasculares, y apoptosis.Aunque sólo probamos nuestros protocolos en hiPSC, estos métodos se pueden aplicar a otros tipos de células, como células madre embrionarias, células madre mesenquimales, etc. La dosis y la duración del tratamiento con Y-27632 son fundamentales. La demostración visual puede demostrar con gran detalle todos los pasos clave en el protocolo, lo que es beneficioso para alguien que nunca ha realizado esta técnica antes.El día 21 después de la diferenciación hiPSC-CM, aspirar el medio y lavar las células con PBS estéril una vez. Incubar las células con 0,5 mililitros de enzimas de disociación celular por pozo a 37 grados centígrados durante cinco a siete minutos. Después del tiempo de incubación, pipetee repetidamente la suspensión celular utilizando una pipeta de un mililitro para disociar a fondo las células.Luego, agregue un mililitro de solución neutralizante a cada pozo, recoja la mezcla celular en un tubo centrífuga de 15 mililitros y centrífuga a 200 veces g durante tres minutos. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y resusppend las células en la solución neutralizante. Luego, replantar las células en placas recubiertas de gelatina de seis pozos a una densidad de dos millones de células por pozo.Después de 24 a 48 horas, sustituya el medio de cultivo por el medio de purificación durante tres a cinco días. Antes del trasplante, cultivar las células en el grupo de tratamiento durante 12 horas en el medio RB-plus complementado con 10 micromolares Y-27632. Del mismo modo, realizar el tratamiento con verapamilo en las células del medio RB-plus con una micromole de verapamilo durante 12 horas.Después del tratamiento, lave los hiPSC-CM con PBS una vez e incubar las células con 0,5 microlitros de enzimas de disociación celular por pozo durante un máximo de dos minutos. Pipetear repetidamente la suspensión celular utilizando una pipeta de un mililitro para disociar completamente las células. A continuación, neutralizar las células con solución neutralizante, recoger la mezcla celular en un tubo centrífugo de 15 mililitros y centrífuga a 200 veces g durante tres minutos.Después de la centrifugación, resuspender las células en PBS a una concentración de 0,1 millones de células por cinco microlitros en preparación para la inyección. Inmediatamente después de la inducción de infarto de miocardio, inyectar cinco microlitros de control hiPSC-CM, hiPSC-CM pretratadoS Y-27632, hiPSC-CM tratados con verapamil, o un volumen igual de PBS en el miocardio del ratón en cada sitio, uno en el área de infarto y dos en las áreas alrededor del infarto. 12 horas antes de realizar la detección transitoria y de contractilidad de calcio, agregue 10 micromolares Y-27632, RA nanomolar, verapamilo de un micromolar o un volumen igual de PBS en el medio de cultivo de hiPSC-CM.A continuación, deseche el medio y lave la placa con PBS una vez. Cambie el medio a un DMEM libre de rojo fenol que contenga 0.02 peso por volumen por porcentaje de poliol tensioactivo, indicador de calcio cinco-micromolar, y el correspondiente Y-27632, RA, verapamilo, o un volumen igual de PBS, e incubar la placa a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Después de la incubación, deseche el sobrenadante, lave las células con el DMEM libre de tinte tres veces y deje reposar el medio durante 30 minutos para desestimerizar el tinte cartográfico.Coloque el cubreobjetos de semilla de célula en una cámara de baño abierta e inserte la cámara en un sistema de microincubina equilibrado a 37 grados Celsius con un controlador automático de temperatura. Perdague con la solución de Tyrode y agregue continuamente RI, RA o PBS a la solución de perfusión. Utilice un microscopio de fluorescencia invertido y un cabezal de escaneo láser para registrar el transitorio espontáneo de calcio mediante el uso de un escaneo de línea x-t.Registre la contracción espontánea de hiPSC-CM utilizando la funcionalidad de contraste de interferencia diferencial del microscopio confocal. La tasa de supervivencia de las células trasplantadas fue confirmada por el aumento de la actividad luciferasa. El aumento de la troponina cardiaca humana T y la expresión de antígeno nuclear humano mostraron que el pretratamiento Y-27632 podría mejorar significativamente la tasa de injerto celular.Las células pretratadas Y-27632 presentaban una estructura citoesquelética más grande y definida en forma de varilla. Además, el pretratamiento Y-27632 disminuyó las células tuNEL positivas, lo que indica la reducción de la apoptosis hiPSC-CM trasplantada in vivo. Western blot sugirió que el pretratamiento Y-27632 aumentó la expresión de integrina beta-1 y N-cadherina y disminuyó la expresión de la cadena de luz fosfo-miosina 2.Este cambio se normalizó 72 horas después de la retirada de Y-27632. Los experimentos de unión celular HL-1 del ratón in vitro indicaron que el pretratamiento Y-27632 aumentó significativamente la adherencia de hiPSC-CM en relación con hl-1. El pretratamiento Y-27632 redujo la fuerza contráctil, la fluorescencia transitoria de calcio pico y la duración transitoria del calcio.La contracción cardiomiocitos regulada por pretratamiento Y-27632 redujo significativamente la expresión de cTnI y cTnT. Al igual que Y-27632, el pretratamiento verapamilo aumentó la actividad de la luciferasa y el número de células de hcTnT/HNA doble positiva. El paso más importante es cultivar células en el grupo de tratamiento durante 12 horas en el medio Rb-plus complementado con 10 micromolares Y-27632.Basado en este método, la liberación lenta de Y-27632 para aumentar aún más la tasa de injerto celular es una estrategia prometedora. Esta técnica allana el camino para que los investigadores estudien la fisiología y la función de hiPSC de LOS CM in vivo. La molécula pequeña CHIR99021 utilizada para la diferenciación de cardiomiocitos es peligrosa, lo que puede causar irritación respiratoria.Por favor, no inhale ni inhale de ninguna manera.

enhancing-engraftment-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Hemos establecido un protocolo para la inducción de cardioblastos directa de pluripotentes células madre embrionarias humanas mantenidas en condiciones definidas con pequeñas moléculas, lo que permite la derivación de una gran cantidad de células progenitoras cardiacas humanas y funcionales cardiovasculares cardiomiocitos para su reparación.

Derivación eficiente de los Derechos Humanos precursores cardiacos y cardiomiocitos de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

Las células madre pluripotentes, cualquiera de las células madre pluripotentes embrionarias o inducidas (iPS), constituyen una valiosa fuente de células diferenciadas humanas, incluyendo cardiomiocitos. Aquí, nos centraremos en la inducción cardiaca de las células iPS, que muestra cómo usarlos para obtener cardiomiocitos humanos funcionales a través de un protocolo de los organismos con sede en embrioide.

La generación de cardiomiocitos humanos: Protocolo de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas Feeder libres

De suministro de células intramiocárdica en modelos murinos de enfermedades cardiovasculares, como la hipertensión o infarto de miocardio, es ampliamente utilizado para poner a prueba el potencial terapéutico de diferentes tipos de células en los estudios de regeneración. Por lo tanto, una descripción detallada y una visualización clara de este procedimiento quirúrgico ayudarán a definir los límites y las ventajas de los análisis de células terapéuticas cardiovasculares en pequeños roedores.

Intramiocárdica celular de la entrega: Las observaciones en murinos Hearts

El artículo describe la metodología detallada para diferenciar eficazmente células madre pluripotentes humanas en cardiomiocitos mediante la modulación de la vía Wnt selectivamente, seguido por citometría de flujo análisis de marcadores de referencia para evaluar la homogeneidad e identidad de la población.

Alta Eficiencia Diferenciación de células madre pluripotentes humanas a cardiomiocitos y Caracterización por citometría de flujo

Aquí, describimos un protocolo robusto para la derivación de cardiomiocitos humanos que combina la diferenciación cardíaca modulada por moléculas pequeñas y la purificación de cardiomiocitos mediada por privación de glucosa, lo que permite la producción de cardiomiocitos purificados para fines de modelado de enfermedades cardiovasculares y detección de fármacos.

Derivación de cardiomiocitos altamente purificada de células madre humanas pluripotentes inducidas Uso Pequeño Diferenciación molécula modulada y posterior glucosa inanición

Presentamos tres protocolos nuevos y más eficientes para la diferenciación de células madre pluripotentes inducidos por el hombre en cardiomiocitos, células endoteliales, y células del músculo liso y un método de entrega que permite mejorar el injerto de las células transplantadas mediante la combinación de la inyección de células con la entrega de citoquinas parche mediada.

Pluripotentes células madre derivadas de células cardiacas para la reparación del miocardio

Aquí presentamos un método robusto para reprogramar fibroblastos embrionarios primarios en cardiomiocitos funcionales a través de la sobreexpresión de GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 y miR-133 (GHMT2m) junto con la inhibición de la señalización de TGF-β. Nuestro protocolo genera cardiomiocitos paliza tan pronto como transducción después de 7 días con hasta un 60% eficiencia.

Supresión de la señalización Pro-fibróticos potencia Factor-mediada la reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón en cardiomiocitos inducida

Aquí, presentamos un protocolo para generar y expandir de manera robusta los cardiomiocitos humanos a partir de células mononucleares de sangre periférica del paciente.

Generación y expansión de cardiomiocitos humanos a partir de células mononucleares de sangre periférica de pacientes

La administración de células guiadas por ultrasonido alrededor del sitio del infarto de miocardio en ratones es una forma segura, efectiva y conveniente de trasplante de células.

Implantación de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducida por ultrasonido en ratones con infartado de miocardio

Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) ofrecen una alternativa al uso de animales para la detección preclínica de cardiotoxicidad. Una limitación para la adopción generalizada de hiPSC-CM en la detección de toxicidad preclínica es el fenotipo inmaduro de las células. Aquí se presentan protocolos para la maduración robusta y rápida de hiPSC-CM.

Detección de cardiotoxicidad de alto rendimiento utilizando monocapas maduras de cardiomiocitos derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos

El uso de la luz para controlar las células y los tejidos cardíacos permite la estimulación sin contacto, preservando así el estado natural y la función de las células, lo que lo convierte en un enfoque valioso tanto para la investigación básica como para las aplicaciones terapéuticas.

Un sistema microfisiológico cardíaco para estudiar la propagación de Ca2+ a través de la estimulación óptica no genética

Aprende a mejorar el injerto de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas mediante inhibición transitoria de Rho Kinase. Este protocolo eficiente y de bajo costo aumenta la supervivencia celular en modelos de infarto de miocardio.

Mejorar el injerto de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por el hombre a través de una inhibición transitoria de la actividad de Rho Kinase (Video) | JoVE Journal

Mejorar el injerto de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por el hombre a través de una inhibición transitoria de la actividad de Rho Kinase

Explorar más videos