Evaluación de multiplicidad sináptica mediante electrofisiología Patch-clamp de celulares

En el cerebro, un par de neuronas a menudo forman múltiples contactos sinápticos, que se llama multiplicidad sináptica. Sin embargo, el examen preciso de la multiplicidad sináptica requiere experimentos técnicamente desafiantes. Este protocolo describe un método simple para la estimación bruta de la multiplicidad sináptica utilizando electrofisiología de la abrazadera de parche de células enteras.

Este método se puede aplicar a cualquier especie y área del cerebro para investigar la multiplicidad sináptica. Este método requiere habilidades básicas en la electrofisiología de la abrazadera de parche de células enteras. La obtención de grabaciones de alta calidad con baja y estable resistencia al acceso es fundamental para la interpretación precisa de los datos.

Para obtener la configuración de toda la celda, coloque la pipeta de grabación justo encima de la corriente de la pipeta de corte y offset en el modo de abrazadera de voltaje. Aplique una ligera presión positiva a la pipeta y bloquee la llave. A continuación, seleccione una célula sana con una membrana intacta y acérquese al tejido con la pipeta.

La presión positiva debe causar una ligera alteración en el tejido. Lentamente acerque la pipeta a la celda en un movimiento diagonal hasta que se forme un pequeño hoyuelo en la superficie de la célula. A continuación, suelte el bloqueo de presión positivo.

La célula comenzará a formar un sello, y la resistencia aumentará por encima de un gigaohm. En la abrazadera de voltaje, sostenga la celda en menos 68 milivoltios. Posteriormente, tire ligeramente de la pipeta lejos de la celda diagonalmente para eliminar el exceso de presión.

Compensar la capacitancia de pipeta rápida y lenta. Aplique una breve succión a través del tubo conectado al soporte de la pipeta para atravesar la celda y obtener una configuración de celda completa. A continuación, cambie al modo celular en la ventana de prueba de membrana en un software de adquisición y análisis de datos de electrofisiología.

Mantenga la temperatura del baño de grabación en 27 a 30 grados centígrados y el caudal de 1,5 a dos mililitros por minuto para experimentos posteriores. En una sinapsis multiplicidad, un potencial de acción sincroniza la liberación de neurotransmisores y genera una corriente postsináptica más grande. El potencial de acción de bloqueo y la liberación vesicular dependiente del calcio con TTX y cadmio previenen la suma de corriente postsináptica y disminuyen la amplitud.

Cuando no hay multiplicidad, el potencial de acción de bloqueo no cambiará la amplitud. En el experimento uno, para estimar la multiplicidad, sostenga la célula en menos 68 milivoltios mientras la perfunde con aCSF con bajo contenido de calcio. Registre las EPSC espontáneas durante al menos cinco minutos para garantizar una línea de base estable.

A continuación, agregue 30 micromolares 4-AP al aCSF para aumentar los eventos dependientes del potencial de acción y registre las EPSC espontáneas durante al menos 10 minutos para obtener el efecto completo del fármaco. A continuación, agregue 0,5 micromolares TTX y 10 micromolares cadmio al aCSF con 4-AP, y grabe los EPSC en miniatura durante al menos 10 minutos. Para el análisis sin conexión, utilice el último minuto de línea base inmediatamente antes de la aplicación de 4-AP, el minuto 10 de la aplicación 4-AP y el minuto 10 de la aplicación TTX.

En este experimento, el calcio extracelular se sustituye por estroncio para desincronizar la liberación de vesículas sinápticas. Por lo tanto, si la multiplicidad está presente, esto debe disminuir la amplitud de las corrientes postsinápticas. En el experimento dos, registre las EPSC espontáneas durante al menos cinco minutos mientras perfunde la célula con aCSF de calcio normal.

Para desincronizar la liberación de vesículas, comience a perfundirse la célula con aCSF de estroncio y registre las EPSC espontáneas. Para el análisis fuera de línea, para determinar si los EPSC espontáneos de gran amplitud se deben a la liberación síncrona de vesículas, compare el último minuto de línea de base con el minuto 10 de aplicación de estroncio aCSF. Multiplicidad puede implicar liberación multivesicular, que causa una mayor concentración de neurotransmisores en la hendidura sináptica.

La adición de gamma-DGG, un antagonista del receptor AMPA de baja afinidad, conduce a una inhibición menos eficaz de un multicuántal más grande en comparación con las corrientes postsinápticas uniquanales más pequeñas. Sin liberación multivesicular, gamma-DGG será igualmente eficaz en corrientes postsinápticas más grandes y más pequeñas. En el experimento tres, para probar la liberación multivesicular, registre las EPSC espontáneas en aCSF con bajo contenido de calcio durante al menos cinco minutos.

Añadir 30 micromolares 4-AP al aCSF a través del sistema de perfusión. Registre los EPSC espontáneos durante al menos 10 minutos. A continuación, agregue 200 micromolares gamma-DGG al aCSF con 4-AP y registre los EPSC espontáneos durante al menos 10 minutos.

Como experimento de control en una célula separada, repita los procedimientos, pero aplique una concentración baja de DNQX en lugar de gamma-DGG. Para el análisis fuera de línea, analice el último minuto de cada aplicación de fármaco. Las ráfagas de actividad sináptica pueden aumentar transitoriamente la probabilidad de disparo y liberación de los aferentes estimulados.

Si las neuronas exhiben multiplicidad, el aumento en los potenciales de acción debe causar un aumento transitorio en la amplitud de las corrientes postsinápticas. En el experimento cuatro, registre las EPSC espontáneas en el ACSF de calcio normal. Para aumentar el disparo potencial de acción, estimule los aferentes usando un electrodo de vidrio monopolar lleno de aCSF a una velocidad de 20 hercios durante dos segundos, y repita 10 veces con un intervalo de inter-ráfaga de 20 segundos.

Para el análisis, utilice 5.000 milisegundos de EPSC espontáneos antes del primer estímulo como línea de base y compárelos con los EPSC espontáneos de 10 a 300 milisegundos después del estímulo final. A continuación, tome la amplitud media y el cambio de frecuencia durante 10 ensayos. Analizar EPSC espontáneos y EPSC en miniatura utilizando un programa que detecta y analiza corrientes sinápticas.

Utilice los parámetros de detección sugeridos y la función de análisis sin parar para detectar los EPSC mediados por receptores AMPA. Escanee manualmente cada grabación para asegurarse de que el programa detecta con precisión cada evento. Exporte los datos del evento copiándolos en el portapapeles y péguelos en un software de administración de datos.

A continuación, calcule la frecuencia y amplitud medias para cada tratamiento farmacológico y realice los análisis estadísticos pertinentes. En un ejemplo mostrado aquí, 4-AP aumenta la amplitud y la frecuencia de los EPSC espontáneos. La aplicación posterior de TTX y cadmio disminuye tanto la amplitud como la frecuencia.

Aquí está la distribución de la amplitud espontánea EPSC de la grabación. En las neuronas hipotalámicas examinadas aquí, la amplitud y frecuencia de las condiciones basales y TTX son las mismas, lo que sugiere que las EPSC espontáneas basales contienen muy pocas APE dependientes del potencial de acción. En consecuencia, los experimentos posteriores pueden comparar la diferencia entre la línea de base y 4-AP para medir la multiplicidad.

La fuerza de la transmisión sináptica se puede aumentar transitoriamente mediante ráfagas de actividad sináptica. Para investigar la multiplicidad en condiciones más fisiológicas, se puede utilizar una estimulación aferente para aumentar la probabilidad de disparo y liberación potencial de acción. Estos son los resúmenes de los cambios espontáneos de frecuencia y amplitud de la EPSC después de la estimulación sináptica.

Las grabaciones estables son esenciales para una interpretación precisa de los datos. Describa los datos si la resistencia al acceso cambia en más de un 20% durante la grabación, ya que esto podría confundir el análisis. Este protocolo ofrece una forma sencilla de estimar la multiplicidad sináptica, que es un determinante clave de la eficacia sináptica y su plasticidad en diferentes condiciones fisiológicas y fisiopatológicas.