Name: Una estrategia convergente para la generación de una biblioteca de ADNc virtualmente secuenciada a partir de ostras del Pacífico sin referencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 14 s
Description: Aprenda a generar una biblioteca de ADNc virtualmente secuenciada a partir de ostras del Pacífico sin referencia. Este método permite clonar genes biotecnológicamente relevantes evitando la secuenciación convencional.

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Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación de Ciencias Naturales de China (números de concesión 31471703, A0201300537 y 31671854 a J.V. y L.L., otorgar el número 31470435 a G.Y.), y el Plan de Talentos Extranjeros 100 (número de concesión JSB2014012 a J.V.).

NOTA: En la Figura 1se muestra una descripción general esquemática.
1. Recogida de muestras
<ol><li>Obtener muestras de ostras. Mantener las ostras en hielo durante el período postcosecha, el transporte y antes del uso y proceso de laboratorio dentro de 4-7 días después de la compra. NOTA: Para este protocolo, se compraron ostras en Zhong Cai Wholesale Market en Nanjing (procedentes de Ningde, Fujian, China y Lianyungang, Jiangsu, China), Haijie Aquatic Product Company en Qingdao (procedentes de Qingdao, Shandong, China), Jucheng), Jucheng Aquatic Product Company en Yantai (originaria de Yantai, Shandong, China) y Jinxiu Aquatic Product Company en Qingdao (procedente de Qingdao, Shandong, China)).</li>
</ol>2. Aislamiento de ARN por extracción de guanidinio tiocianato-fenol
<ol><li>Preparación de la muestra de tejido ostra<ol>
<li>Corte aproximadamente 100 mg de tejido blando homogéneo desde el centro geométrico aproximado de cada espécimen de ostra con un bisturí esterilizado, y transfiera las muestras a nitrógeno líquido.</li>
		<li>Eutanasia la parte restante de las ostras congelando a -80oC durante 1 h y desechar como residuos biológicos.</li>
		<li>Moler el tejido de ostras congelado en un polvo fino en un mortero (200 ml) lleno de 50 ml de nitrógeno líquido.</li>
		<li>Pesar 75 mg del tejido congelado de cada espécimen en un tubo de centrífuga estéril de 1,5 ml y mezclar con 1 ml del reactivo de extracción de guanidinio tiocianato-fenol. Centrifugar la muestra a 14.000 x g a 4oC durante 15 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo centrífugo de 1,5 ml, agregue 200 ml de cloroformo y mezcle bien utilizando un mezclador de vórtice durante 10-15 s hasta que la mezcla se vuelva de color blanco lechoso.</li>
	<li>Centrifugar a 14.000 x g a 4 oC durante 15 minutos, y transferir la capa acuosa superior cuidadosamente con una pipeta de 200 ml sin perturbar la interfase en un nuevo tubo centrífugo de 1,5 ml.</li>
	<li>Añadir 500 l de alcohol isopropílico y mezclar las muestras suavemente por inversión, luego dejar las muestras durante 20 minutos sobre hielo. Centrifugar a 14.000 x g a 4oC durante 8 min y retirar el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspenda cada uno de los pellets en 1 ml de 75% EtOH, y centrífuga a 14.000 x g a 4 oC durante 5 min. Retire todo el sobrenadante.</li>
	<li>Repita el paso 2.5 una vez. Secar los pellets durante 6 min a temperatura ambiente. No secar durante más tiempo; de lo contrario, puede ser difícil disolver el pellet de ARN en el siguiente paso.</li>
	<li>Disolver el pellet de ARN seco en 25 ml de agua tratada con DEPC (dietilpirocarbonato) y mantener el tubo sobre hielo. Utilice muestras de ARN dentro de las 24 horas.</li>
</ol>3. Generación de la biblioteca cDNA por transcripción inversa
<ol><li>Para cada muestra de ARN, prepare una mezcla de reacción utilizando el sistema de transcripción inversa comercial utilizando una pipeta de 10 l: Añadir 4 l de solución de MgCl2, 2 l de búfer de reacción 10x, 2 l de solución dNTP, 0,5 ml de inhibidor de la RNase, 0,7 l de AMV Reverse Transcriptasa, 0,5 l de Oligo(dT) 15 imprimación, 1 l de la muestra de ARN extraída y 9,3 l de H2O en un tubo de PCR de 300 ml.</li>
	<li>Incubar la mezcla en un termociclador PCR durante 60 min a 42 oC, y luego aumentar la temperatura a 95 oC durante 5 min.</li>
	<li>Almacene la biblioteca de ADNc generada durante un máximo de 12 meses a -20 oC.</li>
</ol>4. Amplificación y purificación del gen mitocondrial
<ol><li>Preparar la mezcla de PCR con una pipeta de 10 ml. Añadir 0,25 l (1,25 U) de polimerasa de ADN de alta fidelidad, 2 l de solución dNTP (2,5 mM de cada dNTP), 0,5 l de la imprimación delantera COX1 o ND (100 m), 0,5 l de la imprimación inversa COX1 o ND correspondiente (100 m), 1 l de la biblioteca de ADNc (100 oM), 1 l de la biblioteca de ADNc. , 5 l de solución tampón de 5x y 16 l de H2O destilado en un tubo pcR de 300 ml.</li>
	<li>Realizar la amplificación de PCR utilizando los siguientes parámetros: Después de un paso inicial de desnaturalización a 95 oC (duración 5 min), 35 ciclos de reacción de PCR que consisten en un paso de recocido a 55 oC (30 s), paso de alargamiento a 72 oC (2 min) y paso de desnaturalización a 95 oC (30 s) , realice un paso de alargamiento final durante 5 min a 72 oC.</li>
	<li>Utilizar 5 l del producto PCR para verificar mediante electroforesis de gel de agarosa la calidad del producto PCR obtenido. Observe el gen COX1 o ND amplificado como una sola banda en 759 o 748 pares base, respectivamente.</li>
	<li>Purifique el resto del producto PCR con un kit de limpieza de PCR.<ol>
<li>Añadir 100 l de solución 'PCR-A' (tampón de unión de ADN que contiene altas concentraciones de sales chaotrópicas11) a la muestra. Vórtice brevemente para mezclar el contenido.</li>
		<li>Coloque la columna de purificación en un tubo centrífugo de 2 ml. Pipetear la mezcla de reacción de 4.4.1. en la columna. Centrífuga a 14.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Deseche el filtrado del tubo de centrífuga. Devolver la columna al tubo centrífugo de 2 ml, añadir 700 ml de solución 'W2' en la columna y centrifugar a 14.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente ('W2' es una solución de lavado que contiene altas concentraciones de etanol para la eliminación de chaotrópico residual sales de la columna de purificación).</li>
		<li>Deseche el filtrado y devuelva la columna al tubo centrífugo de 2 ml. Añadir 400 ml de solución 'W2' a la columna y centrifugar a 14.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Precalentar 1 ml de agua desionizada a 65 oC en un calentador de bloque metálico. Transfiera la columna a un nuevo tubo centrífugo de 1,5 ml. Pipeta de 25 oC de agua desionizada precalentada en caliente de 65oC hasta el centro de la membrana de la columna blanca. Deje que la membrana se empape durante 1 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugar a 14.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente y desechar la columna.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Almacene el producto PCR purificado durante un máximo de 12 meses a -20 oC.</li>
</ol>5. Secuenciación y comparación del gen mitocondrial
<ol><li>Envíe las muestras de PCR purificadas del paso 4.5 para la secuenciación de Sanger utilizando las imprimaciones de avance COX1 o ND pertinentes como imprimaciones de secuenciación. Opcionalmente, las imprimaciones inversas COX1 o ND también se pueden utilizar para la secuenciación bidireccional.</li>
	<li>Después de recuperar los resultados de la secuenciación, compare las secuencias con la secuencia del genoma de la cepa de referencia de ostras del Pacífico (NCBI Taxonomy ID: 29159) utilizando la herramienta en línea NCBI Nucleotide BLAST (blast.ncbi.nlm.nih.gov) (Figura2 y Figura 3 ).</li>
</ol>6. Aplicar la biblioteca de ADNpara la clonación de los genes MgUGD y MgUXS
<ol><li>Amplifique y purifique los genes MgUGD y MgUXS utilizando las respectivas imprimaciones delanteras y inversas de MgUGD y MgUXS mediante PCR siguiendo los pasos 4.1. a 4.4.</li>
	<li>Transfiera 2 ml de tampón de digestión (10x concentrado) y 6 l de agua desionizada a un tubo centrífugo de 1,5 ml. Añadir 10 l de los productos de PCR MgUGD o MgUXS purificados junto con las endonucleaseas de restricción Nde I y Xho I (1 l cada uno, 20 U). Incubar a 37oC durante 3 h.</li>
	<li>Preparar el vector pET-30a predigerido: Transfiera 500 ng del vector pET-30a a un nuevo tubo centrífugo de 1,5 ml y recabe el volumen a 16 ml utilizando agua desionizada. Añadir 2 l de tampón de digestión (10x concentrado) junto con las restricciones endonucleaseas Nde I y Xho I (1 l cada una, 20 U).<ol>
<li>Después de incubar la mezcla a 37oC durante 3 h, añadir 1 oL de fosfatasa alcalina (1 U) e incubar a 37oC durante una hora adicional. Inactivar la fosfatasa alcalina calentando a 75 oC durante 10 minutos en un calentador de bloque de metal precalentado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfiera 4 l de los productos de ADN MgUGD o MgUXS digeridos a tubos de centrífuga frescos de 1,5 ml y añada 4 ml del vector pET-30a digerido. Añadir 1 l de tampón de ligadura (10x), 1 l de ligada T4 (3 U) e incubar la mezcla de reacción a 22 oC durante 3 h.</li>
	<li>Transformar electrocompetente E. coli Mach1 Células competentes por electroporación utilizando los productos de ligadura. Extienda las células transformadas en placas de agar LB que contengan kanamicina de 50 g/ml. Incubar células a 37oC durante 16 h.</li>
	<li>Verifique las colonias para la inserción deseada por secuenciación de Sanger usando las imprimaciones de terminador y promotora T7 específicas del plásmido. Preparar plásmidos de los clones bacterianos validados.</li>
</ol>7. Pruebas de expresión y actividad de MgUGD y MgUXS
<ol><li>Transforme E. coli BL21 (DE3) Células competentes con plásmidos que llevan los genes MgUGD y MgUXS y extienda las células transformadas en placas de agar LB que contienen kanamicina de 50 g/ml. Incubar células a 37oC durante 16 h.</li>
	<li>Cultivar una sola colonia en medio LB de 5 ml con kanamicina de 50 g/ml durante la noche. Transfiera el cultivo a un medio LB de 400 ml y agite continuamente a 200 rpm a una temperatura de 37 oC hasta que la densidad óptica a una longitud de onda de 600 nm (OD600)alcance una absorción de aproximadamente 0,5.<ol>
<li>Reducir la temperatura de incubación a 20 oC y añadir 400 s de isopropilo-D-thiogalactopyranoside (concentración 1 M). Inducir la expresión de las proteínas recombinantes durante 3 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cosecha las células por centrifugación a 4.500 x g durante 15 min a 4oC. Suspenda los pellets en 10 ml de tampón de lisis (100 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl, 1% Triton X-100, 1 mM de flúor fenilsulfonil(PMSF), pH 8.0).</li>
	<li>Interrumpir las células por sonicación durante 20 min (40 ciclos de encendido/apagado con una amplitud de 20 m durante 15 s a 4 oC). Centrifugar a 14.000 x g a 4oC durante 20 min y recoger el sobrenadante para la prueba de actividad.</li>
	<li>Realizar el ensayo de actividad de MgUGD incubando 2 l de lisato celular con 2 l de UDP-glucosa (10 mM), 4 l de NAD+ (10 mM), 4 l de MgCl2 (10 mM), 2 l de tampón Tris/HCl (500 mM, pH 7,5) y 6 l de desionizado H2O en un nuevo 1,5 MM mL centrífuga tubo e incubar a 37 oC durante 30 min.</li>
	<li>Realice el ensayo de actividad de MgUXS incubando 2 l de lisato celular con 2 l de ácido UDP-glucurónico (10 mM), 2 l de tampón Tris/HCl (500 mM, pH 7,5) y 14 l de H2O desionizado en un nuevo tubo de centrifugación de 1,5 ml e incubar a 37 oC durante 30 minutos.</li>
	<li>Atemple las reacciones en los pasos 7.5 y 7.6 añadiendo 20 s de metanol y 40 s de cloroformo a cada mezcla. Después de vórtice las mezclas de muestra, centrifugar a 14.000 x g durante 6 min a 4 oC y recoger la capa acuosa superior de cada tubo.</li>
	<li>Analice los productos de reacción utilizando espectrometría de masas MALDI-TOF en modo de ionización negativa en el rango m/z de 500-700. Mezclar 1 l de mezcla de muestra con 1 l de matriz de muestra de ácido dihidroxibenzoico de 2,5-dihidroxibenzoico (1% p/V en acetonitrilo acuoso al 50%). Observe los valores m/z esperados en 579 y 535 para el ácido UDP-glucurónico y UDP-xilosa, respectivamente (Figura4).</li>
</ol>

<ol><li>Blaxter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+a+DNA+taxonomy%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological%22%5BJournal%5D)">The promise of a DNA taxonomy.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359 (1444), 669-679 (2004).</li>
<li>Wen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+identification+of+dried+shellfish+%28oyster%2C+clam+and+mussel%29+products+sold+on+the+Chinese+market%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Control%22%5BJournal%5D)">Species identification of dried shellfish (oyster, clam and mussel) products sold on the Chinese market.</a> Food Control. 90, 199-204 (2018).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+cob+and+cox1+genes+and+editing+of+the+corresponding+mRNAs+in+Dinophysis+acuminata+from+Narragansett+Bay%2C+with+special+reference+to+the+phylogenetic+position+of+the+genus+Dinophysis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial cob and cox1 genes and editing of the corresponding mRNAs in Dinophysis acuminata from Narragansett Bay, with special reference to the phylogenetic position of the genus Dinophysis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74 (5), 1546-1554 (2007).</li>
<li>Sell, J., Spirkovski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+differentiation+between+two+forms+of+trout+Salmo+letnica%2C+endemic+to+the+Balkan+Lake+Ohrid%2C+reflects+their+reproductive+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA differentiation between two forms of trout Salmo letnica, endemic to the Balkan Lake Ohrid, reflects their reproductive isolation.</a> Molecular Ecology. 13, 3633-3644 (2004).</li>
<li>Karadjian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+rearranged+mitochondrial+genome+in+Nycteria+parasites+%28Haemosporidia%29+from+bats%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Highly rearranged mitochondrial genome in Nycteria parasites (Haemosporidia) from bats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 9834-9839 (2018).</li>
<li>Morga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+from+flat+oyster+Ostrea+edulis+as+suitable+housekeeping+genes+for+quantitative+real+time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+and+Shellfish+Immunology%22%5BJournal%5D)">Identification of genes from flat oyster Ostrea edulis as suitable housekeeping genes for quantitative real time PCR.</a> Fish and Shellfish Immunology. 29 (6), 937-945 (2010).</li>
<li>Delsuc, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+systematics+of+armadillos+%28Xenarthra%2C+Dasypodidae%29%3A+contribution+of+maximum+likelihood+and+Bayesian+analyses+of+mitochondrial+and+nuclear+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Phylogenetics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Molecular systematics of armadillos (Xenarthra, Dasypodidae): contribution of maximum likelihood and Bayesian analyses of mitochondrial and nuclear genes.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 28 (2), 261-265 (2005).</li>
<li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+Biochemical+Characterization+of+UDP-Glucose+Dehydrogenase+from+Akkermansia+muciniphila%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Peptide+Letters%22%5BJournal%5D)">Discovery and Biochemical Characterization of UDP-Glucose Dehydrogenase from Akkermansia muciniphila.</a> Protein & Peptide Letters. 24 (8), 735-741 (2017).</li>
<li>Gu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+Biochemical+Characterization+of+the+UDP-Xylose+Biosynthesis+Pathway+in+Sphaerobacter+thermophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Peptide+Letters%22%5BJournal%5D)">Discovery and Biochemical Characterization of the UDP-Xylose Biosynthesis Pathway in Sphaerobacter thermophilus.</a> Protein & Peptide Letters. 23 (12), 1103-1110 (2016).</li>
<li>Duan, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+UDP-xylose+biosynthesis+pathway+in+Rhodothermus+marinus%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the UDP-xylose biosynthesis pathway in Rhodothermus marinus.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (22), 9463-9472 (2015).</li>
<li>Vogelstein, B., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparative+and+analytical+purification+of+DNA+from+agarose%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Preparative and analytical purification of DNA from agarose.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).</li>
<li>Song, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UDP-glucose+4-epimerase+and+%CE%B2-1%2C4-galactosyltransferase+from+the+oyster+Magallana+gigas+as+valuable+biocatalysts+for+the+production+of+galactosylated+products%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">UDP-glucose 4-epimerase and β-1,4-galactosyltransferase from the oyster Magallana gigas as valuable biocatalysts for the production of galactosylated products.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1600(2018).</li>
<li>Gainey, P. A., Phelps, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uridine+diphosphate+glucuronic+acid+production+and+utilization+in+various+tissues+actively+synthesizing+glycosaminoglycans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Uridine diphosphate glucuronic acid production and utilization in various tissues actively synthesizing glycosaminoglycans.</a> Biochemical Journal. 128 (2), 215-227 (1972).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo presentado permite la identificación genética de muestras de ostras sin referencia con fenotipo similar de los mercados regionales de mariscos en comparación con los genes COX1 y ND con una base de datos de genoma de ADN de ostra disponible públicamente. La importancia de este método radica en su simplicidad, ya que sólo se necesita una sola reacción de PCR para la evaluación de la biblioteca virtual de ADNc. Los dos genes mitocondriales COX1 y ND conservados se amplificaron a partir de una biblioteca de ADN...

La adquisición de material biológico vivo al que se hace referencia puede ser difícil debido a largos plazos de entrega, razonamiento empresarial o regulaciones aduaneras específicas de cada país. Como alternativa, el material biológico requerido también puede recogerse de muestras fenotípicamente idénticas. Sin embargo, estas muestras pueden variar significativamente a nivel de genotipo, y por lo tanto las comparaciones con genomas de referencia almacenados digitalmente de la misma especie a menudo se hacen difíciles o incluso inútiles debido a la incompatibilidad del material de nueva fuente con métodos de amplificación de ADN existentes. La secuenciación de genes altamente conservados de muestras individualeses una herramienta ampliamente utilizada y poderosa para identificar la especie 1, como los genes mitocondriales conservados que se utilizan con frecuencia como genes de referencia para la evaluación de la calidad de las bibliotecas de ADNc2 ,3,4,5,6. La razón subyacente para el método aquí presentado es que la alta conservación de las secuencias genéticas mitocondriales en muestras de ostras anónimas individuales en comparación con las secuencias correspondientes del genoma de referencia indica que otros genes también pueden mostrar una bajo nivel de divergencia, dada la tasa generalmente más rápida deevolución del ADN mitocondrial en relación con el ADN nuclear 7, lo que permite la amplificación y el aislamiento de una amplia gama de genes científica e industrialmente relevantes simplemente utilizando públicamente datos de secuenciación disponibles como referencia.
El objetivo general del método aquí descrito es presentar un flujo de trabajo optimizado para generar una biblioteca de ADNc de ostras virtualmente secuenciada que se puede utilizar como ADN de plantilla para la clonación de genes de ostras. En la secuenciación virtual, se elude la secuenciación del genoma de novo; en su lugar, una secuencia de referencia conocida y almacenada digitalmente se utiliza directamente para utilizar o diseñar imprimaciones para la producción de cDNA que finalmente comprenderán una biblioteca (o se agregarán a una preexistente). El objetivo es producir una biblioteca convergente de ADNc, lo que significa que las similitudes entre las secuencias de ADNc generadas y la secuencia de referencia se pueden clasificar de baja a alta divergencia. Una ventaja clave del uso de la subunidad 1 del citocromo C Oxidasa (COX1) y nadh deshidrogenasa (ND) como genes de referencia es que incluso los especímenes de ostras altamente disyuntos geográficamente pueden ser perfilados debido a la alta conservación de estos genes mitocondriales. Habiendo demostrado el enfoque con estos marcadores bien establecidos, demostramos su aplicación a dos candidatos a enzimas que participan en la biosíntesis de nucleótidos de azúcar y pueden ser de relevancia industrial8,9, 10. El potencial biotecnológico de la ostra del Pacífico aún no está explorado. Por lo tanto, creemos que este método convergente para la preparación de una biblioteca de ADNc prácticamente secuenciada también será adecuado para los investigadores no especializados que quieren generar ADNc a partir de este material biológico relevante.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Químicos:</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% Triton X-100</td><td>Solarbio</td><td>9002-93-1</td><td>*Distribuidores alternativos posibles</td></tr><tr><td>Ácido 2,5-dihidroxibenzoico</td><td>Alfa Aesar</td><td>490-79-9</td><td>*Distribuidores alternativos posibles</td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Merck</td><td>75-05-8</td><td>*Distribuidores alternativos</td></tr><tr><td>posibles Agarosa para biología molecular</td><td>Biowest Chemicals</td><td>111860</td><td>*Posibles distribuidores alternativos</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Solarbio</td><td>69-52-3</td><td>*Posibilidad de distribuidores alternativos</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Lingfeng, Shanghai</td><td>67-66-3</td><td>*Posibilidad de distribuidores alternativos</td></tr><tr><td>DEPC water</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0601</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Jinhuada, Guangzhou</td><td>64-17-5</td><td>*Posibles distribuidores alternativos</td></tr><tr><td>Reactivo de tiocianato-fenol de guanidinio</td><td>Reactivo de Invitrogen</td><td>15596018</td><td>TRIzol</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Energy Chemical</td><td>288-32-4</td><td>*Distribuidores alternativos posibles</td></tr><tr><td>Alcohol isopropílico</td><td>Reactivo químico de Nanjing</td><td>67-63-0</td><td>*Distribuidores alternativos posibles</td></tr><tr><td>Isopropil y beta;- D-tiogalactopiranósido</td><td>Solarbio</td><td>367-93-1</td><td>*Distribuidores alternativos posibles</td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Solarbio</td><td>25389-94-0</td><td>*Distribuidores alternativos posibles</td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Thermo Fisher</td><td>22700025</td><td>*Distribuidores alternativos posibles</td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Thermo Fisher</td><td>10855021</td><td>*Distribuidores alternativos</td></tr><tr><td>posibles Metanol</td><td>Jinhuada, Guangzhou</td><td>67-56-1</td><td>*Posibles distribuidores alternativos</td></tr><tr><td>MgCl2 hexahidrato</td><td>Xilong Huagong</td><td>7791-18-6</td><td>*Posibles distribuidores alternativos</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Xilong Huagong</td><td>7647-14-5</td><td>*Posibles distribuidores alternativos</td></tr><tr><td>NAD+</td><td>Debidamente Biotech</td><td>53-84-9</td><td>*Distribuidores alternativos posibles</td></tr><tr><td>Fluoruro de fenil-metilsulfonilo</td><td>Macklin</td><td>329-98-6</td><td>*Posibilidad de distribuidores</td></tr><tr><td>alternativos Tris</td><td>Solarbio</td><td>77-86-1</td><td>*Posibilidad de distribuidores alternativos</td></tr><tr><td>UDP-glucosa</td><td>Wuhu Nuowei Chemicals</td><td>28053-08-9</td><td>*Posibilidad de distribuidores alternativos</td></tr><tr><td>UDP-ácido glucurónico</td><td>SIGMA</td><td>63700-19-6</td><td>*Posibilidad de distribuidores alternativos</td></tr><tr><td>Herramientas/Instrumentos:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>espectrómetro de masas MALDI-TOF</td><td>Bruker</td><td>Autoflex</td><td>*Posibilidad de distribuidores alternativos</td></tr><tr><td>Calentador de bloque metálico</td><td>Long Yang Scientific Instruments</td><td>Thermoshaker HB20</td><td>*Posibilidad de distribuidores alternativos</td></tr><tr><td>Termociclador PCR</td><td>Hema</td><td>9600</td><td>*Posibilidad</td></tr> <tr><td>de distribuidores alternativos<fuerte>Enzima y kits: </fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 veces; Tampón de ligadura</td><td>Thermo Scientific</td><td>B69</td><td>*Distribuidores alternativos posibles</td></tr><tr><td>5&veces; Tampón PrimeSTAR</td><td>Takara</td><td>9158A</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatasa alcalina</td><td>ThermoFisher FastAP</td><td>EF0654</td><td>*Posibilidad de distribuidores alternativos</td></tr><tr><td>Imprimación directa COX</td><td>Genscript</td><td>ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG</td><td></td></tr><tr><td>Imprimación inversa COX</td><td>Genscript</td><td>ACTTGACCAAAAACATAAGACATG</td><td></td></tr><tr><td>Tampón Cutsmart NEB</td><td></td><td>B7204S</td><td>*Alternativa distribuidores posibles</td></tr><tr><td>mezcla dNTP</td><td>Invitrogen</td><td>18427088</td><td></td></tr><tr><td>MgUGD imprimación directa</td><td>Genscript</td><td>ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTGTGT</td><td></td></tr><tr><td>MgUGD imprimación inversa</td><td>Genscript</td><td>ACTCGAGACTCTGGGGCGGTGGAG</td><td></td></tr><tr><td>MgUXS imprimación directa</td><td>Genscript</td><td>CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC</td><td></td></tr><tr><td>MgUXS imprimación inversa</td><td>Genscript</td><td>ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT</td><td></td></tr><tr><td>ND imprimación directa</td><td>Genscript</td><td>ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT</td><td></td></tr><tr><td>ND imprimación inversa</td><td>Genscript</td><td>ATGTATTTTGGAAAAAATCTCCAC</td><td></td></tr><tr><td>PCR Cleanup Kit</td><td>AxyGen</td><td>AP-PCR-250</td><td>*Distribuidores alternativos posibles</td></tr><tr><td>vector pET-30a(+)</td><td>Merck Millipore</td><td>69909</td><td></td></tr></tbody></table>

una estrategia convergente para la generación de una biblioteca de adnc virtualmente secuenciada a partir de ostras del pacífico sin referencia

A Converging Strategy for the Generation of a Virtually Sequenced cDNA Library from Unreferenced Pacific Oysters

El acceso al material biológico de las especies de referencia, que se utilizaron anteriormente en experimentos clave, como en el desarrollo de nuevas líneas celulares o proyectos de secuenciación del genoma, a menudo son difíciles de proporcionar para estudios adicionales o terceros debido a la carácter consintontivo de las muestras. Aunque ahora se distribuyen ampliamente en las costas del Pacífico de Asia, Australia y América del Norte, los especímenes individuales de ostras del Pacífico son genéticamente muy diversos y, por lo tanto, no son directamente adecuados como material de partida para bibliotecas de genes. En este artículo, demostramos el uso de especímenes de ostras del Pacífico sin referencia obtenidos de los mercados regionales de mariscos para generar bibliotecas de ADNc. Estas bibliotecas se compararon entonces con el genoma de la ostra disponible públicamente, y la biblioteca relacionada más cercana fue seleccionada utilizando los genes de referencia mitocondrialCón C Oxidase subunit I (COX1) y NADH Dehydrogenase (ND). La idoneidad de la biblioteca de ADNc generada también se demuestra mediante la clonación y expresión de dos genes que codifican las enzimas UDP-glucurónica acid deshidrogenasa (UGD) y UDP-xilosa sintasa (UXS), que son responsables de la biosíntesis de UDP-xilosa de UDP-glucosa.

La Figura 1 muestra una descripción esquemática del método de preparación descrito de la biblioteca convergente de ADNc derivada de individuos de ostras del Pacífico. La Figura 2 muestra las secuencias de los genes COX1 y ND de un espécimen de ostra distantemente relacionado con alta divergencia de las secuencias genéticas COX1 y ND del material de referencia. La Figura 3 muestra las secuencias de los genes COX1 y ND de un espécimen...

Describimos una estrategia para utilizar muestras de ARN de muestras de ostras del Pacífico sin referencia, y evaluamos el material genético en comparación con los datos del genoma disponibles públicamente para generar una biblioteca de ADNc virtualmente secuenciada.

Una estrategia convergente para la generación de una biblioteca de ADNc virtualmente secuenciada a partir de ostras del Pacífico sin referencia

The access to biological material of reference species, which were used previously in key experiments such as in the development of novel cell lines or ...

La pregunta clave que queremos abordar con este método es ¿cómo podemos utilizar muestras de ARN de material comprado en los mercados alimentarios locales para la clonación de genes biotecnológicamente relevantes? Aquí, utilizamos las ostras del Pacífico como un caso de estudio para demostrar este enfoque y posible aplicación adicional. La principal ventaja de esta técnica es que se puede eludir la secuenciación convencional del genoma o adnc de las muestras de ostras.En su lugar, se compararon las secuencias de la subunidad I y la deshidrogenasa del citocromo c oxidasa con las secuencias de referencia disponibles públicamente de la ostra del Pacífico para seleccionar el espécimen más estrechamente relacionado. El ADNc preparado a partir de este espécimen se puede utilizar directamente para la clonación de genes biotecnológicamente relevantes, que se pueden seleccionar utilizando la información de la secuencia pública. Demostrando el procedimiento estarán Yongmei Lyu y Yuquan Li, dos estudiantes graduados del Centro de Investigación de Bioingeniería de Glicómica y Glicánía de la Universidad Agrícola de Nanjing.Para preparar la muestra de tejido de ostras, utilice un bisturí esterilizado para cortar aproximadamente 100 miligramos de tejido blando homogéneo del centro geométrico aproximado de cada muestra de ostra. Transfiera la muestra a un mortero lleno de 50 mililitros de nitrógeno líquido. Moler el tejido de ostras congelados en un polvo fino.Pesar 75 miligramos del tejido congelado de cada espécimen en un tubo estéril de centrífuga de 1,5 mililitros, y mezclar con un mililitro de reactivo de extracción de guanidinio tiocianato-fenol. El paso más crítico de este procedimiento es el paso de extracción de ARN. Con el fin de minimizar la degradación del ARN, es esencial reducir el tiempo entre la recolección del tejido de ostra y la extracción de ARN.Centrifugar la muestra a 14.000 veces g y cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo centrífugo de 1,5 mililitros, agregue 200 microlitros de cloroformo y mezcle bien en un mezclador de vórtice durante 10 a 15 segundos hasta que la mezcla se vuelva blanca lechosa. A continuación, centrifugar durante 15 minutos como se hizo anteriormente.Con una pipeta de 200 microlitros, transfiera cuidadosamente la capa acuosa superior, sin alterar la interfase, a un nuevo tubo centrífugo de 1,5 mililitros. Agregue 500 microlitros de alcohol isopropílico en el tubo centrífugo e invierta suavemente para mezclar las muestras. Luego deje las muestras sobre hielo durante 20 minutos.Centrifugar a 14.000 veces g y cuatro grados centígrados durante ocho minutos, y retire el sobrenadante. Resuspender el pellet en un mililitro de 75% etanol, y centrifugar a 14.000 veces g y cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Retire todo el sobrenadante y repita el lavado en etanol.Seque los pellets durante seis minutos a temperatura ambiente. Luego, disuelva el pellet de ARN seco en 25 microlitros de agua tratada con DEPC, y mantenga el tubo en hielo. Utilice las muestras de ARN en un plazo de 24 horas.Para generar una biblioteca de ADNc, primero prepare una mezcla de reacción para cada muestra de ARN en un tubo PCR de 300 microlitios añadiendo soluciones según el manuscrito. Agregue un microlitro de la muestra de ARN extraída en el tubo. Incubar la mezcla en un termociclador PCR durante 60 minutos a 42 grados Celsius, y luego aumentar la temperatura a 95 grados Celsius durante cinco minutos.Almacene la biblioteca de ADNc generada durante un máximo de 12 meses a menos 20 grados centígrados. En primer lugar, añada un microlitro de la biblioteca de ADNc generada a los tubos que contengan mezclas de PCR, preparados de acuerdo con el manuscrito. Coloque los tubos PCR en el termociclador PCR y realice la amplificación de PCR con un paso de desnaturalización inicial y 35 ciclos de reacción PCR que consisten en un paso de recocido, un paso de alargamiento y un paso de desnaturalización según el manuscrito.Después de los ciclos, realice un paso de alargamiento final durante cinco minutos. Utilice cinco microlitros del producto PCR para verificar la calidad por electroforesis de gel de agarosa. Observe el gen COX1 o ND amplificado como una sola banda en 759 o 748 pares base, respectivamente.Para purificar el resto del producto PCR, añada 100 microlitros de tampón de unión al ADN que contenga altas concentraciones de sales caotrópicas a cada muestra. Vortex brevemente para mezclar el contenido. Coloque una columna de purificación en un tubo centrífugo de dos mililitros.Pipetear la mezcla de reacción en la columna. Coloque el tubo con la columna montada en una centrífuga a 14.000 g durante un minuto a temperatura ambiente. Después de desechar el filtrado del tubo centrífugo de dos mililitros, lave dos veces con 700 y 400 microlitros de la solución de lavado W2 centrifugando a 14.000 g.A continuación, calienta un mililitro de agua desionizada a 65 grados Celsius en un calentador de bloques metálicos. Transfiera la columna a un nuevo tubo centrífugo de 1,5 mililitros y pipetee 25 microlitros del agua desionizada precalentada al centro de la membrana de la columna blanca. Deje que la membrana se empape durante un minuto a temperatura ambiente.A continuación, centrifugar el tubo con la columna a 14.000 g durante un minuto a temperatura ambiente. Deseche la columna y almacene el producto de PCR purificado durante un máximo de 12 meses a menos de 20 grados centígrados. Opcionalmente, las imprimaciones inversas COX1 o ND también se pueden utilizar para la secuenciación bidireccional.Para la secuenciación de Sanger, utilice la imprimación de avance COX1 o ND correspondiente. Después de recuperar los resultados de la secuenciación, compare las secuencias con la secuencia del genoma de la cepa de referencia de ostras del Pacífico utilizando la herramienta en línea NCBI Nucleótida BLAST. Utilice las imprimaciones respectivas hacia adelante y hacia atrás de los genes MgUGD y MgUXS para amplificar y purificar por PCR como se hizo anteriormente.Después de incubar productos de PCR purificados con tampón de digestión, prepare el vector pET-30a predigerido disolviendo 500 nanogramos de pET-30a en un tubo centrífugo de 1,5 mililitros y agregue agua desionizada para recargar hasta 16 microlitros. A continuación, agregue dos microlitros de tampón de digestión concentrada 10 veces y un microlitro cada una de las 20 unidades de restricción endonuclea Nde1 y Xho1 en el tubo. Incubar la mezcla a 37 grados centígrados durante tres horas.Después de eso, agregue un microlitro de fosfatasa alcalina de una unidad, e incubar a 37 grados Celsius durante una hora adicional. A continuación, coloque el tubo en un calentador de bloque de metal precalentado a 75 grados Celsius durante 10 minutos para inactivar la fosfatasa alcalina. Después de cultivar células E.coli BL21 que llevan los genes MgUGD y MgUXS, transfiera el cultivo a un medio LB de 400 mililitros en un matraz de agitación de dos litros y colóquelo en una coctelera a 200 rpm a una temperatura de 37 grados centígrados.Después de tres horas, compruebe la densidad óptica de un fotómetro a una longitud de onda de 600 nanómetros y asegúrese de que alcanza una absorción de aproximadamente 0,5. A continuación, reduzca la temperatura del agitador a 20 grados centígrados. Añadir 400 microlitros de IPTG de un molar para inducir la expresión de las proteínas recombinantes durante tres horas.Después de cosechar las células, interrumpir las células por sonicación durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. Centrifugar a 14.000 veces g y cuatro grados Celsius durante 20 minutos, y recoger el sobrenadante en un nuevo tubo para la prueba de actividad. Después del ensayo de actividad, apague las reacciones añadiendo 20 microlitros de metanol y 40 microlitros de cloroformo a las mezclas MgUXS y MgUGD.Vórtice las mezclas de muestras, y centrifugar a 14.000 veces g durante seis minutos y cuatro grados centígrados. Recoja la capa acuosa superior de cada tubo en nuevos tubos para espectrometría de masas MALDI-TOF. En este experimento, se comparó la alineación de secuencia de las secuencias genéticas COX1 y ND de un espécimen altamente divergente con la cepa de ostras del Pacífico de referencia.Las flechas rojas muestran diferencias de nucleótidos entre la secuencia de referencia y la secuencia de las muestras de ADNc obtenidas. Las secuencias de los genes COX1 y ND de un espécimen de ostra estrechamente relacionado muestran una baja divergencia con la cepa de ostras del Pacífico de referencia. La espectrometría de masas MALDI-TOF muestra la aplicación exitosa de la biblioteca cDNA para clonar los genes industrialmente relevantes MgUGD y MgUXS.La imagen de gel también identifica el ácido UDP-glucurónico y UDP-xilosa generado por la acción enzimática de los sucesivamente expresados y purificados MgUGD y MgUXS. Este método no requiere una coincidencia perfecta entre la secuencia de referencia y las secuencias de marcadores obtenidas y debe dar al investigador confianza para trabajar con ostras sin referencia. En principio, este método se puede aplicar a cualquier muestra biológica sin referencia para la que se disponga públicamente de secuencias de una especie de referencia estrechamente relacionada.Este método permite a los investigadores no expertos acceder fácilmente a material genético de importancia biológica potencial y allana el camino para que más científicos trabajen con muestras biológicas de fácil acceso pero incompletamente identificadas.

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Una estrategia convergente para la generación de una biblioteca de ADNc virtualmente secuenciada a partir de ostras del Pacífico sin referencia

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