Name: En Vivo Reprogramación Directa de Células Gliales Residentes en Interneuronas por Inyección Intracerebral de Vectores Virales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Aprende a reprogramar células gliales residentes en interneuronas parvalbumina-positivas in vivo usando vectores virales AAV en modelos murinos. Este método permite generar neuronas maduras para estudios sobre trastornos psiquiátricos.

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Marcella Birtele ha sido financiada por el Programa Horizonte 2020 de la Unión Europea (H2020-MSCA-ITN-2015) en virtud de las redes de formación innovadora Marie Sk-odowska-Curie y el Acuerdo de Subvención No 676408. Daniella Rylander Ottosson ha sido financiada por el Consejo Sueco de Investigación (2017-01234).

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La reprogramación directa in vivo se puede lograr utilizando vectores AAV FLEX en cepas de ratón C-expressing. Es importante tener en cuenta que se han observado diferencias entre las cepas del ratón con respecto a la eficacia de reprogramación. Para la reprogramación in vivo en el estriado, la línea de ratón NG2-Cre ha demostrado ser la más eficiente en comparación con otras cepas. Antes de comenzar a utilizar una nueva cepa animal, es importante comprobar las pautas del proveedor de ratón con respecto a la expresión de Cre a lo largo del tiempo, ya que la edad de los animales a menudo afecta a la especificidad de esta expresión proteica. En nuestros estudios, los animales mayores de 12 semanas no se utilizaron para la reprogramación in vivo, ya que existía un riesgo para la expresión de Cre en células distintas de NG2 glia. Se recomienda la presencia y el seguimiento constantes de los animales de control inyectados únicamente con la construcción Synapsin-FLEX-GFP. Esto permite el seguimiento de los animales en busca de células positivas en la PTF que no deben estar presentes si no se utilizan genes de reprogramación (ALN).
Para identificar las neuronas recién reprogramadas, un método de identificación específico de la neurona como el descrito en este protocolo es de suma importancia. Esto permite una adecuada identificación y distinción de las neuronas reprogramadas de las células circundantes endógenas que es de particular relevancia cuando la reprogramación en una región homotópica.
También es importante orientar la estructura correcta para la inyección viral. Por lo tanto, la cirugía estereotaxia para la inyección viral es importante y necesita ser abordada con precisión, especialmente cuando se dirige a estructuras más pequeñas del cerebro.
Hemos demostrado anteriormente11 que no es fiable predecir el resultado de la reprogramación in vivo basada en experimentos de reprogramación in vitro utilizando los mismos factores de reprogramación. Por lo tanto, todos los factores de interés deben probarse in vivo. En nuestras manos, muchas combinaciones de factores diferentes dan el mismo subtipo de neuronas (es decir, interneuronas11 in vivo) a pesar del hecho de que estos genes han estado implicados en el desarrollo de otras neuronas.
La abrazadera de parche de células enteras para neuronas reprogramadas es una técnica delicada y el procesamiento de tejidos es importante para un buen resultado. La perfusión con solución Krebs helada mejora la calidad del tejido. Además, las neuronas parcheadas necesitan ser tratadas cuidadosamente. Incluso si la maduración y la identidad fenotípica de las neuronas reprogramadas se pueden evaluar un poco utilizando una abrazadera de parche de células enteras, estas células no son totalmente comparables a sus contrapartes endógenas. Se deben utilizar tipos adicionales de análisis, como la secuenciación del genoma (por ejemplo, la secuenciación de ARN) para confirmar aún más la identidad celular reprogramada.
La técnica descrita en este documento se podría considerar para el desarrollo de futuras terapias donde se necesita reemplazo neuronal en el cerebro. Aunque la reprogramación in vivo todavía está en sus primeras etapas y la traducción a los seres humanos aún no está prevista, esta técnica podría proporcionar un método para evaluar la función génica exógena en el cerebro y estudiar la maduración celular in vivo.

El objetivo general de este método es convertir eficientemente la glia residente del cerebro in vivo en neuronas funcionales y específicas del subtipo, como las interneuronas que expresan parvalbumina. Esto proporciona un paso adelante hacia el desarrollo de una terapia de reemplazo celular alternativo para enfermedades cerebrales sin la necesidad de una fuente celular exógena. También crea una herramienta para estudiar los cambios de destino celular in situ.
El cerebro tiene una capacidad limitada para generar nuevas neuronas. Por lo tanto, en las enfermedades neurológicas, hay una necesidad de fuentes celulares exógenas para la reparación del cerebro. Para ello, diferentes fuentes de células han sido sometidas a intensas investigaciones a lo largo de los años, incluyendo células de tejido primario, células derivadas de células madre y células reprogramadas1,2,3. La reprogramación directa de las células cerebrales residentes en las neuronas es un enfoque reciente que podría proporcionar un método atractivo para la reparación del cerebro, ya que utiliza las propias células del paciente para generar nuevas neuronas dentro del cerebro. Hasta la fecha, varios informes han mostrado in vivo reprogramación a través de la entrega de vectores virales en el cerebro4,5,6,78,9 en diferentes regiones cerebrales como la corteza, la médula espinal, elestriado y el cerebro medio 5,10,11, así como en el cerebro intacto y lesionado5,8,11,12. Tanto las neuronas inhibitorias comolas excitatorias se han obtenido 4,8, pero el fenotipo preciso o funcionalidad de estas células aún no se ha analizado en detalle.
En este protocolo, describimos una reprogramación más eficiente y una identificación específica de la célula de las neuronas reprogramadas in vivo. Proporcionamos un protocolo para la evaluación funcional de la maduración neuronal y la caracterización del fenotipo basada en la funcionalidad y los rasgos inmunohistoquímicos.
Usamos un vector AAV inducible cre y un reportero de GFP para identificar las neuronas reprogramadas in vivo. Esta elección de vectores virales tiene la ventaja de infectar células divisorias y no divisorias del cerebro,aumentando el número de células objetivo, como alternativa al uso del retrovirus 7,8. Un reportero FLEX (GFP, por sus tantos) basado en neuronas, nos permitió detectar específicamente las neuronas recién generadas. Estudios anteriores han utilizado promotores específicos de subtipos para la reprogramación in vivo7,9, que también permiten la expresión de reprogramación de genes y reporteros en tipos de células específicas. Sin embargo, ese método requiere una mayor identificación de las neuronas reprogramadas mediante el análisis postmortem de la coexpresión del reportero y los marcadores neuronales. El uso de un reportero específico de neuronas, como el descrito en este documento, permite una identificación directa. Esto proporciona una prueba directa de una conversión exitosa y permite una identificación celular en vivo que se requiere para la electrofisiología de abrazadera de parche.

<table><tbody><tr><td><REACTIVOS > FUERTE PARA LA CLONACIÓN DE AAV5 Y LA PREPARACIÓN DE VECTORES VIRALES</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAAV-CA-FLEX</td><td>AddGene</td><td>38042</td><td></td></tr><tr><td>Ascl1</td><td>AddGene</td><td>67291</td><td>NM_008553.4</td></tr><tr><td>Lmx1a</td><td>AddGene</td><td>33013</td><td>NM_0033652.5</td></tr><tr><td>Nurr1</td><td>AddGene</td><td>35000</td><td>NM_013613.2</td></tr><tr><td>GFP-syn</td><td>AddGene</td><td>30456</td><td></td></tr><tr><td>LoxP (FLEX) secuencia 1</td><td></td><td></td><td>GATCTccataacttcgtataaagtatcctatac gaagttatcaaaataggaagaccaatgcttc accatcgacccgaattgccaagcatcaccatcgg acccataacttcgtataatgtatgctatacgaa gttatactagtcccgggaaggcgaagacgcgga agaggctctaga</td></tr><tr><td>LoxP (FLEX) secuencias</td><td></td><td></td> <td>2tactagtataacttcgtataggatactttatac gaagttatcattgggattcttcctattttgatc caagcatcaccatcgaccctcttccacatct caccatcgacccataacttcgtatagcatacat tatacgaagttatgtccctcgaagaggttcgaa ttcgtttaaacGGTACCCTCGAC</td></tr><tr><td>pDP5</td><td>Fábrica de plásmidos</td><td>PF435</td><td></td></tr><tr><td>pDP6</td><td>Fábrica de plásmidos</td><td>PF436</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Suero fetal bovino)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (medio Eagle modificado de Dulbecco)+ Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61965026</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (solución salina tampón de fosfato de Dulbecco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>14190094</tr><tr><td>Celdas HEK293</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85120602-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Frascos</td><td>BD Falcon</td><td></td><td>10078780 175 cm2</td></tr><tr><td>Tris H-CL</td><td>Sigma Aldrich 10812846001</td><td></td><td> Para tampón TE use 10 mM, pH 8.0; para tampón de lisis use 50 mM, pH 8.5; para tampón IE use 20 mM, pH 8.0; para tampón de elución use 20 mM, pH 8.0 </td></tr><tr><td>EDTA</td><td>EDTA: Invitrogen</td><td>EDTA: AM9260G</td><td> Para el uso de tampón TE 1 mM EDTA </td></tr><tr>Agua <td></td><td></td><td>ultrapura</td><td>, consulte Sistema de agua ultrapura </td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SigmaAldrich</td><td>C5080</td><td>2.5</td></tr><tr><td>M Dulbecco&acute; solución salina tamponada con fosfato (DPBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td> PARA HBS uso 140 mM; para tampón de lisis use 150 mM; para tampón IE use 15 mM; para tampón de elución use 250 mM </td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td> Para tampón de lisis: 1 mM </td></tr><tr><td>Tubos de sellado ultracentrífugos</td><td>Beckman Coulter</td><td>Quick-Seal&reg; &nbsp; tubo de</td><td></td>polipropileno</tr><tr><td>OptiPrep&trade; &nbsp; Gradiente de densidad Medio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 10 mL-aguja 18G</td><td>BD</td><td>305064</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de vidrio de laboratorio</td><td>VWR</td><td>?</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de intercambio aniónico</td><td>Unidad MSTG25Q6 de laboratorio PALL</td><td></td><td> Acrodisc con membrana Mustang Q </td></tr><tr><td>Unidad de filtro centrífugo</td><td>Merck</td><td>Z740210-24EA</td><td> Dispositivo Amicon Ultra-4 </td></tr><tr><td>Kits de aislamiento de ADN plasmídico libre de endotoxinas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A33073</td><td></td></tr><tr><td>Na2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>Tubo Falcon</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Corning 352196</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Falcon</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Corning 352070</td><td></td></tr><tr><td>Viales de vidrio</td><td>Novatech</td><td>30209-1232</td><td> CGGCCTCAGFGAGCGA </td></tr><tr><td>Cebador directo para secuencia</td><td></td><td></td> de repetición terminal invertida (ITR) <td> GGAACCCCTAGTGATGGAGTT </td></tr><tr><td>Cebador inverso para secuencia</td><td></td><td></td> de repetición terminal invertida (ITR) <td> CACCTCTCTCTCGGCGCGGCGCGC&</td></tr><tr><td>ACUTE; FAM / 3&agudo; Sonda BHQ1</td><td>Jena Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro de 0,22 mm Filtro</td><td>Merck</td><td>SLGV004SL</td><td>Millex-GV</td></tr><tr><td><fuerte>EQUIPO AAV5 PREPARACIÓN DE VECTORES VIRALES</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Congelador -20 &º C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Congelador -80 &deg; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nevera +4 &deg; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV sala</td><td></td><td></td><td></td>viral</tr><tr><td>Sistema de agua ultrapura</td><td>Merck</td><td>Milli-Q&reg; IQ 7000</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice</td><td>VWR</td><td>444-0004</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>Beckman Optima LE-80K Ultracentrífuga</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Autoclave Tuttnauer</td><td>2540 EL</td><td></td></tr><tr><td>Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)</td><td>BioRad</td><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td></td></tr><tr><td>PCR cuantitativa (qPCR)</td><td>Roche</td><td>LightCycler&reg; 480 Sistema</td><td></td></tr><tr><td>centrífugo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Sorvall ST16</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TSGP02</td><td></td></tr><tr><td>ANIMAL MODEL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NG2-Cre ratones</td><td>Jackson</td><td>NG2-CrexB6129, stock #008533</td><td></td></tr><tr><td>REACTIVOS PARA LA INYECCIÓN DE FACTORES DE REPROGRAMACIÓN EN EL CEREBRO</ Agua fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución salina</td><td>Apoteket AB</td><td></td><td>70%</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Solveco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolfurano</td><td>Apoteket AB</td><td></td><td> Diluir a una solución al 1% con agua tibia. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Virkon</td><td>Viroderm</td><td>7511&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Apoteket AB</td><td>P0500000</td><td> i.p. para procedimiento terminal a la dosis de 60 mg/ml. </td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Merck</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blu</td><td>Thermo Fisher Scientific 15250061</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Retrobeads</td><td>Lumafluor</td><td>R170</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Apoteket AB</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>fuerte>EQUIPO PARA INYECCIÓN DE FACTORES DE REPROGRAMACIÓN EN EL CEREBRO</fuerte></td><td></td><td></td><td> de RSG Solingen. </td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>VWR</td><td>233-1552</td><td>de Biochem.</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>VWR</td><td>232-0007</td><td></td></tr><tr><td>Pinza</td><td>VWR</td><td>232-0120</td><td></td></tr><tr><td>Portabisturí</td><td>VWR</td><td>RSGA106.621</td><td>Número 20.</td></tr><tr><td>Bisturí</td><td>VWR</td><td>RSGA106.200</td><td></td></tr><tr><td>Marco estereotáxico</td><td>Stoelting Europe</td><td>51500D</td><td></td></tr><tr><td>Barras de ratón</td><td>Stoelting Europe</td><td>51648</td><td>5 ul</td></tr><tr><td>Jeringa con aguja extraíble</td><td>Hamilton Company</td><td>65</td><td> 0,75 diámetro interior y 1,5 diámetro exterior. </td></tr><tr><td>Capilares de vidrio</td><td>Stoelting</td><td>50811</td><td></td></tr><tr><td>Extractor capilar de vidrio</td><td>Sutter company</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Taladro dental</td><td>Agnthos AB</td><td>1464</td><td></td></tr><tr><td>Afeitadora</td><td>Agnthos AB</td><td>GT420</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano Cámara y bomba</td><td>Agnthos AB</td><td>8323101</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>Jeringas</td><td>Merck</td><td>Z118400-30EA</td><td>25G</td></tr><tr><td>Agujas</td><td>Merck</td><td>Z192414&nbsp; Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de ratón y rata neonatal para armadura estereotáxica</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>Braintree scientific, inc</td><td>53800M</td><td> De Covidien 2187. </td></tr><tr><td>Gasa de algodón</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-037-902</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de goma</td><td>Elfa Distrelec</td><td>HFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150</td><td></td></tr><tr><td>Bastoncillos de algodón</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-366-473</td><td></td></tr><tr><td><reactivos fuertes > PARA GRABACIONES DE PINZAS DE PARCHE DE CÉLULAS ENTER</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4-H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>MgCl26 H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2-6 H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4-7 H2</td><td>O Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td> ver Sistema de agua ultrapura </td></tr><tr><td>Preparación de agua</td><td></td><td></td> ultrapura <td>1 o 2M.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958-500G</td><td></td></tr><tr><td>K-D-gluconato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500&nbsp; Sigma</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KOH-EGTA (Ácido etilenglicol-bis-N-tetracético)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889&nbsp; Sigma</td><td></td></tr><tr><td>KOH- Ácido hepes (ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Mg2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>Picrotoxina</td><td>Merck</td><td>P1675&nbsp; Sigma</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Merck</td><td>C239&nbsp; Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT FOR WHOLE CELL PATCH CLAMP RECORDINGS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de vidrio de borosilicato</td><td>Sutter Company</td><td>B150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>Extractor capilar de vidrio</td><td>Sutter company</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>Leica VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>WaterBath</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TSGP02</td><td></td></tr><tr><td>Software Clampfit</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software Multiclamp</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>REACTIVOS PARA INMUNOHISTOQUÍMICA</fuerte></td><td></td><td></td><td> Uso a una concentración del 4%.&nbsp; PRECAUCIÓN:&nbsp; El PFA es un potente fijador. Evitar la ingestión y el contacto con la piel. </td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>Merck Millipore 1040051000</td><td></td><td> Úselo a una concentración del 0,1%. </td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific 10254640</td><td></td><td> Donkey.Uso a una concentración de 1:400. </td></tr><tr><td>Suero</td><td>Merck Millipore</td><td>S30-100ML</td><td> Reconstituir el polvo en agua Milli-Q a 1 mg/mL. Alícuota y almacenar a -20&deg; C,&nbsp; Sensible a la luz. Utilizar en una concentración de 1:500. </td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2&prime;-diclorhidrato de fenilindol (DAPI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td> 1: 600 en KPBS-T. </td></tr><tr><td>estreptavidina- Cy3</td><td>Thermo Fisher Scientific 434315</td><td></td><td>1:5000, conejo.</td></tr><tr><td>Anti-GAD65/67</td><td>Abcam</td><td></td><td>1:2000, ratón.</td></tr><tr><td>Anti-PV</td><td>Sigma</td><td>P3088</td><td>1:200, cabra.</td></tr><tr><td>Anti-Chat</td><td>Merk</td><td>AB143</td><td>1:5000, conejo.</td></tr><tr><td>Anti-NPY</td><td>Immunostar</td><td>22940</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NIST200B</td><td>1:1000, pollo.</td></tr><tr><td>Anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Solución de montaje</td><td>Merck</td><td>10981</td><td> Medio de montaje de alcohol polivinílico con DABCO&reg;, antidecoloración </td></tr><tr><td>OCT</td><td>Agar Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Agua</td><td></td><td></td><td></td>destilada</tr><tr><td>Solución anticongelante</td><td>Tecnología Tissue Pro</td><td>AFS05-1000N, 1000 mL/ea.</td><td></td></tr><tr><td><EQUIPO > FUERTE PARA INMUNOHISTOQUÍMICA</microscopio ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>fluorescencia invertida</td><td>fuerte</td> Microscopio confocal Leica <td>DMI6000 B</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal de barrido láser Leica TCS SP8.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prisma</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Leica SM2010R</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

en vivo reprogramación directa de células gliales residentes en interneuronas por inyección intracerebral de vectores virales

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

Convertir la glia residente en el cerebro en neuronas funcionales y específicas del subtipo in vivo proporciona un paso hacia el desarrollo de terapias alternativas de reemplazo celular mientras que también crea herramientas para estudiar el destino celular in situ. Hasta la fecha, ha sido posible obtener neuronas a través de la reprogramación in vivo, pero el fenotipo preciso de estas neuronas o cómo maduran no se ha analizado en detalle. En este protocolo, describimos una conversión más eficiente y una identificación específica de la célula de las neuronas reprogramadas in vivo, utilizando un sistema vectorial viral basado en AAV. También proporcionamos un protocolo para la evaluación funcional de la maduración neuronal de las células reprogramadas. Mediante la inyección de vectores de flip-escision (FLEX), que contienen los genes de reportero impulsados por la reprogramación y la sinapsina a tipos de células específicas en el cerebro que sirven como el objetivo para la reprogramación celular. Esta técnica permite la fácil identificación de las neuronas recién reprogramadas. Los resultados muestran que las neuronas reprogramadas obtenidas maduran funcionalmente con el tiempo, reciben contactos sinápticos y muestran propiedades electrofisiológicas de diferentes tipos de interneuronas. Usando los factores de transcripción Ascl1, Lmx1a y Nurr1, la mayoría de las células reprogramadas tienen propiedades de las interneuronas que contienen parrebúta y parvalbumina.

La inyección de vectores AAV se utiliza para reprogramar con éxito las células glia ng2 residentes en neuronas en el estriado del ratón NG2-Cre (Figura1A). Para apuntar específicamente a NG2 glia, los vectores FLEX con genes de reprogramación/reportero, se insertan en una dirección antisentido y están flanqueados por dos pares de sitios loxP antiparalelos y heterotípicos (Figura1B). Cada uno de los tres genes de reprogramación (Ascl1, Lmx1a y Nurr1) se coloca bajo el control del omnipresente promotor de cba en vectores individuales. Con el fin de asegurarse de que la expresión GFP se limita a las neuronas reprogramadas que se originan en una célula de expresión Cre, GFP se coloca bajo el control del promotor de la sinapsina específica de la neurona, (también en un vector FLEX).
El uso de la combinación de reprogramación y construcciones de reportero permite la generación de neuronas gFP positivas en el estriado del ratón (Figura1C,C'). El uso de la construcción del reportero sin la presencia de genes de reprogramación no produce neuronas positivas en gFP (Figura1D).
Las neuronas reprogramadas que están llenas de biocitetina son visibles después de la inmuno-tinción post mortem (Figura2A). Si la conversión es exitosa, debe haber una morfología neuronal extensa. Los registros electrofisiológicos de las neuronas reprogramadas muestran la presencia de conexiones funcionales postsinápticas con medidas de actividad espontáneas (Figura 2B,C). Esto se puede bloquear con bloqueador GABAérgico o glutamatérgico ionotrópico (Picrotoxina o CNQX), lo que sugiere entrada sináptica excitatoria e inhibitoria a las neuronas reprogramadas. La aparición de actividad espontánea aumenta con el tiempo posterior a la inyección viral (Figura2D), lo que indica una maduración gradual.
Los potenciales de acción inducidos por la corriente están presentes en las neuronas funcionales. Las posibilidades de acción aumentan en número con el tiempo después de la conversión (Figura2E). Esto indica además maduración en la función neuronal. En una neurona inmadura, la corriente inducirá ninguno o muy pocos potenciales de acción (Figura2F).
Los patrones de disparo de una neurona son específicos del tipo celular, ya que depende de factores como la morfología de las células y la expresión de canal15. Los patrones registrados en las neuronas reprogramadas in vivo pueden distinguirse en grupos y compararse con los de los subtipos neuronales endógenos, por ejemplo, interneuronas de pico rápido (Tipo de célula B, Figura 3B)u otros tipos de células (Figura3A,C,D ). Las diferencias electrofisiológicas observadas pueden confirmarse por la presencia de marcadores de subtipo específicos y co-expresión con GFP (Figura3E-H). En conjunto, estos datos indican que las neuronas reprogramadas presentes en el estriado tienen propiedades de diferentes tipos de interneuronas, como parvalbumina-, ChAt- y NPY- expresando interneuronas, así como la identidad de neurona spinospino media estriada (DARPP32+) ( Figura 3E -H).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig1.jpg"> Figura 1: Reprogramación in vivo de la glia NG2 residente en neuronas. (A) Representación esquemática de la reprogramación in vivo mediada por el virus AAV de la glia estriada NG2. (B) Representación esquemática de construcciones AAV5 FLEX utilizadas para la reprogramación in vivo, en la que la expresión génica está regulada por la expresión Cre en las células objetivo. (C y C') Neuronas reprogramadas in vivo, resultantes de la inyección de Syn-GFP + ALN en el Estriado. (D) Ausencia de neuronas reprogramadas cuando no se añaden factores de reprogramación al cóctel viral, y sólo se inyecta la construcción del reportero in vivo. Barras de escala a 100 mm (C),25 mm (C'), 25 mm (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig2.jpg"> Figura 2: Las neuronas reprogramadas in vivo son funcionales y muestran maduración con el tiempo. (A) La neurona reprogramada llena de biocitotina, muestra morfología neuronal madura, incluyendo espinas dendríticas. Rastros muestra (B) actividad inhibitoria (GABAérgica) que está bloqueada con picrotoxina, un antagonista del receptor GABAA y (C) actividad excitatoria que está bloqueada con CNQX, un antagonista del receptor AMPA. (D) El número de neuronas con actividad postsináptica aumenta con el tiempo. (E) Las neuronas parcheadas muestran disparo repetitivo ya a las 5 semanas después de la inyección (con.p.i.) y continúan mostrando que a las 8 y 12 p.p.i. (F) El potencial de acción inducido por corriente y la actividad postsináptica de una neurona inmadura, mostrando pocos sinápticos eventos y pocos potenciales de acción en comparación con B y D. Barra de escala 25 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2.jpg"> Figura 3: Las neuronas reprogramadas in vivo muestran propiedades inmunohistoquímicas y electrofisiológicas de las interneuronas estriales. (A-D) Los patrones de disparo de las neuronas reprogramadas in vivo pueden ser de tipos distintos: (A) Tipo A es similar a la neurona espinosa media endógena (DARPP32+); (B) similar a las interneuronas de pico rápido (PV+); (C) similar a las neuronas de pico de umbral bajo con hundimiento prominente (NPY+); (D) neuronas disparando con gran post-hiperpolarización (Chat+). (E-H) Imágenes confocales que muestran la colocalización de la PFP y los marcadores interneuronas PV (E), ChAT (F), NPY (G) y el marcador de neurona de proyección DARPP32 (H). Todas las barras de escala de 50 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo tiene como objetivo generar interneuronas directamente reprogramadas in vivo, utilizando un sistema viral basado en AAV en el cerebro y un reportero de FPSG impulsado por la sinapsina FLEX, que permite la identificación celular y el análisis posterior in vivo.

En Vivo Reprogramación Directa de Células Gliales Residentes en Interneuronas por Inyección Intracerebral de Vectores Virales

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

Este protocolo muestra que es posible generar nuevas neuronas directamente en el cerebro a partir de la glia residente y que estas células reprogramadas maduran en neuronas específicas de subtipos. La principal ventaja es el virus AAV dependiente de la cre que permite la focalización específica del NG2-glia y el reportero de GFP que etiqueta las neuronas reprogramadas para su análisis. Generar nuevas neuronas en el cerebro puede conducir a un desarrollo futuro para terapias de reemplazo celular en el cerebro.En nuestro protocolo generamos las interneuriones parvalbumin-positivas que tienen implicaciones para los trastornos psiquiátricos. La reprogramación in vivo se puede aplicar a otras áreas cerebrales y circuitos dependiendo de qué fenotipo neuronal y condición neurológica desea dirigirse. Demostrando el procedimiento estarán Jenny Johansson: una técnico, Maria Pereira: una ex estudiante de doctorado, y Marcella Birtele: una estudiante de doctorado en nuestro laboratorio.Para producir vector viral AAV5, sembra las células HEK293T con medio de cultivo estándar en cinco matraces T175. Cuando las células alcancen entre 50 y 70% de confluencia, prepare la siguiente mezcla para la transvección. En un tubo centrífugo de 50 mililitros, agregue cantidades molares iguales de plásmido vectorial y plásmido auxiliar de la serie pDG.Agregue el búfer Tris-EDTA a un volumen final de 144 microlitros y luego agregue agua ultrapura para dar como resultado un volumen total de 1296 microlitros y mezclar. A continuación, añadir 144 microlitros de cloruro de calcio molar 2,5 y mezclar. Después de eso, añadir 1,92 mililitros de HBS a la solución de ADN y vórtice inmediatamente.Incubar a temperatura ambiente durante exactamente 60 segundos. Posteriormente, transfiera la solución a 28 mililitros de medio de cultivo celular fresco y mezcle. Sustituya el medio de los matraces por el medio que contiene la mezcla de transvección.Espere tres días y transfiera los medios a los residuos. Agregue cinco mililitros de tampón de cosecha a cada matraz, luego agregue otros cuatro mililitros de DPBS a cada matraz para enjuagar las células restantes y la piscina con la solución celular. Centrifugar las células cosechadas a 1.000 x g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y disuelva el pellet en 15 mililitros de tampón de lelisis. Congele el tubo centrífuga de 50 mililitros en hielo seco durante 15 minutos y guárdelo en un congelador de menos 20 grados Centígrados. Antes de su uso, descongelar el izado de la célula cosechada en un baño de agua a 37 grados centígrados.En este procedimiento, realice la purificación de AAV por ultracentrifugación de gradiente de iodixanol y utilice tubos de techo ultracentrífugo con centrifugación a 350.000 x g durante una hora y 45 minutos a temperatura ambiente. Para extraer la fase que contiene AAV, inserte una jeringa de 10 mililitros con una aguja de calibre 18 a unos dos milímetros por debajo del borde de la fase 40 a 60% con el bisel hacia arriba y retírese. Asegúrese de detenerse antes de llegar a la banda de proteínas después de que se hayan extraído entre cinco y seis mililitros del vector viral.Luego, purifica y concentra el gradiente de yodoxanol diluido a través de un filtro de intercambio de aniones, empujándolo a una velocidad no más rápida que una gota por segundo. Posteriormente, empuje tres mililitros de Tampón IE lentamente a través del filtro para lavarlo. A continuación, eluda la mezcla en una unidad de filtro centrífugo con uno o dos mililitros de tampón de elución.Agregue DPBS al dispositivo a un volumen final de cuatro mililitros. Centrifugar a 2.000 x g a temperatura ambiente hasta que se deje en el filtro menos de 0,5 mililitros de DPBS. Después, retire el líquido de la parte inferior del tubo, rellene con cuatro mililitros de DPBS y centrifugar de nuevo.Repita este paso dos veces más, asegúrese de que el volumen de vector concentrado en el filtro es de aproximadamente 200 microlitros después de la última centrifugación. Retire el vector concentrado de 200 microlitros con una pipeta y empújelo a través de un filtro de 0,22 micrómetros para esterilizar. A continuación, aliquot 200 microlitros en un vial de vidrio con inserto entrelazado.Para inyectar factores de reprogramación, coloque un ratón anestesiado en el marco estereotaxico. Administrar la analgesia apropiada al comienzo de la cirugía, luego llevar la punta del capilar de vidrio de la aguja de inyección justo por encima del bregma. Asegúrese de que la punta capilar esté perfectamente recta en los planos A-P y M-L.Restablezca los valores M-L y A-P a 0,0 en el contador de coordenadas digitales. Para asegurarse de que la cabeza del animal está en una posición perfectamente plana, utilice el contador de coordenadas digitales para medir el valor de la coordenada D-V cuando el brazo A-P está en más 2.0 y menos 2.0, así como cuando el brazo M-L está en más 2.0 y menos 2.0. Ajuste la altura de la barra de dientes y las barras de los oídos en consecuencia.Después, levante ligeramente la jeringa y perfore un agujero utilizando un taladro dental en las coordenadas de inyección. Comience a perforar en el sitio, trabajando de una manera circular y suave. A continuación, coloque un trozo de gasa de algodón sobre la incisión abierta y enjuague la jeringa con solución salina.Después del lavado, elaborar una burbuja de aire y luego un microlitro de solución que contenga el vector viral. Asegúrese de que la solución viral se pueda visualizar fácilmente debajo de la burbuja de aire. A continuación, baje la jeringa, progresando lentamente a la profundidad deseada, y asegúrese de que la trayectoria esté libre de fragmentos óseos.Posteriormente, inyectar un microlitro de la solución viral a una velocidad de 0,4 microlitros por minuto. Cuando se realice la inyección, espere dos minutos para la difusión antes de retirar la jeringa. Después de la difusión, retraiga lentamente la jeringa hasta que la punta del capilar se retire completamente del cerebro, luego sutura cuidadosamente la incisión y retire al animal del marco estereotaxico.Monitoree al animal en una estación postoperatoria hasta que se recupere la conciencia. Los animales se mantienen hasta 12 semanas después de la inyección por virus para permitir que la glia residente se reprograme en neuronas maduras. Para preparar las rebanadas cerebrales para la electrofisiología usando un vibratome, secise el cerebro desde la parte más rostral hasta el nivel estriado a alta velocidad.Luego secciona el estriado coronalmente a 275 micrómetros a 0,1 milímetros por segundo. Después de cada sección, retire cuidadosamente el lado estriado no inyectado y transfiera el lado inyectado en un vial con una red inferior y un tobogán de sentido CREB oxigenado en el baño de agua a temperatura ambiente. Mantenga el vial a temperatura ambiente hasta que se corten todas las secciones.Después, aumente lentamente la temperatura del baño de agua a 37 grados centígrados y déjelo durante 30 minutos, luego apague el calentador y deje que se enfríe a temperatura ambiente. Después de transferir una sección de tejido a una cámara de grabación para electrofisiología, monte la pipeta de vidrio en el electrodo de grabación y tíquela en la solución. Compruebe dos veces la resistencia del electrodo.Luego, acérquese lentamente a la celda reprogramada con la pipeta, manteniendo una ligera presión positiva en el electrodo para evitar tapar la punta, y compruebe que la célula es positiva antes de parchear. Cuando la celda esté parcheada, mantenga la celda en la abrazadera de corriente de menos 60 a menos 70 milivoltios, e inyecte 500 corrientes de milisegundos de menos 20 a más 90 picoamperios con incrementos de 10 picoampere para inducir potenciales de acción. Esto es indicativo de una maduración neuronal y una reprogramación exitosa.Posteriormente, cambie a la abrazadera de voltaje y mida el sodio interno y las corrientes de potasio rectificadoras retardadas en pasos despolarizantes de 10 milivoltios. Aquí hay un post grabado biocytina lleno de neurona reprogramada que muestra morfología neuronal madura y las espinas dendríticas. Aquí, las grabaciones electrofisiológicas de las neuronas reprogramadas muestran la presencia de conexiones funcionales postsinápticas con medidas de actividad espontánea.Las trazas muestran la actividad inhibitoria que se bloquea con picrotoxina, un antagonista del receptor GABAA y la actividad excitatoria que se bloquea con CNQX, un antagonista del receptor AMPA. Las neuronas parcheadas ya muestran actividad postsináptica a las cinco semanas después de la inyección, y continúan a las ocho y 12 semanas después de la inyección. El número de neuronas con potenciales de acción inducidas actuales también aumenta con el tiempo.Un análisis más detallado reveló varios patrones de disparo distintos donde la mayoría de las células muestran una actividad de pico rápido similar a las interneurones de parvalbumina. El análisis inmunohistoquímico a las 12 semanas mostró coexpresión del reportero GFP y la parvalbumina. Siguiendo este procedimiento puede examinar la expresión génica con la técnica patch seek o evaluar la conectividad sináptica tridimensional con rastreo monosináptico e iDISCO.Ahora que es posible reprogramar la glia residente en parvalbumina expresando interneurones, hemos comenzado a investigar si estos son auténticos y se pueden utilizar como una herramienta terapéutica. Recuerde seguir los protocolos y pautas establecidos al manipular animales y usar el virus AAV.

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Investigación

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Neurociencia

Aquí presentamos la inyección intracraneal de vectores AAV de marcaje fluorescente de las neuronas y la glía en la corteza visual.

Inyección intracraneal de adeno-asociado vectores virales

Este video muestra un protocolo para evaluar la maduración y reprogramación de células gliales en neuronas en un corte de cuerpo estriado de ratón transfectado. El experimento mide el potencial de membrana en reposo y la respuesta a las inyecciones actuales utilizando marcadores fluorescentes específicos de neuronas y técnicas electrofisiológicas. Los picos de voltaje durante estas mediciones indican una maduración y reprogramación neuronal exitosas.

Registros electrofisiológicos de neuronas reprogramadas en un corte de cerebro de ratón

Fuente: Pereira, M. et. al., Reprogramación directa in vivo de células gliales residentes en interneuronas mediante inyección intracerebral de vectores virales. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra la inyección estereotáxica de un virus adenoasociado en la corteza cerebral de un ratón transgénico para administrar genes reporteros fluorescentes y de reprogramación neuronal dependientes de Cre en células gliales.

Inyección estereotáxica de vectores virales para la reprogramación de células gliales en un modelo de ratón

Atacar a las células cerebrales residente por linaje reprogramación directa ofrece nuevas perspectivas para la reparación del cerebro. Aquí se describe un protocolo de cómo preparar cultivos enriquecidos por pericitos cerebrales residente del adulto corteza cerebral humana y convertirlas en neuronas inducida por la expresión mediada por retrovirus de los factores de transcripción Sox2 y Ascl1.

Lineage-reprogramación de células derivadas de pericitos del cerebro humano adulto en neuronas inducidas

Aquí demostramos una técnica para la transducción neuronal generalizada mediante inyección intraventricular de virus adenoasociados en el cerebro de ratón neonatal.  Este método proporciona una manera rápida y fácil de lograr la expresión de por vida de los transgenes administrados viralmente.

Inyección Viral Intracerebroventricular de Neonatología del ratón Cerebro de transducción neuronal persistente y generalizada

Basado en la ingeniería lentiviral in vitro de precursores neuronales, su co-trasplante en cerebros de tipo salvaje y evaluación morfométrica emparejada de derivados de "prueba" y "control", este método permite el modelado preciso del control genético in vivo del neocortical morfología de las neuronas de una manera simple y asequible.

Trasplante Intraventricular de Precursores Neuronales Deingidos para Estudios de Neuroarquitectura In Vivo

Aquí presentamos un protocolo, diseñado para utilizar herramientas quimiogenéticas para manipular la actividad de los progenitores interneuronales corticales trasplantados a la corteza de los primeros ratones postnatales.

Trasplante de progenitores interneuronas corticales de ingeniería química en cerebros de ratón postnatal temprano

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Modelado in vitro para enfermedades neurológicas utilizando la conversión directa de fibroblastos a células progenitoras neuronales y la diferenciación en astrocitos

Describimos el trasplante intraparenquimatoso de células progenitoras neurales humanas transducidas con un vector informador dual que expresa la proteína fluorescente verde luciferasa (GFP) en el cerebro del ratón. Después del trasplante, la señal de luciferasa se mide repetidamente utilizando bioluminiscencia in vivo y células injertadas que expresan GFP identificadas en secciones cerebrales mediante microscopía de fluorescencia.

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Aprende a reprogramar células gliales residentes en interneuronas parvalbumina-positivas in vivo usando vectores virales AAV en modelos murinos. Este método permite generar neuronas maduras para estudios sobre trastornos psiquiátricos.

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