Name: Preparación y aplicación de un nuevo biosensor bacteriano para la detección presuntiva de residuos de Disparos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Aprende a preparar biosensores bacterianos para detectar residuos de disparos mediante biología sintética y espectroscopía de fluorescencia. Este protocolo ofrece una alternativa forense económica y accesible.

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Los autores desean reconocer a los estudiantes de la Universidad de Longwood en BIOL 324 (genética) y los estudiantes en CHEM 403 (solución avanzada de problemas de laboratorio químico) que estuvieron involucrados en la preparación inicial y pruebas de los biosensores de antimonio y plomo. La idea para MicRoboCop fue concebida en el taller GCAT SynBIO (verano 2014), financiado por NSF y el Howard Hughes Medical Institute y organizado por la Universidad de Maryland, Condado de Baltimore. Los autores también reconocen la financiación recibida de la escuela de Artes y Ciencias Cook-Cole de la Universidad de Longwood y la beca GCAT SynBio Alumni.

Nota: se presenta la síntesis de E. coli expresando RFP.
1. preparación del ADN plásmido de E. coli
<ol><li>Descongelar e. coli conteniendo un plásmido con un gen RFP y un gen de resistencia a la ampicilina y cultivar las placas de agar e. coli en el caldo Luria (LB) que contienen 100 μg/ml de ampicilina a 37 ° c durante 24 h. Por ejemplo, utilice el plásmido J10060 del registro de las piezas biológicas estándar utilizadas para la biología sintética (ver tabla de materiales). El plásmido J10060 incluye un gen para RFP (proteína fluorescente roja) bajo el control de una región promotora de pBad y un gen de resistencia a la ampicilina. Alternativamente, transforme E. coli (consulte el paso 3,2) con el plásmido antes del crecimiento en las placas de agar lb.</li>
	<li>Siga un protocolo estándar de qiagenminiprep (consulte la tabla de materiales) para aislar el ADN de 1 ml de una cultura de E. coli que contenga el plásmido J10060. El propósito del siguiente protocolo es quitar el promotor pBad y reemplazarlo con el promotor deseado para el dispositivo.</li>
	<li>Después del plásmido Miniprep, almacene el ADN en el congelador hasta que esté listo para la digestión.</li>
</ol>2. digestión de enzimas de restricción
<ol><li>Establecer la siguiente reacción en un tubo de microcentrífuga para la digestión EcoRI y NheI: 10 μL de ADN plásmido J10060 (aislado en el paso 1), 8 μL de agua y 1 μL de enzimas EcoRI y NheI premezcladas con 1 μL de tampón (ver tabla de materiales).</li>
	<li>Para el ADN promotor, establecer la siguiente reacción en un tubo de microcentrífuga para la digestión EcoRI y NheI: 10 μL de secuencias de ADN promotor recocido (8 μL de agua, y 1 μL cada una de las enzimas EcoRI y NheI pre-mezclado con 1 μL de tampón.<ol>
<li>Para SB-, PB-, o TNT-RFP (ver tabla de materiales), disolver los oligonucleótidos en buffer (30 mm HEPES, pH 7,5; 100 mm acetato de potasio), incubar en concentraciones molar iguales, calentar a 94 ° c durante 2 min, y enfriar gradualmente a temperatura ambiente).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mezcle las muestras pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo con el conjunto de pipetas a 10 μL.</li>
	<li>Incubar durante 30 min a 37 ° c.</li>
	<li>El calor inactiva las enzimas a 80 ° c durante 5 min.</li>
	<li>Almacene el ADN digerido en el congelador hasta que esté listo para el siguiente paso.</li>
</ol>3. ligadura y transformación
<ol><li>
Ligadura
	<ol>
<li>Utilizando el plásmido y el ADN promotor que fueron digeridos doble con EcoRI y NheI en el paso 2, configurar la mezcla de reacción mostrada en la tabla 1 en un tubo de microcentrífuga sobre hielo; Agregue la ligasa de ADN T4 por última vez. Nota: la tabla 1 muestra una ligadura utilizando una relación molar de vector 1:3 para insertar para los tamaños de ADN indicados.</li>
		<li>Mezcle suavemente la reacción pipeteando hacia arriba y hacia abajo y microcentrífuga brevemente.</li>
		<li>Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.</li>
		<li>Inactivar el calor a 65 ° c durante 10 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transformación
	<ol>
<li>Descongelar un tubo con 20 μL de células de E. coli competentes de Dh5-Alpha en hielo hasta que desaparezcan los últimos cristales de hielo.</li>
		<li>Añadir 5 μL de ADN plásmido a la mezcla celular. Deslice cuidadosamente el tubo 4-5 veces para mezclar las células y el ADN.</li>
		<li>Coloque la mezcla sobre hielo durante 2 min.</li>
		<li>Choque térmico a exactamente 42 ° c por exactamente 30 s. No mezclar.</li>
		<li>Colocar sobre hielo durante 2 min. No mezclar.</li>
		<li>Pipetear 380 μL de temperatura ambiente SOC en la mezcla. Inmediatamente se extendió sobre una placa de agar LB que contiene ampicilina (100 μg/mL) e incubar durante la noche a 37 ° c.</li>
		<li>Compruebe las placas dentro de las 24 h para el crecimiento.</li>
		<li>Selle las placas con una película de sellado y guárdela en el refrigerador hasta que esté lista para el siguiente paso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. PCR de colonias
<ol><li>Añadir a un tubo PCR (configurar 4 tubos de reacción) las mezclas de reacción que se muestran en la tabla 2.</li>
	<li>Mezcle suavemente las reacciones pipeteando hacia arriba y hacia abajo.</li>
	<li>Utilizando una punta de pipetas amarilla, raspe una colonia (o región muy pequeña) de la E. colitransformada. Transfiera un barrido de este E. coli a una nueva placa lb/ampicilina/agar que se haya seccionado y, a continuación, inserte la punta de la Piera en el tubo de PCR. Agitar la punta de la Piera para mezclar la E. coli con la mezcla de PCR. Repita tres veces más para las colonias adicionales. Transfiera los tubos de PCR a una máquina de PCR y comience a termociclando utilizando el programa que se muestra en la tabla 3.</li>
	<li>Ejecutar electroforesis en gel utilizando un gel de agarosa al 2% en TAE para determinar qué colonias tienen la mejor ligadura en el plásmido y cultivar esas colonias en una placa nueva.</li>
	<li>Almacene las placas en el refrigerador hasta que estén listas para la prueba. Prepare un cultivo líquido en el caldo Luria con 100 μg/mL de ampicilina añadido para las pruebas químicas.</li>
</ol>5. secuenciación de ADN
<ol><li>Para cada muestra, añadir 5 μL de plásmido, 4 μL de la imprimación de secuenciación y 3 μL de agua desionizada.</li>
	<li>Coloque esta mezcla en un tubo y envíelo para la secuenciación de ADN (ver tabla de materiales).</li>
	<li>Analice los datos de la secuencia de ADN para comparar las secuencias de ADN esperadas y observadas utilizando el software de análisis de secuencias de ADN para asegurar que no haya mutación y que los genes se insertaron correctamente. Nota: a continuación se presenta el uso de E. coli como sensor químico.</li>
</ol>6. preparación de cultivos de E. coli
<ol><li>Preparar LB con 100 μg/mL de ampicilina para cultivos líquidos.</li>
	<li>Preparar cultivos líquidos de las bacterias del sensor, el control positivo * bacterias y el control negativo * * bacterias. Nota: * bacterias de control positivo: E. coli que contiene un plásmido con el gen RFP bajo el control de un promotor constitutivo; en este trabajo se utilizó plásmido E1010 del registro de las piezas biológicas estándar utilizadas para la biología sintética (ver tabla de materiales). * * Bacterias de control negativas: E. coli que contiene un plásmido con el gen RFP bajo el control de un promotor diferente, como el promotor de pbad (plásmido J10060 del registro de piezas biológicas estándar utilizadas para la biología sintética (ver tabla de Materiales)) o un plásmido que no tenga el gen RFP.</li>
	<li>Colocar las culturas en una incubadora de agitación a 37 ° c y 220 rpm por un mínimo de 8 h, máximo de 18 h. el caldo nublado indica crecimiento bacteriano.</li>
</ol>7. valorando E. coli para comprobar la función del dispositivo
Nota: una vez que los sensores se han ajustado para comprobar la función, no es necesario repetir este paso. Un control positivo en forma de adición de plomo, antimonio, y 2, 4-DNT o 1,3-dinitrobenceno (1,3-DNB) puede comprobar la función de los dispositivos para cada uso sin la necesidad de la valoración completa.
<ol><li>Prepare una solución de stock del analito (s) de interés a una concentración de 10 ppm en agua. Si la solubilidad es un problema, utilice una mezcla de 50/50 agua/metanol.</li>
	<li>Usando la tabla 4 como guía, etiquete el número apropiado de tubos de cultivo estéril y Coloque 2 ml del caldo cultivado (del paso del Protocolo 6) en cada tubo. Nota: con el fin de determinar un rango analítico general, hacer al menos tres niveles diferentes de un analito con las bacterias del sensor, un nivel con el control negativo, y un nivel con el control positivo. También debe haber un tubo de cada una de las bacterias que no tiene ningún metal añadido (otro tipo de control negativo). Para determinar con mayor precisión el rango analítico y los límites de detección, utilice una mayor gama de concentraciones de analito.</li>
	<li>Añada una solución de analito a los tubos que contengan 2 mL de caldo como se indica en la tabla 4, coloque los tapones de ajuste en el tubo de cultivo para que estén sueltos (para permitir el flujo de aire en el tubo), y vórtice el tubo de cultivo.</li>
	<li>Dejando las tapas de encaje vagamente sobre los tubos de cultivo, colóquelo en una incubadora de agitación a 220 rpm y 37 ° c durante al menos 24 h.</li>
	<li>Retire los tubos de la incubadora, encaje firmemente las tapas en los tubos y almacene los tubos en el refrigerador hasta que estén listos para el análisis de fluorescencia.</li>
</ol>8. utilizando E. coli como sensor químico para GSR
<ol><li>Utilizando una toallita a base de etanol diseñada para eliminar el plomo (ver tabla de materiales), limpie todas las superficies de las manos, incluso entre los dedos. Utilice una toallita separada para cada mano. Almacene las toallitas en una bolsita sellable apropiadamente etiquetada hasta el análisis.</li>
	<li>Para las superficies a probar: utilice una toallita a base de alcohol para superficies grandes o un bastoncillo de algodón humedecido con etanol para superficies pequeñas. Nota: para demostrar la respuesta de los sensores a GSR, el interior de una carcasa de cartucho de calibre 40 gastada fue subastado con un hisopo de algodón humedecido en etanol.</li>
	<li>Usando guantes limpios y utilizando tijeras que se han limpiado con alcohol, cortar una sección de aproximadamente 1 cm2 fuera del centro de la toallita.</li>
	<li>Coloque la pieza cortada de la toallita de mano o el bastoncillo de algodón directamente en un tubo de cultivo que contenga 2 mL de las bacterias del sensor, asegurando que esté sumergida en el caldo.</li>
	<li>Proceda como se describió anteriormente en los pasos 7,4 – 7,5.</li>
</ol>9. Análisis de fluorescencia utilizando espectrómetro portátil (ver tabla de materiales)
<ol><li>Utilice un mezclador de vórtice para agitar los tubos.</li>
	<li>Prepare el espectrómetro para recolectar la emisión de fluorescencia en la longitud de onda apropiada para su variante RFP con una longitud de onda de excitación de 500 nm.</li>
	<li>Utilice el caldo Luria para grabar un espectro en blanco.</li>
	<li>Transfiera cuidadosamente cada sobrenadante a una cubeta de volumen bajo y recoja la intensidad de la emisión.</li>
</ol>10. Análisis de fluorescencia utilizando 96-lector de placas de pozo (ver tabla de materiales)
<ol><li>Utilice un mezclador de vórtice para agitar los tubos.</li>
	<li>Transferir 200 mL del caldo a un pozo en la placa de pozo. Registre qué muestras entraron en cada pozo de la placa.</li>
	<li>Configure el fluorómetro para recoger la intensidad de emisión en la longitud de onda adecuada para la variante RFP.</li>
</ol>11. Análisis de datos
<ol><li>Utilizando la señal obtenida de todos los controles negativos (bacterias negativas de RFP o bacterias de sensor sin analito añadido), calcule una señal de fluorescencia promedio para el fondo.</li>
	<li>Reste la señal de fondo promedio de cada señal de fluorescencia obtenida para que las bacterias del sensor obtengan una intensidad de fluorescencia corregida en el fondo.</li>
	<li>Calcule la relación señal-ruido (S/N) dividiendo la intensidad de fluorescencia corregida en el fondo por la señal de fondo media. Si la relación S/N es mayor que 3, la prueba es positiva.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen intereses financieros competidores u otros conflictos de interés para revelar.

Las modificaciones y la solución de problemas
El experimento descrito en el cuadro 4 se puede modificar de cualquier manera adecuado a los sensores que se han diseñado. El aspecto más importante de un sensor químico es evaluar su sensibilidad y especificidad. Es beneficioso asegurarse de que se analice una amplia gama de concentraciones del analito para determinar el rango analítico útil del sensor. También vale la pena determinar un nivel máximo de analito pa...

Un biosensor es cualquier dispositivo analítico que utiliza componentes biológicos (como proteínas, ácidos nucleicos o organismos enteros) que producen una respuesta que se puede utilizar para la detección de una sustancia química o un analito. Como ejemplo, la industria minera de carbón utilizó un biosensor durante gran parte del siglo 20 para detectar la presencia de gases tóxicos de la mina: el canario en la mina de carbón1. Los mineros observaron la respuesta del organismo biológico (muerte o angustia) a un analito químico (monóxido de carbono) con el fin de proteger a los trabajadores. En un ejemplo más moderno y sofisticado, las bacterias se pueden alterar utilizando técnicas de biología sintética para responder a la presencia de un determinado analito químico mediante la exposición de una respuesta específica, como la expresión de una proteína fluorescente.
La biología sintética es un término amplio que se refiere a la construcción de dispositivos biológicos y sistemas que no existen de forma natural, o el re-diseño de los sistemas biológicos existentes para un propósito específico2. La biología sintética se distingue de la ingeniería genética por una metodología estándar y la existencia de piezas estandarizadas (elementos genéticos de biología sintética estándar) que se pueden utilizar para sintetizar dispositivos y sistemas. Una parte se introduce en el genoma de un dispositivo, un organismo como una bacteria, para expresar un cierto rasgo que servirá como una indicación de la función. Por ejemplo, en muchos dispositivos sintéticos, la expresión de una proteína fluorescente se introduce en un organismo unicelado como una proteína reportera. Se pueden combinar varios dispositivos en un sistema. Los genomas de microorganismos como las bacterias son fáciles de manipular de esta manera. Se han notificado numerosos ejemplos de biosensores específicos de una amplia gama de analitos químicos en la bibliografía de la última década3,4.
En este trabajo, el sistema MicRoboCop se presenta como un ejemplo de un biosensor diseñado utilizando técnicas de biología sintética con nuevas aplicaciones en la química forense y ambiental. MicRoboCop es un sistema de tres dispositivos separados que, cuando se combinan, permitirán a Escherichia coli expresar proteína fluorescente roja (RFP) en presencia de residuos de disparos (GSR) que se han recogido de las manos o de la superficie de una persona. Cada uno de los tres dispositivos responde a un analito químico específico que se sabe que es un componente de GSR5. Los tres analitos a los que responde el sistema son I. 2, 4, 6-trinitrotolueno (TNT) y compuestos relacionados, II. plomo (en forma de iones de plomo), y III. Antimonio (también en forma de iones).
GSR consiste en muchas sustancias químicas diferentes, pero los tres generalmente utilizados para identificar un residuo como GSR son bario, plomo, y antimonio5. La prueba probatoria estándar para la identificación de GSR es utilizar microscopía electrónica de barrido (SEM) con fluorescencia de rayos X de dispersión de energía (EDX)5. SEM-EDX permite a los analistas identificar la morfología única y los componentes elementales de GSR. En la actualidad, hay pocas pruebas presuntivas binarias ampliamente utilizadas disponibles. Una prueba presuntiva recientemente publicada utiliza espectroscopía de movilidad iónica (IMS), que es un equipo especializado que podría no estar disponible en muchos laboratorios6. También hay algunas pruebas de color "spot" que se pueden utilizar, aunque se utilizan típicamente para la determinación de la distancia o para la identificación GSR en los agujeros de la bala y las heridas5. Adicionalmente, ha habido cierta atención limitada en la literatura a las pruebas electroquímicas para GSR que emplean el análisis voltamométrico, que tiene la ventaja de ser potencialmente portable en el campo, o voltametría de desmonte anódico, que es un extremadamente método sensible para los elementos metálicos7. Hay muy poca mención en la literatura de biosensores diseñados específicamente con el propósito de detectar GSR, aunque algunos biosensores para otras aplicaciones forenses han sido publicados8.
Los elementos biológicos para cada dispositivo en el sistema MicRoboCop, y la construcción del plásmido, se ilustran en la figura 1. La flecha curvada en la figura 1B representa la región promotora que se activa en presencia del analito, el óvalo es el sitio de Unión ribosomal que permite la traducción de la proteína reportera, la caja gris ETIQUETADA como RFP es el gen que expresa el rojo proteína fluorescente, y el octágono rojo es el sitio de terminación de la transcripción. Los tres dispositivos se utilizarán juntos como un sistema para detectar GSR. Cada dispositivo con un promotor específico (SbRFP, PbRFP y TNT-RFP) será incubado con la muestra que se está probando y se medirá la fluorescencia de RFP. La RFP solo se expresará si el analito químico adecuado está presente y activa la región promotora. Tres dispositivos que responden a algunas de las sustancias químicas presentes en GSR han sido diseñados y se presentan en este trabajo.
Los promotores utilizados en los tres dispositivos de microbocop son un promotor sensible al arsénico y antimonio, sbrfp9,10, un promotor sensible al plomo, pbrfp11,12 y un promotor sensible de TNT, TNT-RFP 13. debido a que una búsqueda en la literatura no reveló ningún promotor diseñado para responder a Barium, el promotor de TNT fue seleccionado en su lugar ya que este promotor es sensible a una serie de compuestos estructuralmente relacionados (en particular, 2, 4-dinitrotolueno y dinitrobenceno) que son conocidos por ser una parte de los compuestos orgánicos dejados atrás en GSR. Este promotor se ha utilizado con éxito para detectar específicamente cantidades minutas de TNT y 2, 4-dinitrotolueno (2, 4-DNT) en las minas terrestres enterradas13. Utilizando los tres dispositivos juntos como un sistema, una prueba positiva para GSR producirá fluorescencia en los tres dispositivos. Una señal de fluorescencia en sólo uno o dos dispositivos indicará otra fuente ambiental del analito (s) o en el caso del promotor de TNT, activación por un compuesto que no es un compuesto orgánico dejado atrás en GSR. Mediante el uso de los tres dispositivos juntos, se minimiza la posibilidad de resultados falsos positivos debido a las fuentes ambientales. La munición sin plomo, que está ganando popularidad, todavía representa sólo el 5% de las ventas de municiones en los Estados Unidos; por lo tanto, los resultados falsos negativos debido a la ausencia de plomo pueden ser una posibilidad, pero todavía hay utilidad en un sensor que utiliza plomo como marcador para GSR14. Además de esta aplicación forense específica, cada dispositivo se puede utilizar por separado con el fin de detectar contaminantes ambientales.
Los protocolos presentados incluyen las técnicas de biología sintética utilizadas para crear los dispositivos (bacterias del sensor) y las técnicas analíticas para comprobar la función de los dispositivos y analizar las señales de fluorescencia obtenidas. El protocolo también incluye la recolección de evidencia forense en forma de limpieza de manos para recoger GSR de las agujas de un sospechoso o hisopado para recoger GSR de una superficie. Los resultados del dispositivo del sensor de plomo se presentan como resultados de ejemplo, junto con una demostración de una prueba positiva para GSR utilizando una carcasa de cartucho gastado.

<table><tbody><tr><td>1,3-dinitrobenceno, 97%</td><td>Aldrich</td><td>D194255-25G</td><td></td></tr><tr><td>2,4-dinitrotolueno, 97%</td><td>Aldrich</td><td>101397-5G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>Antimonio, solución estándar de referencia (1000ppm &plusmn; 1%/Certificado)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA450-100</td><td>Estándar en HNO3</td></tr><tr><td>diluido Tampón</td> inteligente de corte New <td>England BioLabs</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>Tampón dúplex</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td>11-01-03-00</td><td></td></tr><tr><td>Enzima de restricción EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, grado HPLC, desnaturalizado</td><td>Acros Organics</td><td>AC611050040</td><td>No es necesario que los solventes sean de grado HPLC, ACS o grado reactivo funcionarán.</td></tr><tr><td>Eurofins Genomics SimpleSeq Kits de secuenciación de ADN</td><td>Eurofins Genomics</td><td>SimpleSeq Kit Standard</td><td></td></tr><tr><td>Forward para PCR de colonias</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td></td><td>5'- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3'</td></tr><tr><td>Imprimación directa para la secuenciación de ADN</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'- GTAAAACGACGGCCAGTG-3'</td></tr><tr><td>Minikit de plásmido de alta velocidad IBI Science</td> Caldo <td>de IB47101</td><td></td>LB de <td>IBI Scientific</td></tr><tr><td>,</td> Miller <td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Lead, solución estándar de referencia (1000ppm &plusmn; 1%/Certificado)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SL21-100</td> Standard en toallitas desechables de limpieza y descontaminación <td>HNO3</td></tr><tr><td>LeadOff</td><td>diluidas Hygenall</td><td>45NRCN</td><td>Vendida en botes o envuelta individualmente, cualquier toallita a base de alcohol funcionará.</td></tr><tr><td>Metanol, grado HPLC</td> Los solventes <td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td>no necesitan ser de grado HPLC, ACS o grado reactivo funcionarán.</td></tr><tr><td>NEB 5-alfa Competente E. coli células</td><td>New England BioLabs</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>NheI-HF Enzima de restricción</td> New <td>England BioLabs</td><td>R3131S</td><td></td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasa</td><td>New England BioLabs</td><td>B1500S</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq 2X Master Mix con tampón estándar</td><td>New England BioLabs</td><td>M0482S</td><td></td></tr><tr><td>Plásmidos del registro de partes biológicas estándar utilizadas para biología sintética</td><td>Registro de partes</td><td></td> biológicas estándar <td>http://parts.igem.org/Main_Page</td></tr><tr><td>secuencias promotoras Tecnologías</td><td></td><td>integradas de ADN</td><td>Promotor Sb: 5'-GCATGAATTCA 
GTCATATATGTTTTTGACTTATCC 
GCTTCGAAGAGAGAGACACTACCT 
GCAACAATCGCTAGCGCAT-3' 
3'-CGTACTTAAGCTCACTATA 
TACAAAAACTGAATAGGCGAAGC 
TTCTCTCTCTGTGATGGACGTTG 
TTAGCGATCGCGTA-5'
 
Promotor de Pb: 5'-GCATGAATTCG 
TCTTGACTCTATAGTAACTAAGGG 
 TGTATAATCGGCAACGCG 
AGCTAGCGCAT-3' 
3'-CGTACTTAAGCAGAA 
CTGAGATATCATTGATCTCCCACA 
TCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGC 
GTA-5'
 
Promotor TNT: 5' GCATTCTAGAT 
CAATTTATTTGAACAAGGCGGTCA 
ATTCTCTTCGATTTTATCTCTCGT 
AAAAAAACGTGATACTCATCACAT 
CGACGAAACAACGTCACTTATACA 
AAAATCACCTGCGAGAGATTAATT 
GAATTCGCAT3' 
3' CGTAAGATCTAGTTAA 
ATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGA 
GAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTT 
TTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGC 
TTTGTTGCAGTGAATATGTTTTTA 
GTGGACGCTCTCTCTAATTAACTTAA 
GCGTA5'</td></tr><tr><td>Imprimación inversa para PCR de colonias</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3'</td></tr><tr><td>Imprimación inversa para secuenciación de ADN</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'- GGAAACAGCTATGACCATG-3'</td></tr><tr><td>ADN ligasa T4 Nueva</td><td>Inglaterra BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr></tbody></table>

preparación y aplicación de un nuevo biosensor bacteriano para la detección presuntiva de residuos de disparos

Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue

MicRoboCop es un biosensor que ha sido diseñado para una aplicación única en la química forense. MicRoboCop es un sistema formado por tres dispositivos que, cuando se usan juntos, pueden indicar la presencia de residuos de disparos (GSR) produciendo una señal de fluorescencia en presencia de tres analitos clave (antimonio, plomo y componentes orgánicos de GSR). El protocolo describe la síntesis de los biosensores utilizando Escherichia coli (e. coli), y los métodos de química analítica utilizados para evaluar la selectividad y sensibilidad de los sensores. El funcionamiento del sistema se demuestra mediante el uso de GSR recogido desde el interior de una carcasa de cartucho gastado. Una vez preparados, los biosensores se pueden almacenar hasta que se necesiten y se pueden utilizar como prueba para estos analitos clave. Una respuesta positiva de los tres analitos proporciona una prueba positiva presuntiva para la GSR, mientras que cada dispositivo individual tiene aplicaciones para detectar los analitos en otras muestras (p. ej., un detector de contaminación por plomo en el agua potable). La principal limitación del sistema es el tiempo necesario para una señal positiva; trabajo futuro puede implicar el estudio de diferentes organismos para optimizar el tiempo de respuesta.

Los espectros de fluorescencia para la variante RFP utilizada en este trabajo se muestran en la figura 2. Estos datos provienen del dispositivo PbRFP, ya que responde al plomo y al dispositivo TNT-RFP, ya que responde a dos analitos, 2, 4-DNT y 1, 3-DNB. Esta figura muestra el espectro de un control negativo (sin analito añadido) y los espectros en dos niveles diferentes de analito añadidos. La señal de fluorescencia máxima para la variante de RFP utilizada se observó en ...

Un protocolo se presenta utilizando técnicas de biología sintética para sintetizar un conjunto de biosensores bacterianos para el análisis de residuos de disparos, y para probar el funcionamiento de los dispositivos para su uso previsto utilizando espectroscopía de fluorescencia.

Preparación y aplicación de un nuevo biosensor bacteriano para la detección presuntiva de residuos de Disparos

MicRoboCop is a biosensor that has been designed for a unique application in forensic chemistry. MicRoboCop is a system made up of three devices that, ...

Este protocolo describe la preparación y el análisis de un biosensor único que ha sido diseñado para detectar los componentes químicos de los residuos de disparos. El uso de biosensores para aplicaciones forenses es único. Representa una alternativa de bajo costo y fácil de usar a la instrumentación altamente especializada que se utiliza normalmente en laboratorios forenses.Los métodos de biología sintética descritos se pueden utilizar para cualquier sistema que utilice piezas de biología sintética estándar. El análisis químico descrito es aplicable a cualquier biosensor que exprese proteína fluorescente roja. Demostrando el procedimiento serán Andrea Soles y Elle Richardson, estudiantes de pregrado en la Universidad de Longwood.Para comenzar este procedimiento, añada diez microlitros del ADN plásmido J10060 previamente aislado a un tubo de microcentrífuga. Agregue ocho microlitros de agua y un microlitro de cada una de las enzimas EcoRI y NHEL premezcladas con un microlitro de tampón. Para el ADN promotor, agregue diez microlitros de secuencias de ADN promotor recocido a un tubo de microcentrífuga fresco.Agregue ocho microlitros de agua y un microlitro de cada una de las enzimas EcoRI y NHEL premezcladas con un microlitro de tampón. Con una pipeta ajustada a diez microlitros, pipetee suavemente las muestras hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Incubar las muestras a 37 grados centígrados durante 30 minutos.Luego, calienta y activa las enzimas a 80 grados Celsius durante cinco minutos. Almacene el ADN digerido en un congelador hasta que esté listo para proceder. En primer lugar, utilice el plasmamido y el ADN promotor que se digierieron previamente para establecer la reacción en un tubo de microcetrifuje sobre hielo, como se describe en la tabla uno del protocolo de texto.Asegurándose de añadir el T4 DNA Ligase último. Pipetear hacia arriba y hacia abajo suavemente para mezclar la reacción, y centrifugar brevemente. Incubar a temperatura ambiente durante diez minutos.Luego, calienta y activa a 65 grados centígrados durante diez minutos. Realice la transformación tal como se describe en el protocolo de texto. En primer lugar, configure las mezclas de reacción para PCR como se describe en la tabla dos del protocolo de texto.Pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar las reacciones. Usando una punta de pipeta amarilla, raspa una colonia de la E.coli transformada. Transfiera un golpe de este E.coli a una nueva placa de agar de lb-ampicilina que haya sido seccionada, y luego inserte la punta de la pipeta en el tubo PCR.Agitar la punta de la pipeta para mezclar el E. coli con la mezcla de PCR. Repita este proceso tres veces más para colonias adicionales. A continuación, cargue los tubos de PCR en una máquina PCR y comience a termociclismo como se describe en la tabla tres del protocolo de texto.Para comenzar, etiquete el número adecuado de tubos de cultivo estériles como se describe en la tabla cuatro del protocolo de texto. Añadir dos mililitros del caldo de cultivo preparado a cada tubo. Agregue la solución de material de anilito a los tubos como se describe en la tabla cuatro.A continuación, coloque las tapas de presión en los tubos de cultivo para que estén sueltas para permitir el flujo de aire en el tubo. Vórtice cada tubo de cultivo. Después de esto, coloque los tubos en una incubadora de temblores a 37 grados centígrados y a 220 RPM durante al menos 24 horas.En primer lugar, utilice una toallita a base de etanol diseñada para eliminar el plomo para limpiar todas las superficies de las manos, incluso entre los dedos. Guarde las toallitas en una bolsa sellable debidamente etiquetada hasta su análisis. Use una toallita a base de alcohol para limpiar las superficies grandes que se van a probar.Use un intercambio de algodón humedecido con etanol para limpiar las superficies pequeñas que se van a probar. Usando guantes limpios y usando tijeras que hayan sido limpiadas con alcohol, corte una sección que esté aproximadamente a un centímetro cuadrado del centro de la toallita. A continuación, coloque la pieza cortada de toallitas, o hisopo de algodón, directamente en un tubo de cultivo que contenga dos mililitros de las bacterias del sensor, y asegúrese de que esté completamente sumergido en el caldo.Prepare el espectrómetro para recoger la presentación de fluorescentes en la longitud de onda adecuada para la variante RFP, con una longitud de onda de excitación de 500 nanómetros. A continuación, utilice un mezclador de vórtice para agitar los tubos. Transfiera cuidadosamente cada sobrenadante a una cubeta de bajo volumen y recoja la intensidad de emisión.Con un mezclador de vórtices, agite los tubos. Transfiera 200 microlitros del caldo a un pozo en el plato del pozo. Registre qué muestras entraron en cada pozo de este plato.Configure el harineilómetro para recoger la intensidad de emisión en la longitud de onda adecuada para la variante RFP. Los espectros de fluorescencia para una variante RFP representativa muestran tanto el control negativo como los espectros en dos niveles diferentes de anilito añadido. La señal fluorescente máxima para la variante RFP utilizada en este trabajo se observa en 575 nanómetros.Se recopilan datos representativos para el mismo conjunto de soluciones, tanto del espectrómetro portátil como del fluorómetro. Hay una tendencia general de la fluorescencia aumentando a medida que aumenta la concentración de anilito. Vale la pena señalar que a altas concentraciones, más de 800 partes por mil millones para el sensor de plomo, la respuesta cae debido a la toxicidad del plomo a una concentración tan alta.El análisis de muestras de hisopo de etanol desde el interior de una carcasa de cartucho de calibre 40 gastado proporciona pruebas de los resultados principales. Los resultados positivos de cada una de las tres bacterias del sensor, indican una prueba positiva de residuos de disparos. Los biosensores preparados en este protocolo también se pueden utilizar individualmente para detectar contaminación en alimentos, agua o muestras ambientales.Esta técnica allana el camino para que los investigadores desarrollen biosensores utilizando técnicas de biología sintética estándar para una variedad de diferentes anilitos químicos. Se debe usar equipo de protección personal, y los analistas deben lavarse las manos y desinfectar las superficies después de manipular E.coli. Los desechos deben ser autoclavados, y cualquier residuo que contenga metales pesados debe tratarse en consecuencia.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

Recientemente hemos informado de un nuevo enfoque para la generación de sondas fluorogénicos DNAzyme que se pueden aplicar para crear un simple, "mezclar y leer" ensayo de inmunofluorescencia para la detección de bacterias. Estas sondas de ADN especiales catalizar la escisión de un cromóforo modificado con ADN-ARN sustrato quimérico en la presencia de la mezcla bruta extracelular (CEM), producida por una bacteria específica, con lo que la traducción de detección de bacterias en la generación de...

La detección de bacterias mediante ADNzimas fluorogénicos

Se describe un método de ensayo sensor electroquímico para la detección e identificación bacteriana rápida. El ensayo implica una serie de sensores funcionalizado con sondas de captura de oligonucleótidos de ADN para ARN ribosomal (ARNr) secuencias específicas de la especie. Sandwich hibridación de ARNr objetivo con la sonda de captura y una sonda de oligonucleótido detector de ADN unido a peroxidasa de rábano picante produce una corriente amperométrica medible.

Bacterial Detección e Identificación Usando sensores electroquímicos

Fuente: Barber, A. E., et al. Preparación y aplicación de un nuevo biosensor bacteriano para la detección presuntiva de residuos de disparos. J. Vis. Exp. (2019).Este video demuestra la detección de analitos específicos utilizando un biosensor bacteriano. Se toma un cultivo bacteriano que lleva un plásmido con un gen de proteína fluorescente roja (RFP) bajo un promotor sensible al analito. Después de limpiar a fondo la superficie de prueba, una pequeña sección de la toallita se sumerge en el...

Detección de un analito objetivo mediante un biosensor bacteriano

Comienza con un cultivo de biosensores bacterianos suspendido en un medio.Estas bacterias modificadas producen un factor de transcripción que, al unirse a un metabolito fecal específico, activa un promotor asociado a un gen reportero fluorescente.A este cultivo, añade una muestra hecesal humana filtrada que contenga metabolitos, como el lactato, que participan en las interacciones huésped-microbioma.Diluye esta mezcla con un medio fresco para mantener un volumen de reacción óptimo.Incuba sin...

Detección de metabolitos fecales humanos mediante un biosensor bacteriano

Fuente: Zhang, M. et al., Pruebas rápidas de susceptibilidad antimicrobiana mediante imágenes de dispersión Raman estimulada de incorporación de deuterio en una sola bacteria. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demuestra la aplicación de la microscopía de dispersión Raman estimulada para evaluar la susceptibilidad a los antibióticos mediante el seguimiento de la actividad metabólica marcada con deuterio. Al monitorizar señales de carbono-deuterio, el método permite la detección rápida de poblaciones...

Detección de la susceptibilidad a antibióticos bacterianos mediante un microscopio Raman de dispersión estimulado

Biosensores fagos líticos y los granos de anticuerpos son capaces de discriminar entre resistente a la meticilina (MRSA) y la bacteria estafilococo sensibles. Los fagos se inmovilizaron mediante un método de Langmuir-Blodgett sobre una superficie de un sensor de microbalanza de cristal de cuarzo y trabajaron como amplias sondas estafilococo gama. Perlas de anticuerpos reconocen SARM.

Biosensor para la detección de antibióticos Las bacterias estafilococo resistentes

Aquí se ha descrito un método para localizar bacterias dentro de tejidos embebidos en parafina utilizando sondas de ADN dirigidas al ARNr 16S marcadas con DIG. Este protocolo se puede aplicar para estudiar el papel de las bacterias en diversas enfermedades como la periodontitis, los cánceres y las enfermedades inmunitarias inflamatorias.

La detección in situ de las bacterias dentro de los tejidos embebidos en parafina utilizando un ADN sonda digoxina marcada focalización 16S rRNA

En este trabajo se presenta un nuevo método para estudiar las interacciones de la proteína-proteína usando un biosensores conductimétricos basados en la tecnología híbrida de β-lactamasa. Este método se basa en la liberación de protones al producirse la hidrólisis de β-lactámicos.

El uso de un análisis de biosensores conductimétricos β-lactamase-base para detectar las interacciones biomoleculares

Se presenta un protocolo para el desarrollo de un biosensor electroquímico de ADN que comprende un electrodo de carbono nanopartículas modificadas, serigrafiados oro, estabilizado con ácido del poliláctico para la detección de Vibrio parahaemolyticus .

Desarrollo de un Biosensor de ADN electroquímico para la detección de un patógeno de transmisión alimentaria

Aquí, presentamos un protocolo para la detección y cuantificación de moléculas abundantes bajas en soluciones complejas usando molecular imprinting en combinación con un biosensor de capacitancia.

Detección ultrasensible de biomarcadores utilizando una impresión Molecular basado Biosensor capacitiva

Para facilitar la detección rápida y precisa de Acinetobacter baumannii, presentamos un protocolo que emplea la amplificación de la polimerasa recombinasa (RPA) junto con la endonucleasa LbaCas12a para identificar infecciones por A. baumannii .

Detección rápida y específica de infecciones por Acinetobacter baumannii mediante un sistema de amplificación de polimerasa recombinasa/Cas12A

Aprende a preparar biosensores bacterianos para detectar residuos de disparos mediante biología sintética y espectroscopía de fluorescencia. Este protocolo ofrece una alternativa forense económica y accesible.

Preparación y aplicación de un nuevo biosensor bacteriano para la detección presuntiva de residuos de Disparos

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