Name: Inactivación química del E3 Ubiquitin Ligase Cereblon por Homo-PROTACs basados en Pomalidomida (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprende a sintetizar homo-PROTACs basados en pomalidomida para inducir la degradación de la ligasa E3 Cereblon. Este método permite investigar mecanismos moleculares de análogos de talidomida con aplicaciones potenciales en obesidad y enfermedades infecciosas.

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Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (Emmy-Noether Program Kr-3886/2-1 y SFB-1074 a J.K.; FOR2372 a M.G.)

1. Preparación de moléculas PROTAC
ADVERTENCIA: Consulte todas las fichas de datos de seguridad de materiales (MSDS) relevantes antes de su uso. Varios de los productos químicos utilizados en estas síntesis son tóxicos y cancerígenos. Utilice todas las prácticas de seguridad y equipos de protección personal adecuados.
<ol><li>Preparación de carbamato tert-butilo N-(2,6-dioxo-3-piperidyl)(compuesto 1)
	<ol>
<li>Añadir 1,1'-carbonyldiimidazol (1,95 g, 12 mmol) y una cantidad catalítica de 4-(dimetilamino)piridina (5 mg) a una mezcla de Boc-Gln-OH (2,46 g, 10 mmol) en THF (50 ml) en matraz de fondo redondo de 100 ml con barra de agitación y equipado con un condensador. Calentar en el reflujo durante 10 horas mientras se revuelve hasta que se forme una solución clara.</li>
		<li>Retire el disolvente bajo presión reducida con un evaporador rotativo, agregue EtOAc (200 ml) y transfieralo a un embudo separador. Lavar la capa orgánica con H2O (50 mL) y salmuera (50 mL) y secarla sobre Na2SO4.</li>
		<li>Filtrar la solución a través de una almohadilla corta de gel de sílice (5 cm de diámetro y 5 cm de altura) y eluir con un volumen adicional (200 ml) de EtOAc.</li>
		<li>Evaporar el disolvente y secar el sólido incoloro obtenido en vacuo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de carbamato tert-butilo N-(1-metil-2,6-dioxo-3-piperidyl)(compuesto 2)
	<ol>
<li>Combine el compuesto 1 (2,28 g, 10 mmol) con carbonato de potasio molido (2,76 g, 20 mmol) y DMF (25 ml) en un matraz inferior redondo de 100 ml. Añadir yodometanono (1,42 g, 0,62 ml, 10 mmol) en gota utilizando una jeringa y equipar el matraz con un tabique de goma perforado. Coloque el recipiente de reacción en un baño de ultrasonidos durante 2 h.</li>
		<li>Diluir la mezcla de reacción con EtOAc (100 ml) y transferirla a un embudo separador. Lavar la capa orgánica con 1 N NaOH (2x 25 mL), H2O (25 mL) y salmuera (25 mL), y secarla sobre Na2SO4.</li>
		<li>Filtrar y evaporar el disolvente. Purificar el producto por cromatografía de columna sobre gel de sílice (6 cm de diámetro de columna y 20 cm de altura) utilizando éter de petróleo/EtOAc (2:1).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4-fluoroisoindolina-1,3-dione (compuesto 3)
	<ol>
<li>Combinar 3-anhídrido de 3-fluoroftálicos (1,25 g, 7,5 mmol), glutamida 1 (1,14 g, 5 mmol) y una solución de acetato de sodio (0,50 g, 6,0 mmol) en ácido acético glacial (20 ml) en un matraz inferior redondo de 50 ml con barra de agitación y equipado con un condensador de reflujo. Calentar la mezcla a 120oC durante 6 h.</li>
		<li>Después de enfriar, verter la mezcla púrpura sobre H2O (100 mL) ymezclar durante 10 minutos.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de 4-fluoro-2-(1-metil-2,6-dioxopiperidin-3-yl)isoindolina-1,3-dione (compuesto 4)
	<ol>
<li>Combinar 3-anhídrido de sodio (1,25 g, 7,5 mmol), glutamida 2 (1,21 g, 5 mmol) y una solución de acetato de sodio (0,50 g, 6,0 mmol) en ácido acético glacial (20 ml) en un matraz de fondo redondo de 100 ml con barra de agitación y equipado con un condensador. Calentar la mezcla a 120oC durante 6 h.</li>
		<li>Después de enfriar, verter la mezcla púrpura sobre H2O (100 mL) ymezclar durante 10 minutos.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de tert-butyl N-[2-[2-[2-[[2-(2,6-dioxo-3-piperidyl)-1,3-dioxo-isoindolin-4-yl]amino]ethoxy]ethoxy]ethyl]carbamato (compuesto 7)
	<ol>
<li>Cargue un matraz inferior redondo de 50 ml con tert-butilo N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamato (5, 0.41 g, 1.65 mmol), compuesto 3 (0.41 g, 1.50 mmol), DMF seco (10 mL) y DIPEA (0.39 g, 0.51 mMil, 3.01 mmol, 3.0mmol). Equipar con una barra de agitación y un condensador de reflujo. Calentar bajo la atmósfera de argón a 90oC durante 10 h.</li>
		<li>Después de enfriar a temperatura ambiente, vierta la mezcla de color verde oscuro en H2O (100 ml) y extraiga con EtOAc (3x 50 mL) en un embudo separador. Lavar las capas orgánicas combinadas con H2O (50 mL) y salmuera (50 ml), secar sobre Na2SO4, filtrar y concentrar en vacuo.</li>
		<li>Purificar el producto crudo por cromatografía de columna sobre gel de sílice (3 cm de diámetro de columna y 60 cm de altura) utilizando un gradiente de éter de petróleo/EtOAc (1:1 a 1:2).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación del homodímero (compuesto 8)
	<ol>
<li>Combine el vinculador de diamina 6 (0,22 g, 0,22 ml, 1,50 mmol), DIPEA (1,05 ml, 6,00 mmol) y una solución de 3 (0,83 g, 3,00 mmol) en DMSO seco (20 ml) en un matraz inferior redondo de 50 ml con barra de agitación y equipado con un conden de reflujo. Calentar bajo la atmósfera de argón a 90oC durante 18 h.</li>
		<li>Después de enfriar a temperatura ambiente, vierta la mezcla de color verde oscuro en H2O (100 ml) y extraiga con EtOAc (3x 50 mL) en un embudo separador. Lavar las capas orgánicas combinadas con H2O (50 mL) y salmuera (50 mL), secar sobre Na2SO4,filtrar y concentrar en vacuo.
</li>
		<li>Purificar el producto crudo por cromatografía de columna sobre gel de sílice (3 cm de diámetro de columna y 50 cm de altura) utilizando un gradiente de éter de petróleo/EtOAc (1:2) a EtOAc.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de heterodimero (compuesto 9)
	<ol>
<li>Disolver el compuesto 7 (0,83 g, 1,65 mmol) en CH2Cl2 seco (10 ml). Añadir ácido trifluoroacético (10 ml) y remover la mezcla amarilla a 40oC durante 2 h en un matraz inferior redondo cerrado de 50 ml.</li>
		<li>Retire los volátiles y coesecone con CH2Cl2 (4x 5 mL). Secar el residuo en vacuo durante 10 h.</li>
		<li>Vuelva a disolver el material en DMF seco (20 ml). Añadir compuesto 4 (0,44 g, 1,50 mmol) y DIPEA (0,78 g, 1,05 ml, 6,00 mmol) y equipar el matraz con un condensador de reflujo. Calentar bajo la atmósfera de argón a 90oC durante 10 h.</li>
		<li>Después de enfriar a temperatura ambiente, vierta la mezcla de color verde oscuro en H2O (100 ml) y extraiga con EtOAc (3x 50 mL) en un embudo separador. Lavar las capas orgánicas combinadas con NaHCO3 saturado (50 mL), H2O (50 mL), 10% KHSO4 (50 mL), H2O (50 mL) y salmuera (50 mL), secar sobre Na2SO4, filtro y concentrado en vacuo.</li>
		<li>Purificar el producto crudo por cromatografía de columna sobre gel de sílice (3 cm de diámetro de columna y 50 cm de altura) utilizando un gradiente de éter de petróleo/EtOAc (1:2) a EtOAc.</li>
		<li>Eluciado y verificar la estructura de la molécula (Figura5A compuesto 8, 5B compuesto 9) por 1H RmN y 13Espectros de RMN C en DMSO-d6 en una resonancia magnética nuclear (RMN) Espectrómetro. Compruebe que la pureza de ambos compuestos sea superior al 97% mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), aplicando una detección de matriz de diodos (DAD) a 220–500 nm.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Validación funcional de moléculas PROTAC
<ol><li>Análisis de la mancha occidental de la degradación de la CRBN por PROTACs NOTA: Los efectos del compuesto8y compuesto9en el nivel de proteína CRBN se probaron mediante el análisis de manchas occidentales. Además, también podría confirmarse el impacto en los niveles de IKZF1 e IKZF3 (Figura 6).<ol><li>
Preparación de muestras
		<ol>
<li>Disolver compuestos 8 y 9,lenalidomida (Len), pomalidomida (Pom), MG132, y MLN-4924 en DMSO a una concentración de 10 mM, alícuota y almacenar a -80 oC hasta su uso posterior.</li>
			<li>Semilla 1 x 106 células MM1S en una placa de 6 pocillos con medios de 2,5 ml y tratar células con 100 nM o 1 m compuesto 8 o 9 para 24 h.</li>
			<li>Cosecha de células después del tratamiento y centrífuga a 700 x g, 5 min, 4oC. Lave el pellet celular con 1PBS frío para eliminar los medios restantes, centrífuga a 700 x g, 5 min, 4 oC, y deseche el sobrenadante. Repita este paso una vez.</li>
			<li>Células Lyse en tampón de lisis (25 mM Tris HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 5% glicerol, 1x cóctel inhibidor de proteasa y fosfatasa) durante 10 minutos sobre hielo, centrífuga a 320 x g durante 10 min, 4 oC. Cosecha sobrenadante y determina la concentración de proteínas mediante un ensayo de proteína de ácido bicincino (ensayo BCA) de acuerdo con el protocolo del fabricante.</li>
			<li>Proteínas de desnaturalidad (15–30 g/muestra) con 1 tampón de carga SUD (5% 2-mercaptoetanol) y hierve 10 min, 75 oC.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
SDS-PAGE
		<ol>
<li>Corregir sándwich de gel con un gel de separación al 10% [4 mL 3x tampón de gel (3 M Tris/HCl, 0,3% (p/v) dodecilo sódico (SDS), pH 8,45), 4 ml de acrilamida 30%, 2,52 ml de glicerol 50%, 1,395 ml de Ah 2 O, 75 ol 11% persulfato de amonio (APS) y 9,75 ml de glicerol 50%, 1,395 ml de Ah2O, 75 ol 11% persulfato de amonio (APS) y 9,75 ol de gel TEMED] y un gel de apilamiento del 4% [1.992 mL 3x tampón de gel, 0,792 ml 30% acrilamida, 3,168 ml H2O, 36 l 11% APS y 6 L de TEMED] en una unidad de ensamblaje de electrodos. Retire los peines, enjuague los pozos con tampón de cátodo (100 mM Tris/HCl, tricine de 100 mM, 0,1% (p/v) SDS) y cargue muestras.</li>
			<li>Llene el búfer de ánodo (100 mM Tris/HCl, pH 8.9) en el tanque. Cargue la muestra de proteína del paso 2.1.1.4 y ejecute SDS-PAGE a 70 V, 20 min, seguido de 115 V, 150 min a tensión constante.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Inmunoblotting y detección de CRBN, IKZF1 e IKZF3
		<ol>
<li>Activar la membrana PVDF (0,45 m) en 100% de metanol durante 1 min. Membrana de equilibración y gel de separación en tampón de transferencia 1x [10x tampón de transferencia (192 mM de glicina, 25 mM Tris-base/HCl, 900 mL H2O), 20% metanol, 0,1% SDS, pH 8.3].</li>
			<li>Montar casete de hinchado de acuerdo con el protocolo del fabricante. Gel de transferencia a 180 mA durante 90 min.</li>
			<li>Membrana de lavado 3x en 1x TBS-T (25 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7.6, 0.1% Tween 20) durante 5-10 min cada uno a temperatura ambiente. Bloquear la membrana en leche sin grasa del 5% (NFDM), TBS-T durante 1 h a temperatura ambiente. Lave la membrana 3x en 1X TBS-T durante 5-10 min cada una a temperatura ambiente.</li>
			<li>Membrana de incubación con anticuerpo primario para CRBN (1:500 en 5% BSA, TBS-T) con agitación suave a 4oC, durante la noche.</li>
			<li>Lave la membrana 3x en 1X TBS-T durante 5-10 min cada una a temperatura ambiente. Membrana de incubación con anticuerpo antiratón (1:10.000 en 5% NFDM, TBS-T) o anticonejo (1:5.000 en 5% NFDM, TBS-T) anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa de rábano picante HRP (1 h a temperatura ambiente.)</li>
			<li>Lave la membrana 2x en 1X TBS-T durante 5-10 min cada una a temperatura ambiente. Repita este paso dos veces con 1 x TBS.</li>
			<li>Membrana de incubación durante 2 min con solución de sustrato hrP según los protocolos del fabricante y detectar quimioluminiscencia en un dispositivo de detección de quimioluminiscencia.</li>
			<li>Lave la membrana 1x en 1X TBS durante 5-10 min cada una a temperatura ambiente. Para la liberación de anticuerpos, membrana de tira en tampón de desmontaje disponible en el mismo, durante 15 min.</li>
			<li>Rebloquear la membrana en 5% de leche sin grasa, TBS-T durante 1 h a temperatura ambiente. Lave la membrana 3x en 1x TBS-T durante 5-10 min cada una a temperatura ambiente y vuelva a sondear con IKZF1, IKZF3 o tubulina según el paso 2.1.3.4.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Experimentos de competición con MG132, MLN4942 o pomalidomida NOTA: Para confirmar si crBN se degrada a través de la vía ubiquitina-proteosoma, realizamos experimentos de competencia con el inhibidor del proteasoma MG132 y un inhibidor de la enzima activadora de neddilación (NAE) MLN4942 (Figura 7).<ol>
<li>Semilla 1 x 106 células MM1S por pozo en una placa de 6 pocillos. Células de prenderide con MG132 de 10 m, 10 M MLN4942, o lenalidomida (100x), e incubar 1 h a 37 oC, 5% CO2.</li>
		<li>Añadir compuesto de 100 nM 8 para 3 h a 37 oC, 5% CO2.</li>
		<li>Cosecha de células para la mancha occidental según el paso 2.1.1.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensayos de viabilidad celular en múltiples líneas celulares de mieloma NOTA: Este ensayo se utiliza para probar el impacto en la viabilidad celular y, además, antagonizar el efecto de los IMID en las células de mieloma múltiple mediante el pretratamiento de las células con compuesto 8 (Figura8, Figura 9A, B).<ol>
<li>Semilla5 x 104 MM1S células por pozo en una placa de 96 pocillos en triplicados biológicos para ensayo de viabilidad. Para el análisis de manchas occidentales, semilla 1 x 106 células MM1S por pozo en una placa de 6 pocillos en triplicados biológicos.</li>
		<li>Tratar las células con DMSO o 100 nM, 1 m o compuesto de 10 M 8, compuesto 9 o pomalidomida e incubar durante 24 h, 48 h, o 96 h a 37 oC, 5% CO2. Para los experimentos de rescate, trate las células con el compuesto de 100 nM 8 durante 3 h, antes o después de la adición de 1 m de pomalidomida e incubar durante 96 h.</li>
		<li>Mida la luminiscencia de la placa de 96 pocillos con un ensayo de viabilidad celular luminiscente, de acuerdo con el protocolo del fabricante en un lector de placas o células de cosecha de la placa de 6 pocillos para el análisis de manchas occidentales.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Los autores no declaran un posible conflicto financiero de intereses.

El diseño de tales homo-PROTAC como se describe aquí para CRBN se basa en la afinidad específica de la pomalidomida con CRBN, que se ha utilizado con éxito en numerosos PROTAC heterobifuncionales y dio lugar al desarrollo de PROTAC 8 como un altamente degradador selectivo de CRBN. La especificidad de nuestra molécula ya ha sido confirmada por los análisis proteómicos24. Para el knockout genéticamente mediado, la exclusión y validación de los efectos secundarios es difícil y requie...

La litimida de los fármacos inmunomoduladores (IID) y sus análogos, lenalidomida y pomalidomida, todos aprobados para el tratamiento del mieloma múltiple, se unen a la e3 ubiquitina ligreblon (CRBN), un adaptador de sustrato para cullin4A-RING E3 ubiquitina ligerina (CRL4CRBN)1,2,3. La unión de los IMID mejora la afinidad de CRL4CRBN con los factores de transcripción linfoide Ikaros (IKZF1) y Aiolos (IKZF3), lo que lleva a su ubiquitinación y degradación (Figura1)4,5, 6 , 7 , 8. Dado que IKZF1 e IKZF3 son esenciales para múltiples células de mieloma, sus resultados de inactivación en la inhibición del crecimiento. SALL4 fue encontrado recientemente como un neo-sustrato adicional inducido por el IMiD de CRBN que es probablemente responsable de la teratogenicidad y la llamada catástrofe de Contergan en la década de 1950 causada por talidomida9,10. Por el contrario, la caseína quinasa 1o (CK1o) es un sustrato específico de lenalidomida de CRBN que está implicado en el efecto terapéutico en el síndrome mielodisplásico con deleciones del cromosoma 5q11.
La capacidad de las moléculas pequeñas para apuntar a una proteína específica para la degradación es una implicación emocionante para el desarrollo de fármacos modernos. Mientras que el mecanismo de talidomida y sus análogos fue descubierto después de su primer uso en humanos, los llamados Proteólisis Targeting Chimeras (PROTACs) han sido diseñados para apuntar específicamente a una proteína de interés (POI) (Figura 2)12,13,14,15,16,17,18. Los PROTACACs son moléculas heterobifuncionales que consisten en un ligando específico para el PDI conectado a través de un vinculador a un ligando de una ligasa de ubiquitina E3 como CRBN o von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20, 21,22. Los PROTAC inducen la formación de un complejo ternario transitorio, dirigiendo el PDI a la ligasa de ubiquitina E3, lo que resulta en su ubiquitinación y degradación proteasomal. Las principales ventajas de los PROTAC sobre los inhibidores convencionales es que la unión a un PDI es suficiente en lugar de su inhibición y, por lo tanto, los PROTAC pueden potencialmente apuntar a un espectro mucho más amplio de proteínas, incluidas las que se consideraron ingodibles como factores de transcripción15. Además, las moléculas quiméricas actúan catalíticamente y por lo tanto tienen una alta potencia. Después de la transferencia de ubiquitina al PDI, el complejo ternario se disocia y está disponible para la formación de nuevos complejos. Por lo tanto, las concentraciones muy bajas de PROTAC son suficientes para la degradación de la proteína diana23.
Aquí describimos la síntesis de un homo-PROTAC conjugado conjugado pomalidomida-pomalidomida (compuesto 8)que recluta CRBN para la degradación de sí mismo24. El CRBN de la ligasa de ubiquitina E3 sirve como reclutador y objetivo al mismo tiempo (Figura3). Para validar nuestros datos, también sintetizamos un control de enlace negativo (compuesto 9). Nuestros datos confirman que el homo-PROTAC recién sintetizado es específico para la degradación de CRBN y sólo tiene efectos mínimos en otras proteínas.

<table><tbody><tr><td>1,1'-carbonildiimidazol</td><td>TCI productos químicos</td><td>C0119</td><td></td></tr><tr><td>2,2&prime;-(Etilendioxi)-bis(etilamina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>385506</td><td>compuesto 6</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>3-anhídrido fluoroftálico, 98 %</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12275</td><td></td></tr><tr><td>4-dimetilaminopiridina, 99 %</td><td>Acros</td><td>148270250</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamidas tóxicastamml&ouml; sung/ Bisacrilamida (30%/0,8%)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.1</td><td></td></tr><tr><td>Aiolos (D1C1E)</td><td>mAB Señalización</td> celular <td>15103S</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CRBN producido en conejo</td><td>Sigma</td><td>HPA045910</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-conejo IgG ligado a HRP</td><td>Sigma</td><td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>Roth</td><td>9592.2</td><td></td></tr><tr><td>Boc-Gln-OH</td><td>Productos químicos TCI</td><td>B1649</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Ensayo de viabilidad de células luminiscentes</td><td>Promega</td><td>G7571</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc XRS+</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>DMF, anhidro, 99,8 %</td><td>Acros</td><td>348435000</td><td>Extra seco sobre tamiz molecular</td></tr><tr><td>DMSO, anhidro, 99,7 %</td><td>Acros</td><td>348445000</td><td>Extra Seco sobre Tamiz Molecular</td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15523-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón (HRP conjugado)</td><td>Santa Cruz biotechnology</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease & Inhibidor de la fosfatasa Cóctel de un solo uso (100X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1861280</td><td></td></tr><tr><td>Ikaros (D6N9Y)</td><td>Señalización de células</td> Mab <td>14859S</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de transferencia ImmobilonP (0,45&micro; m)</td><td>Merck</td><td>IPVH000010</td><td></td></tr><tr><td>Yodometano, 99 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8507</td><td>Metanol altamente tóxico</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32213-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Mg132</td><td>Selleckchem</td><td>S2619</td><td></td></tr><tr><td>Mini celda de transferencia electroforética Trans-Blot</td><td>Bio-Rad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>MLN4942</td><td>biomol (caimán)</td><td>Cay15217-1</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal anti-&alfa;-tubulina producido en ratón (B512)</td><td>Sigma</td><td>T5168</td><td></td></tr><tr><td>N-etildiisopropilamina, 99 %</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11801</td><td></td></tr><tr><td>Leche en polvo descremada</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A0830,0500</td><td></td></tr><tr><td>Nunc F96 MicroWell Blanco Placa de poliestireno</td><td>Thermo Scientific</td><td>136101</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Tampón de muestra (4X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Kit de ensayo de proteínas BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pomalidomida</td><td>Selleckchem</td><td>S1567</td><td></td></tr><tr><td>RestoreTM Tampón de decapado Western Blot</td><td>Thermo Scientific</td><td>46430</td><td></td></tr><tr><td>sodio sulfato de dodecilo</td><td>Carl Roth</td><td>183.1</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539-500g</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Carl Roth</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>terc-butilo N-[2-[2-(2--(2-aminoetoxi)etoxi]etil]carbamato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89761</td><td>Compuesto 5</td></tr><tr><td>Tricina</td><td>Carl Roth</td><td>6977.4</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-500ml</td><td></td></tr><tr><td>WesternBright ECL spray</td><td>Advansta</td><td>K-12049-D50</td><td></td></tr></tbody></table>

inactivación química del e3 ubiquitin ligase cereblon por homo-protacs basados en pomalidomida

Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs

La talidomida de los fármacos inmunomoduladores (IMID) y sus análogos, lenalidomida y pomalidomida, todos los medicamentos aprobados por la FDA para el tratamiento del mieloma múltiple, inducen ubiquitinación y degradación de los factores de transcripción linfoide Ikaros (IKZF1) y Aiolos (IKZF3) a través de la ligasa de ubiquitina cereblon (CRBN) E3 para la degradación proteasomal. Los IMID se han utilizado recientemente para la generación de proteólisis bifuncional dirigida a quimeras (PROTAC) para apuntar a otras proteínas para la ubiquitinación y la degradación proteasomal por la ligasa CRBN E3. Diseñamos y sintetizamos PROTACfuncionales basados en pomalidomida y analizamos su capacidad para inducir la ubiquitinación autodirigida y la degradación de CRBN. Aquí, CRBN sirve como ambos, la ligada a la ubiquitina E3 y el objetivo al mismo tiempo. El compuesto homo-PROTAC 8 degrada CRBN con una alta potencia con sólo efectos restantes mínimos sobre IKZF1 e IKZF3. La inactivación de CRBN por compuesto 8 no tuvo ningún efecto sobre la viabilidad celular y la proliferación de diferentes líneas celulares de mieloma múltiple. Este homo-PROTAC deroga los efectos de los ID En múltiples células de mieloma. Por lo tanto, nuestros compuestos homodíricos a base de pomalidomida pueden ayudar a identificar los sustratos endógenos y las funciones fisiológicas de CRBN e investigar el mecanismo molecular de los IMID.

Aquí describimos el diseño, síntesis y evaluación biológica de un PROTAC homodimérico basado en pomalidomida para la degradación de CRBN. Nuestro PROTAC interactúa simultáneamente con dos moléculas CRBN y forma complejos ternarios que inducen la autoubiquitinación y la degradación proteasomal de CRBN con sólo efectos mínimos restantes sobre neo-sustratos inducidos por pomalidomida IKZF1 o IKZF3.
De una serie de moléculas PROTAC<...

Este trabajo describe la síntesis y caracterización de un homo-PROTAC bifuncional basado en pomalidomida como un enfoque novedoso para inducir la ubiquitinación y degradación de la e3 ubiquitina ligreblon (CRBN), el objetivo de los análogos de la talidomida.

Inactivación química del E3 Ubiquitin Ligase Cereblon por Homo-PROTACs basados en Pomalidomida

The immunomodulatory drugs (IMiDs) thalidomide and its analogs, lenalidomide and pomalidomide, all FDA approved drugs for the treatment of multiple ...

Nuestros PROTAC homodiméricos son los primeros inhibidores químicos de Cereblon y pueden ayudar a dilucidar aún más el mecanismo molecular de los análogos de talidomida, así como a investigar la función fisiológica de Cereblon. Esta nueva tecnología de plataforma PROTAC puede ser muy útil para apuntar específicamente a proteínas de interés que de otro modo se consideran incontrolables. La inhibición de CRBN por sí sola no tiene actividad antitumorátuma.Sin embargo, los degradantes del CRBN pueden tener implicaciones clínicas en la obesidad, enfermedades infecciosas y otros trastornos. La síntesis es desafiante y es difícil encontrar enlaces y unión óptimos para generar degradadores de proteínas eficaces al diseñar un compuesto PROTAC. Para empezar, coloque 2,46 gramos de L-glutamina protegida por boc y 50 mililitros de tetrahidrofurano en un matraz de fondo redondo de 100 mililitros, y revuelva a 800 rpm durante un minuto.A continuación, añadir 1,95 gramos de 1, 1'carbonyldiimidazol y una cantidad catalítica de 4-piridina. Continúe revolviendo durante 10 horas al reflujo para obtener una solución transparente e incolora de compuesto de glutrimida. Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente y retire el disolvente con un evaporador rotatorio.Redissolve el residuo en 200 mililitros de acetato de etilo y vierta en un embudo separador. Lavar la capa orgánica con 50 mililitros cada uno de agua desionizada y salmuera, y secar la capa orgánica sobre sulfato de sodio. La gravedad filtra la solución a través de gel de sílice para eliminar el desecante, y luego enjuagar el gel de sílice con 200 mililitros de acetato de etilo.Retire el disolvente del filtrado al vacío para obtener el Compuesto 1 como sólido incoloro. Seque el producto al vacío durante la noche antes de usarlo. A continuación, disolver 0,50 gramos de acetato de sodio en 20 mililitros de ácido acético glacial en un matraz de fondo redondo de 100 mililitros equipado con una barra de agitación.Añadir 1,25 gramos de anhídrido fluorofletólico y 1,14 gramos de glutatión y remover al reflujo durante seis horas para obtener una solución púrpura del Compuesto 3. Deje que la mezcla se enfríe a temperatura ambiente, y luego vierta en 100 mililitros de agua desionizada y revuelva durante 10 minutos para precipitar el Compuesto 3. Recoger el sólido por filtración, lavarlo con agua y éter de petróleo, y secarlo al vacío durante dos días.A continuación, coloque 0,83 gramos de Compuesto Tres y 20 mililitros de sulfóxido de dimetil seco en un matraz Schlenk de 50 mililitros y revuelva durante dos minutos. Añadir 0,22 gramos de vinculador de diamina de omega alfa Compuesto 6, y 1,05 mililitros de N, N-diisopropylethylamine y agitar la mezcla bajo argón a 90 grados centígrados durante 18 horas para obtener Homodimer 8 en una mezcla verde oscuro. Dejar enfriar la mezcla a temperatura ambiente y verter en 100 mililitros de agua desionizada.Extraiga el producto en tres porciones de 50 mililitros de acetato de etilo, combine las capas orgánicas y lávelas con 50 mililitros cada una de agua y salmuera. Seque la capa orgánica lavada sobre sulfato de sodio, filtre el desecante y retire el disolvente al vacío. Redissolve el residuo en una cantidad mínima de disolvente de cromatografía y aplíquelo a una columna de gel de sílice para su purificación.Recoger las fracciones de producto fluorescentes, combinarlas y retirar el disolvente para obtener el Homodimer 8 como un sólido amarillo. Para empezar, disolver 2,28 gramos de glutrimida 1 en 25 mililitros de dimetilformamida en un matraz de fondo redondo de 100 mililitros. Suspenda 2,76 gramos de carbonato de potasio molido en esta solución.A continuación, dibuje 0,62 mililitros de yodometano en una jeringa equipada con una aguja de calibre 20. Añade la gota de yodometano en el transcurso de 10 segundos. Tape el matraz con un tabique de goma y agregue una aguja de ventilación.Sonicar la mezcla durante dos horas a temperatura ambiente para obtener Glutarimide Compound 2. Diluir la mezcla con 50 mililitros de acetato de etilo y verter en un embudo separador. Enjuague el matraz en el embudo con otros 50 mililitros de acetato de etilo.Elaborar el producto y purificarlo con cromatografía de columna de gel de sílice para obtener Glutarimide 2 como un sólido incoloro. Compare los tiempos de retención de los compuestos de glutrimida 1 y 2 para confirmar que la metilación N tuvo éxito. Para comenzar la validación, trate las células del mieloma múltiple con los compuestos de interés.Aísle las proteínas pertinentes y prepare muestras para un análisis de Western Blot de la degradación de proteínas. A continuación, prepare un sándwich de gel para SDS-PAGE y llene el tanque tampón de ánodo con una solución de pH 8.9 tris-HCl. Cargue las muestras de proteínas en el gel y ejecútela a 70 Voltios durante 20 minutos, seguido de 115 voltios durante 150 minutos.A continuación, prepare el tampón de transferencia 1x para inmunoblotting y mueva cuidadosamente el gel de su cassette al tampón de transferencia para equilibrarlo. Hay que tener mucho cuidado cuando se quita el gel del cassette para el equilibrio, ya que puede estallar y arrugar muy rápidamente. Sumerja una membrana de difluoruro de polivinilideno de 0,45 micrómetros en metanol puro durante al menos 20 segundos para activarlo y, a continuación, sumerjala en un tampón de transferencia 1x.Deje que el gel y la membrana se equilibren durante 10 minutos. A continuación, montar el cassette Western Blotting y aplicar 180 miliamperios durante 90 minutos para transferir las proteínas a la membrana. Después, visualizar las proteínas por inmunomancha.Para evaluar los efectos sobre la viabilidad celular, primero, siembra 50.000 células de mieloma múltiple por pozo de una placa de 96 pozos en triplicado biológico. Añadir a cada pocódica 100 microlitros de medios que contengan DMSO, o un micromolar 0.1, uno o 10 de Compuesto 8, Compuesto 9 o pomalidomida. Para realizar el experimento de rescate de viabilidad celular, tratar las células con una solución nanomolar 100 de Compuesto 8 durante tres horas, antes o después de agregar una solución micromolar de pomalidomida.Incubar las células durante 24, 48 o 96 horas a 37 grados centígrados en una atmósfera de dióxido de carbono del 5%, y medir la viabilidad celular con un ensayo luminiscente. La estructura del PROTAC 8 homodimérico se confirmó con protones y RMN de carbono. ProTAC 9 heterodimérico fue sintetizado como un control negativo, como N-metilación dentro de la porción de glutatión resulta en una pérdida de Cereblon, o CRBN, capacidad de unión.El homo PROTAC 8 indujo una degradación proteosómica casi completa de CRBN con efectos mínimos en los factores de transcripción linfoide IKZF1 e IKZF3. Por el contrario, el hetero PROTAC 9 mostró un comportamiento similar a los pomalidomides. Compuesto 8 la degradación inducida de CRBN podría ser bloqueada por un inhibidor directo del proteosoma, o indirectamente bloqueada por inhibición de la netilación.Las células pretratadas con el Compuesto 8 resistieron significativamente los efectos de la pomalidomida en IKZF1 e IKZF3. La degradación inducida por el CRBN inducida por el compuesto 8 tuvo mucho menos efecto sobre la viabilidad de las células del mieloma múltiple después de 96 horas que la degradación de IKZF1 e IKZF3 del Compuesto 9 y la pomalidomida. Las células del mieloma múltiple pretratadas con el Compuesto 8 tenían una viabilidad significativamente mayor cuando se exponían a pomalidomida que las células no tratadas, lo que sugiere que el Compuesto 8 podría utilizarse para imitar la resistencia a los fármacos IMiD inmunomoduladores.Encontramos que el Compuesto 8 induce la degradación proteasomal completa de Cereblon, no tiene efectos secundarios sobre la viabilidad y proliferación celular IKZF1 e IKZF3. Extender la tecnología del proyecto a otros objetivos tiene el potencial de inactivar y rastrear proteínas relacionadas con el cáncer y otras enfermedades. Al adaptar esta técnica para otros fármacos y proteínas, se debe investigar cuidadosamente las estructuras moleculares de la droga y el objetivo proteico para elegir los enlaces y accesorios óptimos.Los IMiD no funcionarán en ratones debido a una mutación puntual en Cereblon, pero existe un modelo de ratón knock-in transgénico que se puede utilizar para estudios con animales adicionales. Como la pomalidomida es una talidomida análoga, que es altamente teratogénica, no recomendamos a las mujeres embarazadas que trabajen con estos medicamentos.

chemical-inactivation-e3-ubiquitin-ligase-cereblon-pomalidomide-based

Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

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Este protocolo tiene como objetivo establecer proteomes específicos de ubiquitina (Ub) y ubiquitinas (Ubls) con el fin de identificar alteraciones de este tipo de modificaciones post-traduccionales (PtM), asociadas a una condición específica como un tratamiento o un fenotipo.

Perfilado de Ubiquitina y Ubiquitina-como Modificaciones Post-traduccionales dependientes e Identificación de Alteraciones Significativas

Este protocolo describe la detección luminiscente cuantitativa de la cinética de degradación de proteínas en células vivas que se han diseñado utilizando CRISPR / Cas9 para expresar la etiqueta de detección de proteínas endógenas libres de anticuerpos fusionada a una proteína diana. Se incluyen instrucciones detalladas para calcular y obtener parámetros cuantitativos de degradación, tasa, Dmax, DC 50 y Dmax50.

Perfil celular de alto rendimiento de compuestos de degradación de proteínas específicas utilizando líneas celulares HiBiT CRISPR

Aquí, describimos un bioensayo utilizando bromuro de 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) para probar oximas espirocíclicas previamente sintetizadas.

Ensayo funcionalizado de síntesis y citotoxicidad del heterociclo espirocíclico

El presente protocolo destaca un método modificado para detectar y cuantificar los enlaces cruzados ADN-proteína (DPCs) y sus modificaciones postraduccionales (PTMs), incluyendo la ubiquitilación, la SUMOilación y la ADP-ribosilación inducida por inhibidores de la topoisomerasa y por formaldehído, permitiendo así el estudio de la formación y reparación de DPCs y sus PTMs.

Detección cuantitativa de enlaces cruzados ADN-proteína y sus modificaciones postraduccionales

En este artículo se informa de la construcción de células knockout de proteína E asociada al centrómero (CENP-E) utilizando el sistema CRISPR/Cas9 y tres estrategias de cribado basadas en el fenotipo. Hemos utilizado la línea celular knockout CENP-E para establecer un enfoque novedoso para validar la especificidad y toxicidad de los inhibidores de CENP-E, que es útil para el desarrollo de fármacos y la investigación biológica.

Generación de líneas celulares knockout de proteína E CENP-E-/- asociadas al centrómero utilizando el sistema CRISPR/Cas9

En este trabajo se describen protocolos para la caracterización biofísica de la formación de complejos ternarios inducidos por quimeras dirigidas a proteólisis (PROTACS) que involucran a las ubiquitinas ligasa Von Hippel-Lindau E3 ligasa (VHL) y Cereblon (CRBN).  Los métodos biofísicos que se ilustran en este documento incluyen la resonancia de plasmones de superficie (SPR), la interferometría de biocapas (BLI) y la calorimetría de titulación isotérmica (ITC).

Desarrollo y Aplicación de Ensayos Biofísicos para la Evaluación de la Formación de Complejos Ternarios Inducida por Quimeras Dirigidas a la Proteólisis (PROTACS)

Se describen detalles experimentales de la síntesis de partículas modeladas y reconfigurable de dos dimensiones (2D) precursores. Esta metodología se puede utilizar para crear las partículas en una variedad de formas, incluyendo poliedros y dispositivos de agarre en escalas de longitud que van desde el micro a escala de centímetros.

Origami Inspired autoensamblaje de partículas modeladas y Reconfigurable

Aprende a sintetizar homo-PROTACs basados en pomalidomida para inducir la degradación de la ligasa E3 Cereblon. Este método permite investigar mecanismos moleculares de análogos de talidomida con aplicaciones potenciales en obesidad y enfermedades infecciosas.

Inactivación química del E3 Ubiquitin Ligase Cereblon por Homo-PROTACs basados en Pomalidomida

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