El patrón tridimensional de biofilms de ingeniería con un Bioprinter hágalo usted mismo
16 de mayo de 2019
Este artículo describe un método para transformar una impresora 3D comercial de bajo costo en una impresora 3D bacteriana que puede facilitar la impresión de biofilms estampados. Se describen todos los aspectos necesarios de la preparación del bioprintro y la bio-tinta, así como los métodos de verificación para evaluar la formación de biofilms.
La bioimpresión 3D con bacterias es una técnica recientemente desarrollada. Este protocolo proporciona una forma fácil de construir biopelículas de ingeniería 3D impresas con bacterias. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de producir biopelículas impresas en 3D utilizando una impresora 3D casera de bajo costo.
Una posible aplicación de nuestra impresora 3D es crear biopelículas de modelos reproducibles que se pueden utilizar para desarrollar nuevas terapias antibacterianas. Nuestro enfoque de impresión 3D se puede aplicar a cualquier tipo de bacteria que sea compatible con nuestro bioenlacimiento a base de alginato. La preparación del bioenlado y de los sustratos de impresión son procedimientos bastante estándar, mientras que el proceso de impresión 3D, especialmente la calibración del eje Z es un paso crucial que requiere cierta práctica.
La calibración de la altura de acceso establecida influirá en la resolución de nuestra impresora 3D y depende en gran medida de la experiencia personal. Este procedimiento requiere ajustes manuales y es difícil describirlo en un formato escrito. Conecte una punta de pipeta de 200 microlitros a una longitud de tubería de silicona y monte la punta de la pipeta en el cabezal del extrusor de la impresora 3D como reemplazo del extrusor original.
A continuación, añadir cuatro mililitros de una solución de cloruro de calcio molar a 400 mililitros de 1%agar disuelto en caldo Luria-Bertani, y complementarlo con los antibióticos e inductores adecuados. A continuación, dispensar 20 mililitros de la solución de agar LB en cada plato Petri de 150 milímetros por 15 milímetros. Seque el plato durante 30 minutos a temperatura ambiente, con la tapa medio abierta.
Preparar una solución de alginato de sodio al 3% y calentarla hasta el punto de ebullición tres veces para esterilizar la solución. A continuación, guarde la solución estéril a cuatro grados centígrados hasta que se utilice. Para preparar el componente bacteriano del bioenlaz, las bacterias E.coli transportan plásmidos para la expresión constitutiva de la GFP en 50 mililitros de medio LB que contienen antibióticos.
Agitar el cultivo a 250 RPM y 37 grados Celsius durante la noche. Después del crecimiento nocturno del cultivo, peletizar las bacterias durante cinco minutos a 3, 220 veces la gravedad y luego eliminar el sobrenadante. Resuspender el gránulo de bacterias en 10 mililitros de medio LB, y añadir 10 mililitros de 3%alginato de sodio.
Conecte la impresora 3D a un ordenador y abra el software de impresión 3D. Haga clic en el botón Inicio de los ejes X, Y y Z para mover el cabezal de impresión a su posición inicial. Para cada impresión, coloque un sustrato de impresión preparado en una ubicación particular de la cama de impresión.
Levante el cabezal de impresión a una altura de más de 22 milímetros bajo control manual, para que no colisione con el borde de la placa Petri durante el movimiento. Coloque el cabezal de impresión sobre la parte superior de la placa y muévalo hacia abajo hasta que la punta de la pipeta entre en contacto con la superficie de impresión. Asigne esta posición del eje Z como Z1, la altura de la superficie de impresión.
A continuación, levante el cabezal de impresión y muévalo manualmente fuera del área de la placa. Si la distancia de trabajo entre el cabezal de impresión y la superficie de la placa se define como Z2, introduzca la altura de la superficie de impresión más la distancia de trabajo en el programa de impresión como el valor Z durante la impresión. Cargue un archivo de código G preprogramado que contenga comandos para imprimir la forma deseada.
En cada línea de comando, la posición del cabezal de impresión se puede cambiar en los ejes X, Y y Z. Asegúrese de introducir el valor Z durante todos los pasos de impresión como la altura de la superficie de impresión más la distancia de trabajo. Cargue el bioenergiente líquido en jeringas y móntelo en la bomba de jeringa de la bioimpresora 3D.
A continuación, establezca la velocidad de extrusión en 0,3 mililitros por hora. Imprima el bioenlaciente en el sustrato de impresión haciendo clic en el botón Imprimir. Espere a encender la bomba de la jeringa hasta que haya comenzado la impresión y antes de que el cabezal de impresión entre en contacto con la superficie de impresión.
Durante la impresión, controle el movimiento del cabezal de impresión por completo mediante el software. Detenga la bomba de la jeringa tan pronto como el cabezal de impresión llegue al último punto de impresión, de lo contrario el exceso de bioenlaces caerá sobre el sustrato de impresión y reducirá la resolución de impresión. Para la construcción de estructuras 3D, todos los movimientos del cabezal de impresión se controlan en el editor de código G.
Para aumentar la altura de impresión de la segunda capa, escriba la altura de impresión de la primera capa y aumente el valor Z en el código en 0,2 milímetros. A partir de entonces, aumente el valor Z en 0,1 milímetros, cuando se mueva a una capa superior. Incubar las muestras impresas a temperatura ambiente durante tres a seis días para permitir la producción de los componentes del biofilm como las fibras Curli.
A continuación, coloque la placa en un escáner fluorescente e imagine las placas. Para disolver la matriz de alginato, agregue 20 mililitros de una solución de citrato sódico molar de 0,5 al pH 7, al sustrato impreso. Incubar la placa a temperatura ambiente durante dos horas mientras se agita a 30 rpm.
A continuación, deseche el líquido e vuelva a poner la imagen de las placas, para compararlas con las imágenes de las placas antes y después del tratamiento con citrato. La bioimpresora 3D puede crear bacterias encapsulando hidrogeles en una variedad de formas bidimensionales y tridimensionales. Estas formas impresas se pueden utilizar para evaluar si la formación de biopelícula fue exitosa o si la matriz de alginato se disuelve completamente utilizando una solución de citrato de sodio.
En el caso del bioenergía sin el plásmido de producción inducible Curli, el patrón impreso se disolvió por completo después del tratamiento del citrato de sodio, lo que significa que no se había formado ninguna red Curli de biopelícula. Las bacterias que contenían el plásmido de producción Inducible Curli no se disolvieron después del tratamiento de citrato de sodio, lo que indica que las bacterias impresas fueron capaces de formar una red Curli lo suficientemente extensa como para estabilizar el patrón impreso de bacterias. Para construir estructuras de varias capas, se pueden imprimir capas adicionales controlando el editor de código G.
El aumento del número de capas impresas en una muestra hizo que el ancho y la altura de las estructuras impresas aumentaran incrementalmente. Cuando E.coli diseñó para producir induciblemente proteínas Curli se imprimieron en estructuras multicapa, el tratamiento de citrato de sodio no disuelvió las muestras, mientras que las estructuras multicapa que contenían E.coli no produce Curli se disolvieron. Las partes más críticas del procedimiento de impresión 3D son la calibración del eje Z y la coordinación de iniciar la impresión e iniciar la bomba de la jeringa.
El bioencáner desarrollado para este proceso es bastante suave, con baja tenacidad. Se podrían hacer más modificaciones en el bioenlado, con el fin de proporcionar y mejorar la estabilidad mecánica. Esta técnica de impresión 3D permite la producción de biopelículas con excelentes propiedades mecánicas, lo que puede permitir la fabricación de materiales biomiméticos.
Cuando manipule estas bacterias, use una protección adecuada, como guantes.
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Descripción general
Este artículo presenta un método para transformar una impresora 3D comercial de bajo costo en una impresora bacteriana 3D capaz de imprimir biopelículas estructuradas. Se detallan la preparación de la bioprintora, la bio-tinta y los métodos de verificación para evaluar la formación de biopelículas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Impresión biológica 3D
- Microbiología
- Bioingeniería
Antecedentes
- La bioprintación 3D con bacterias es una técnica emergente.
- Este método permite la construcción de biofilms diseñados.
- Utiliza una impresora 3D casera de bajo costo.
- Las aplicaciones incluyen el desarrollo de nuevas terapias antibacterianas.
Objetivo del estudio
- Crear biofilms modelo reproducibles.
- Facilitar el desarrollo de terapias antibacterianas.
- Demostrar la versatilidad de la impresión 3D con diversas bacterias compatibles.
Métodos Utilizados
- Preparación de bioink a base de alginato.
- Calibración del eje Z de la impresora 3D.
- Procedimientos estándar para la impresión de sustratos.
- Métodos de verificación para la formación de biopelículas.
Resultados principales
- Impresión exitosa de biopelículas con patrón definido.
- Compatibilidad demostrada con diversas bacterias.
- Establecimiento de la reproducibilidad de biopelículas modelo.
- Ofrecimiento de una solución rentable para la ingeniería de biopelículas.
Conclusiones
- El método mejora el acceso a la tecnología de bioprintado 3D.
- Abre nuevas vías para la investigación en terapias antibacterianas.
- Se recomienda una mayor optimización del proceso de impresión.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite sistemas modelo de biopelículas reproducibles y modificables para el desarrollo de terapias antibacterianas y aplicaciones ambientales. Al proporcionar una plataforma accesible y de bajo costo para la fabricación de biopelículas con control espacial, apoya la validación temprana de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en las etapas iniciales del descubrimiento de antimicrobianos. El enfoque facilita una confianza predictiva en los mecanismos relacionados con biopelículas sin requerir infraestructura especializada en bioprinting.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar los mecanismos de formación de biopelículas mediante la expresión inducible de proteínas de la matriz como la curli.
- Valor operativo: Facilita la comprobación de hipótesis sobre factores genéticos y ambientales que influyen en la estabilidad de la biopelícula y en la resistencia a antibióticos.
- Valor predictivo: Proporciona un resultado cuantificable de biopelícula mediante la resistencia a la disolución con citrato de sodio, lo que permite tomar decisiones de avance o no sobre las vías diana.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera sustratos estandarizados y con patrones espaciales de biopelículas para ensayos consistentes frente a fenotipos asociados a biopelículas.
- Valor operativo: Utiliza un biotinta a base de alginato compatible con diversas bacterias, lo que permite adaptar el ensayo a distintas cepas diana sin necesidad de reformulación.
- Escalabilidad: Permite la producción de estructuras multicapa mediante ajustes incrementales en el eje Z, facilitando formatos de ensayo de respuesta a dosis y de evolución temporal.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor traslacional: Produce modelos de biopelículas que imitan la resistencia a antibióticos mediada por la matriz extracelular, relevantes para pruebas preclínicas de eficacia.
- Reducción de riesgos mecanicistas: Permite la visualización de componentes de la biopelícula (por ejemplo, fibras de curli) mediante imágenes de fluorescencia antes y después de la disolución de la matriz, confirmando la interacción con el blanco.
- Continuidad: Facilita la transición desde la modelización de biopelículas a escala de descubrimiento hasta la evaluación preclínica de agentes antibiofilm.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se encaja dentro del continuo de descubrimiento que va desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la optimización de compuestos líderes, particularmente para programas antimicrobianos centrados en la tolerancia asociada a biopelículas.
- Biología del Descubrimiento: Evalúa hipótesis terapéuticas mediante la creación de cepas deficientes en biopelícula y la evaluación de la integridad estructural tras el tratamiento.
- Tamizaje: Proporciona formatos reproducibles de biopelícula con lecturas cuantificables (por ejemplo, fluorescencia, resistencia a la disolución) para la evaluación de compuestos de alto contenido.
- Análisis: Permite comparar la formación de biopelículas bajo distintas condiciones mediante imágenes y extracción bioquímica, apoyando la priorización basada en datos.
- Investigación Traducional: Conecta modelos in vitro de biopelícula con la validación preclínica al demostrar resistencia fenotípica dependiente de la matriz.
- Reutilización Empresarial: Representa una plataforma modular y adaptable aplicable a diversos objetivos bacterianos y a indicaciones relacionadas con biopelículas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en la formación de biopelículas al vincular la inducción genética con la producción de matriz y la estabilidad estructural.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante la preparación estandarizada de bioink e impresión calibrada en el eje Z, minimizando la variabilidad entre experimentos.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la generación de modelos de biopelículas en impresoras de bajo costo modificadas de uso general.
- Impacto en la cartera: Apoya el avance ajustado al riesgo al identificar compuestos que interrumpen la matriz de la biopelícula sin afectar el crecimiento planctónico.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia microbiológica para la preparación estéril del bioink y el manejo bacteriano bajo pautas de bioseguridad.
- Depende de la calibración precisa del eje Z y de la sincronización del movimiento del cabezal de impresión con la extrusión de la bomba de jeringa para mantener la resolución.
- Exige la normalización de la preparación del sustrato (por ejemplo, placas de agar con cloruro de calcio) y del momento de inducción para lograr una expresión consistente de proteínas en biopelículas.
- La adaptación a cepas bacterianas alternativas puede requerir la optimización de la concentración del inductor y de la concentración de alginato para garantizar viabilidad e imprimibilidad.
- Las limitaciones prácticas incluyen la blandura del bioink y su baja tenacidad, lo que puede restringir las aplicaciones de pruebas mecánicas sin un mayor reticulado o modificación del polímero.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Title
1:16
3D Printer and Substrate Preparation
2:00
Bio-ink Preparation
3:04
3D Printing Process
5:40
Growing and Testing the Effectiveness of Biofilm Production by E. coli
6:28
Results: Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms
7:50
Conclusion
