Name: El patrón tridimensional de biofilms de ingeniería con un Bioprinter hágalo usted mismo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Aprende a construir biofilms impresos en 3D con bacterias usando una impresora casera de bajo costo. Este método permite crear modelos reproducibles para desarrollar nuevas terapias antibacterianas.

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Este trabajo fue apoyado por una subvención AOARD (no. FA2386-18-1-4059), la Organización Neerlandesa de investigación científica (NWO/OCW) como parte del programa Frontiers of Nanoscience, y el programa de materiales avanzados NWO-NSFC (núm. 729.001.016). Los autores reconocen la asistencia de laboratorio de Ramon van der Valk y Roland Kieffer.

1. conversión de una impresora 3D comercial en un bioprintro 3D
<ol><li>Extraiga el extrusor y el calentador de una impresora 3D comercial (tabla de materiales) del bastidor de la impresora y desenchufe el cableado que controla estos elementos de la placa de circuito principal (figura 1A). Dado que el sensor que controla la temperatura operativa de la impresora debe ser funcional para comunicarse con el software de la impresora, quite del software de impresión el algoritmo que retrasa la impresión hasta que se alcance la temperatura operativa.</li>
	<li>Conectar una punta de pipetas (200 μL de punta) mediante tubería de silicio (diámetro interior de 1 mm) a una jeringa de 5 mL cargada en una bomba de jeringa. Monte la punta de la Piera en el cabezal de la extrusora de la impresora 3D como reemplazo para el extrusor original (figura 1B).</li>
	<li>Si se va a utilizar más de un tipo de bio-tinta, Monte los sistemas de tuberías adicionales y las puntas de pipetas a la impresora.</li>
</ol>2. preparación del sustrato para la impresión 3D
<ol><li>Añadir 4 mL de 5 M de solución CaCl2 a 400 ml de agar 1% p/v disuelto en medio de caldo Luria-BERTANI (lb), complementado con antibióticos e inductores apropiados (aquí 34 μg/ml de cloranfenicol y 0,5% de Rhamnose).</li>
	<li>Dispense 20 mL de la solución LB-agar en cada plato de Petri de 150 mm x 15 mm. Secar 30 min a temperatura ambiente con la tapa semiabierta. Nota: el protocolo se puede pausar aquí almacenando estos sustratos de impresión a 4 ° c durante varios días.</li>
</ol>3. preparación de la bio-tinta
<ol><li>Prepare una solución de alginato sódico (3% p/v) y caliente el punto de ebullición tres veces para esterilizar la solución. Conservar a 4 ° c hasta que se utilice.</li>
	<li>Crecer E. coli MG1655 Pro Δcsga ompR234 (e. coli δcsga) bacterias que transportan plásmidos pSB1C3-proteína fluorescente verde (GFP) (expresión GFP constitutiva)2 o PSB1C3-GFP-csga (expresión GFP constitutiva, Rhamnose-inducible csga expresión) durante la noche a 37 ° c con agitación a 250 rpm en 50 mL de medio LB que contiene 34 μg/mL de cloranfenicol y 0,5% de Rhamnose.</li>
	<li>Centrifugar el cultivo celular durante 5 min a 3.220 x g para pellets de las bacterias. Retire el sobrenadante.</li>
	<li>Vuelva a suspender el pellet de bacterias en 10 mL de medio LB y añada 10 mL de alginato sódico (3% p/v).</li>
</ol>4. proceso de impresión 3D
<ol><li>Instale y abra el software de impresión 3D (tabla de materiales) en un ordenador. Conecte la impresora 3D al ordenador. Mueva el cabezal de impresión a su posición de inicio haciendo clic en el botón de inicio para los ejes X, y y Z.</li>
	<li>Para cada impresión, coloque un sustrato de impresión preparado en una ubicación particular en la cama de impresión.</li>
	<li>Calibrar la altura del cabezal de impresión en el eje Z.<ol>
<li>Levante el cabezal de impresión a una altura de 22 mm bajo control manual, de modo que no colisionará con el borde de la placa de Petri cuando se mueva a la posición deseada. Coloque el cabezal de impresión en la parte superior de la placa y muévase hacia abajo hasta que la punta de la Piera se contacto con la superficie de impresión. Asigne esta posición del eje Z como Z1 (la altura de la superficie de impresión).</li>
		<li>Levante el cabezal de impresión y muévase fuera del área de la placa mediante control manual en los ejes X, y y Z. Si la distancia de trabajo entre el cabezal de impresión y la superficie de la placa se define como Z2, introduzca Z1 + Z2 en el programa de impresión como valor Z durante la impresión.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Programa la forma de impresión mediante un método de coordenadas punto a punto autodesarrollado según la trayectoria deseada.<ol>
<li>Si la trayectoria deseada es una línea recta, defina sólo los puntos inicial y final. Incluir puntos adicionales en las líneas curvas resultará en curvas más suaves. Mueva el cabezal de impresión manualmente a cada punto secuencialmente y registre las coordenadas de estos puntos en orden. Introduzca todas estas coordenadas, así como la velocidad de movimiento del cabezal de impresión para cada segmento impreso en el editor de G-Code.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tanto antes como después de imprimir, levante el cabezal de impresión a una distancia superior al borde de la placa (20 mm) y muévase directamente fuera de la región de la placa. Guarde este programa como un archivo de código G y cargue directamente para su uso en impresiones posteriores, mientras se vuelve a medir la altura del eje Z para cada nuevo sustrato de impresión. Nota: Consulte la tabla 1 para ver un ejemplo de código G para imprimir un cuadrado.</li>
	<li>Cargue el archivo de código G preprogramado. Abra el editor de G-Code en el software y programa en los comandos para imprimir la forma deseada. En cada línea de comando, la posición del cabezal de impresión puede cambiarse en los ejes X, y y/o Z. Introduzca el valor Z durante todos los pasos de impresión como Z1 + Z2 (altura de la superficie de impresión + distancia de trabajo). Nota: la velocidad de movimiento también es ajustable; 9.000 mm/min es un valor adecuado para las tasas de impresión típicas.</li>
	<li>Cargue la bio-tinta líquida en la jeringa (s) y móntela en la (s) bomba (es) de la jeringa del bioprintro 3D.</li>
	<li>Imprima la tinta biológica en el sustrato de impresión haciendo clic en el botón Imprimir .</li>
	<li>Durante la impresión, controle el movimiento del cabezal completamente por el software. Inicie manualmente la bomba de la jeringa antes de que el cabezal de impresión entre en contacto con la superficie. Nota: la coordinación de la bomba de jeringa y de la impresora se determina empíricamente en función de la velocidad de extrusión, la velocidad a la que el cabezal de impresión se desplaza hasta el primer punto y la posición inicial del cabezal. Si la posición inicial del cabezal de impresión es de 20 mm, con una velocidad de cabezal de impresión de 9.000 mm/min y una velocidad de extrusión de 0,1 mL/h, inicie la bomba de jeringa inmediatamente después de iniciar la impresión. Si se cambia la velocidad de extrusión de 0,1 mL/h a 0,3 mL/h, espere 2 − 3 s para iniciar la bomba de jeringa una vez iniciada la impresión.</li>
	<li>Detenga la bomba de la jeringa tan pronto como el cabezal llegue al último punto de impresión. Detenga la bomba de la jeringa antes de que el cabezal se levante al final del proceso de impresión, de lo contrario, el exceso de tinta biológica caerá sobre el sustrato de impresión y reducirá la resolución de impresión.</li>
	<li>Para la construcción de estructuras 3D, controle todos los movimientos del cabezal de impresión en el editor de G-Code. Escriba la altura de impresión de la primera capa. Aumente el valor Z en el código G en 0,2 milímetros para que la segunda capa aumente la altura de impresión. A partir de entonces, aumente el valor Z en 0,1 milímetros cuando se mueva a una capa superior. No mueva la placa durante el proceso de impresión.</li>
	<li>Para medir la anchura y la altura del hidrogel impreso, utilice una regla de acero colocada debajo o junto a la muestra.</li>
</ol>5. aumentar y probar la efectividad de la producción de biofilm por E. coli
<ol><li>Incubar las muestras impresas a temperatura ambiente durante 3 − 6 días para permitir la producción de componentes de biofilm (fibras de curli). Imagen de las placas utilizando una cámara o un escáner fluorescente.</li>
	<li>Para disolver la matriz de alginato, añadir 20 mL de solución de citrato sódico de 0,5 M (pH = 7 ajustado con NaOH) a los sustratos de impresión e incubar durante 2 h con 30 RPM temblando a temperatura ambiente. Desechar el líquido y la imagen de las placas de nuevo para comparar con las imágenes de las placas antes del tratamiento con citrato.</li>
</ol>

<ol><li>Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+material+design+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Progress in material design for biomedical applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14444-14451 (2015).</li>
<li>Schmieden, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+of+Patterned%2C+Engineered+E.+coli+Biofilms+with+a+Low-Cost+3D+Printer%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1328-1337 (2018).</li>
<li>Mao, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+nacre+by+predesigned+matrix-directed+mineralization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization.</a> Science. 354 (6308), 107-110 (2016).</li>
<li>Gao, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+production+of+bulk+artificial+nacre+with+excellent+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties.</a> Nature Communications. 8 (1), 287(2017).</li>
<li>Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Polyhydroxyalkanoates%2C+a+Family+of+Biodegradable+Plastics+and+Elastomers%2C+in+Bacteria+and+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants.</a> Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).</li>
<li>Choi, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+fermentative+production+of+poly%28lactate-co-glycolate%29+from+carbohydrates+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli.</a> Nature Biotechnology. 34 (4), 435-440 (2016).</li>
<li>Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligning+cellulose+nanofibril+dispersions+for+tougher+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11860(2017).</li>
<li>Jonkers, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria-based+self-healing+concrete%5BTitle%5D)+AND+%22Heron%22%5BJournal%5D)">Bacteria-based self-healing concrete.</a> Heron. 56 (1/2), (2011).</li>
<li>Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+bacteria+to+make+improved%2C+nacre-inspired+materials%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Advances%22%5BJournal%5D)">Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials.</a> MRS Advances. 1 (8), 559-564 (2016).</li>
<li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+underwater+adhesives+made+by+self-assembling+multi-protein+nanofibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres.</a> Nature Nanotechnology. 9 (10), 858-866 (2014).</li>
<li>Chen, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+patterning+of+tunable+multiscale+materials+with+engineered+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells.</a> Nature Materials. 13 (5), 515-523 (2014).</li>
<li>Gatenholm, P., Klemm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Nanocellulose+as+a+Renewable+Material+for+Biomedical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications.</a> MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).</li>
<li>Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructured+bacterial+materials+for+innovative+medicines%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Nanostructured bacterial materials for innovative medicines.</a> Trends in Microbiology. 18 (9), 423-430 (2010).</li>
<li>Hung, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+biofilms+have+an+organized+and+complex+extracellular+matrix+structure%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure.</a> MBio. 4 (5), (2013).</li>
<li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+Survival+Mechanisms+of+Clinically+Relevant+Microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).</li>
<li>Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+combating+bacterial+biofilm+infections%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oral+Science%22%5BJournal%5D)">Strategies for combating bacterial biofilm infections.</a> International Journal of Oral Science. 7 (1), 1-7 (2015).</li>
<li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+heterogeneity+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li>
<li>Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curli+Fibers+Are+Required+for+Development+of+Biofilm+Architecture+in+Escherichia+coli+K-12+and+Enhance+Bacterial+Adherence+to+Human+Uroepithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Curli Fibers Are Required for Development of Biofilm Architecture in Escherichia coli K-12 and Enhance Bacterial Adherence to Human Uroepithelial Cells.</a> Microbiology and Immunology. 49 (9), 875-884 (2005).</li>
<li>Cranford, S., Buehler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materiomics%3A+biological+protein+materials%2C+from+nano+to+macro%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%2C+Science+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Materiomics: biological protein materials, from nano to macro.</a> Nanotechnology, Science and Applications. 3, 127-148 (2010).</li>
<li>Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Straightforward+Approach+for+3D+Bacterial+Printing%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">A Straightforward Approach for 3D Bacterial Printing.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).</li>
<li>Wang, X., Smith, D. R., Jones, J. W., Chapman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+polymerization+of+a+functional+Escherichia+coli+amyloid+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In vitro polymerization of a functional Escherichia coli amyloid protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (6), 3713-3719 (2007).</li>
<li>Hammar, M., Bian, Z., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleator-dependent+intercellular+assembly+of+adhesive+curli+organelles+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6562-6566 (1996).</li>
<li>Huang, Y. J., Xia, A. G., Yang, G., Jin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+Living+Biofilms+through+Optogenetic+Manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).</li>
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<li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+heterogeneity+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li>
<li>Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healthcare-associated+infections%2C+medical+devices+and+biofilms%3A+risk%2C+tolerance+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control.</a> Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo presentado aquí para la impresión 3D de biofilms de ingeniería tiene dos pasos críticos. En primer lugar, la preparación de la superficie de impresión de agar, que es el factor más crítico para producir una resolución de impresión específica. Es importante asegurarse de que la superficie de impresión sea plana y de que la punta de la Piera del cabezal esté colocada a la altura correcta de la superficie. Si la superficie no es plana, la distancia de trabajo cambiará durante el proceso de impresión. Si la dist...

Actualmente existe una creciente necesidad de desarrollar soluciones sostenibles y respetuosas con el medio ambiente para la producción de materiales con patrones espacialmente, debido al creciente número de mercados para dichos materiales1. Este artículo presenta un método sencillo y económico para la producción de estos materiales y, por lo tanto, ofrece un amplio espectro de aplicaciones futuras. El método que se presenta aquí permite la impresión tridimensional (3D) de estructuras con patrones espacialmente utilizando un bio-Ink que contiene bacterias vivas. Las bacterias permanecen viables dentro de las estructuras impresas durante más de una semana, lo que permite a las bacterias realizar actividades metabólicas naturales o diseñadas. Por lo tanto, las bacterias impresas pueden producir y depositar los componentes deseados dentro de la estructura impresa, por ejemplo, creando un biofilm cruzado funcional2.
Los métodos tradicionales para la producción de materiales avanzados implican gastos de alta energía (por ejemplo, altas temperaturas y/o presiones) y pueden producir grandes cantidades de desechos químicos, a menudo sustancias tóxicas que requieren una utilización de gran costo3 ,4. En contraste, múltiples especies bacterianas son capaces de producir materiales que pueden ser fácilmente aplicables en diversas industrias. Estos materiales incluyen polímeros tales como polihidroxialcananatos (PHA)5 o poli (glicolide-Co-lactida) (PGLA)6, celulosa bacteriana7, materiales de hormigón bacteriano8, compuestos biomiméticos9, adhesivos a base de amiloides10, o interruptores eléctricos de base biológica11, entre otros. Por otra parte, la producción bacteriana de materiales valiosos normalmente tiene lugar a temperaturas y presiones casi ambientales y en ambientes acuosos, sin necesidad de producir compuestos tóxicos. Mientras que la producción de materiales con bacterias se ha demostrado en la literatura y algunas aplicaciones industriales ya han surgido12,13, un método confiable para el patrón espacial de estos materiales sigue siendo un desafío.
Este artículo muestra un método sencillo de convertir una impresora 3D comercial de bajo costo en una impresora bacteriana 3D. El protocolo muestra cómo preparar una bio-tinta que contiene y sostener las bacterias vivas, así como la forma de preparar sustratos sobre los que se puede realizar la impresión 3D. Este método es apropiado para usar con una variedad de cepas bacterianas naturales y diseñadas capaces de producir materiales. Estas bacterias pueden distribuirse espacialmente dentro de una estructura impresa en 3D y continuar con su actividad metabólica, lo que resultará en una distribución espacial de los materiales deseados producidos por las bacterias.
Este método de impresión permite la fabricación aditiva de biofilms, agregados de bacterias rodeadas por una matriz extracelular autoproducida. Las biofilms son redes 3D heterogéneas en las que las proteínas, los polímeros, las células bacterianas, el oxígeno y los nutrientes se estructuran espacialmente14. Mientras que en la forma de un biofilm, las bacterias exhiben una mayor resistencia a los antibióticos y robustez estructural, haciéndolos difíciles de erradicar de las superficies incluyendo catéteres médicos e implantes. La clave de las propiedades de biofilm, y también el mayor desafío a la investigación de biofilm, parece ser la heterogeneidad de biofilms15,16,17. La producción de biofilms de modelo controlados espacialmente es de especial interés, ya que permitiría reproducir o ajustar los patrones espaciales de los componentes de biofilm, ayudando a la comprensión de la deposición estable de biofilms en prácticamente cualquier superficie en naturaleza.
Este artículo presenta un método para la producción de biofilms utilizando hidrogeles impresos en 3D que contienen bacterias de E. coli diseñadas que producen proteínas de biofilm en presencia de un inductor, así como métodos de verificación de la formación de biofilm2 . Los principales componentes de la matriz extracelular de estos biofilms son las fibras de curli amiloide18 que contienen proteínas csga autoensambladas. Cuando las bacterias de E. coli diseñadas se inducen a expresar proteínas csga, forman un biofilm modelo estable que protege las células contra ser lavado fuera de la superficie de impresión. Este biofilm impreso en 3D puede controlarse espacialmente y puede servir como una herramienta de investigación útil para la investigación de la estructura de biofilm multiescala-mecánica de función o materiómica19. Estos biofilms personalizados ayudarán a la comprensión de los principios de la formación de biofilm y sus propiedades mecánicas, permitiendo una mayor investigación sobre los mecanismos de resistencia a los antibióticos entre otras aplicaciones.

<table><tbody><tr><td>Impresora 3D</td><td>CoLiDo</td><td>3D-P Kit</td><td></td></tr><tr><td>Software de impresión 3D</td><td>CoLiDo</td><td>Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05040</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 dihidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3886.1</td><td></td></tr><tr><td>LB caldo en polvo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td>Modelo 3500</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>VWR</td><td>25384-326</td><td>150 x 15 mm</td></tr><tr><td>Ramnosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83650</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de silicona</td><td>VWR&nbsp;</td><td>DENE 3100103/25</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de jeringa</td><td>ProSense B.V.&nbsp;</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>Alginato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W201502</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sodio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71498</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>VWR</td><td>28244.295</td><td></td></tr></tbody></table>

el patrón tridimensional de biofilms de ingeniería con un bioprinter hágalo usted mismo

Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter

Los biofilms son agregados de bacterias incrustadas en una matriz extracelular de patrón espacialmente autoproducida. Las bacterias dentro de un biofilm desarrollan una mayor resistencia a los antibióticos, lo que plantea posibles peligros para la salud, pero también puede ser beneficioso para aplicaciones ambientales como la purificación del agua potable. El desarrollo ulterior de terapias antibacterianas y aplicaciones inspiradas en biofilm requerirá el desarrollo de métodos reproducibles e ingenierables para la creación de biopelículas. Recientemente, se ha desarrollado un novedoso método de preparación de biofilm utilizando una impresora tridimensional (3D) modificada con una tinta bacteriana. Este artículo describe los pasos necesarios para construir este biofrintro 3D eficiente y de bajo costo que ofrece múltiples aplicaciones en el procesamiento de materiales inducidos por bacterialmente. El protocolo comienza con una impresora 3D comercial adaptada en la que la extrusora ha sido reemplazada por un dispensador de bio-tinta conectado a un sistema de bomba de jeringa que permite un flujo controlable y continuo de bio-tinta. Para desarrollar una tinta biológica adecuada para la impresión de biofilm, las bacterias de Escherichia coli diseñadas se suspendieron en una solución de alginato, de modo que se solidifican en contacto con una superficie que contiene calcio. La inclusión de un producto químico inductor dentro del sustrato de impresión impulsa la expresión de las proteínas de biofilm dentro de la tinta bio impresa. Este método permite la impresión 3D de varios patrones espaciales compuestos por capas discretas de biofilms impresos. Estos biofilms controlados espacialmente pueden servir como sistemas modelo y pueden encontrar aplicaciones en múltiples campos que tienen un gran impacto en la sociedad, incluyendo la prevención de resistencia a los antibióticos o la purificación del agua potable, entre otros.

El primer paso para la impresión 3D exitosa de biofilms es convertir una impresora 3D comercial en un bioprintro. Esta conversión se logra quitando el extrusor y el calentador de la impresora, diseñado para la impresión con una tinta polimérica, y reemplazándolos con componentes apropiados para la impresión de bio-tinta que contiene bacterias vivas (figura 1A). El extrusor se sustituye por una punta de pipetas (o puntas, si se utilizarán varios bio-tintas en ...

Este artículo describe un método para transformar una impresora 3D comercial de bajo costo en una impresora 3D bacteriana que puede facilitar la impresión de biofilms estampados. Se describen todos los aspectos necesarios de la preparación del bioprintro y la bio-tinta, así como los métodos de verificación para evaluar la formación de biofilms.

El patrón tridimensional de biofilms de ingeniería con un Bioprinter hágalo usted mismo

Biofilms are aggregates of bacteria embedded in a self-produced spatially-patterned extracellular matrix. Bacteria within a biofilm develop enhanced ...

La bioimpresión 3D con bacterias es una técnica recientemente desarrollada. Este protocolo proporciona una forma fácil de construir biopelículas de ingeniería 3D impresas con bacterias. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de producir biopelículas impresas en 3D utilizando una impresora 3D casera de bajo costo.Una posible aplicación de nuestra impresora 3D es crear biopelículas de modelos reproducibles que se pueden utilizar para desarrollar nuevas terapias antibacterianas. Nuestro enfoque de impresión 3D se puede aplicar a cualquier tipo de bacteria que sea compatible con nuestro bioenlacimiento a base de alginato. La preparación del bioenlado y de los sustratos de impresión son procedimientos bastante estándar, mientras que el proceso de impresión 3D, especialmente la calibración del eje Z es un paso crucial que requiere cierta práctica.La calibración de la altura de acceso establecida influirá en la resolución de nuestra impresora 3D y depende en gran medida de la experiencia personal. Este procedimiento requiere ajustes manuales y es difícil describirlo en un formato escrito. Conecte una punta de pipeta de 200 microlitros a una longitud de tubería de silicona y monte la punta de la pipeta en el cabezal del extrusor de la impresora 3D como reemplazo del extrusor original.A continuación, añadir cuatro mililitros de una solución de cloruro de calcio molar a 400 mililitros de 1%agar disuelto en caldo Luria-Bertani, y complementarlo con los antibióticos e inductores adecuados. A continuación, dispensar 20 mililitros de la solución de agar LB en cada plato Petri de 150 milímetros por 15 milímetros. Seque el plato durante 30 minutos a temperatura ambiente, con la tapa medio abierta.Preparar una solución de alginato de sodio al 3% y calentarla hasta el punto de ebullición tres veces para esterilizar la solución. A continuación, guarde la solución estéril a cuatro grados centígrados hasta que se utilice. Para preparar el componente bacteriano del bioenlaz, las bacterias E.coli transportan plásmidos para la expresión constitutiva de la GFP en 50 mililitros de medio LB que contienen antibióticos.Agitar el cultivo a 250 RPM y 37 grados Celsius durante la noche. Después del crecimiento nocturno del cultivo, peletizar las bacterias durante cinco minutos a 3, 220 veces la gravedad y luego eliminar el sobrenadante. Resuspender el gránulo de bacterias en 10 mililitros de medio LB, y añadir 10 mililitros de 3%alginato de sodio.Conecte la impresora 3D a un ordenador y abra el software de impresión 3D. Haga clic en el botón Inicio de los ejes X, Y y Z para mover el cabezal de impresión a su posición inicial. Para cada impresión, coloque un sustrato de impresión preparado en una ubicación particular de la cama de impresión.Levante el cabezal de impresión a una altura de más de 22 milímetros bajo control manual, para que no colisione con el borde de la placa Petri durante el movimiento. Coloque el cabezal de impresión sobre la parte superior de la placa y muévalo hacia abajo hasta que la punta de la pipeta entre en contacto con la superficie de impresión. Asigne esta posición del eje Z como Z1, la altura de la superficie de impresión.A continuación, levante el cabezal de impresión y muévalo manualmente fuera del área de la placa. Si la distancia de trabajo entre el cabezal de impresión y la superficie de la placa se define como Z2, introduzca la altura de la superficie de impresión más la distancia de trabajo en el programa de impresión como el valor Z durante la impresión. Cargue un archivo de código G preprogramado que contenga comandos para imprimir la forma deseada.En cada línea de comando, la posición del cabezal de impresión se puede cambiar en los ejes X, Y y Z. Asegúrese de introducir el valor Z durante todos los pasos de impresión como la altura de la superficie de impresión más la distancia de trabajo. Cargue el bioenergiente líquido en jeringas y móntelo en la bomba de jeringa de la bioimpresora 3D.A continuación, establezca la velocidad de extrusión en 0,3 mililitros por hora. Imprima el bioenlaciente en el sustrato de impresión haciendo clic en el botón Imprimir. Espere a encender la bomba de la jeringa hasta que haya comenzado la impresión y antes de que el cabezal de impresión entre en contacto con la superficie de impresión.Durante la impresión, controle el movimiento del cabezal de impresión por completo mediante el software. Detenga la bomba de la jeringa tan pronto como el cabezal de impresión llegue al último punto de impresión, de lo contrario el exceso de bioenlaces caerá sobre el sustrato de impresión y reducirá la resolución de impresión. Para la construcción de estructuras 3D, todos los movimientos del cabezal de impresión se controlan en el editor de código G.Para aumentar la altura de impresión de la segunda capa, escriba la altura de impresión de la primera capa y aumente el valor Z en el código en 0,2 milímetros. A partir de entonces, aumente el valor Z en 0,1 milímetros, cuando se mueva a una capa superior. Incubar las muestras impresas a temperatura ambiente durante tres a seis días para permitir la producción de los componentes del biofilm como las fibras Curli.A continuación, coloque la placa en un escáner fluorescente e imagine las placas. Para disolver la matriz de alginato, agregue 20 mililitros de una solución de citrato sódico molar de 0,5 al pH 7, al sustrato impreso. Incubar la placa a temperatura ambiente durante dos horas mientras se agita a 30 rpm.A continuación, deseche el líquido e vuelva a poner la imagen de las placas, para compararlas con las imágenes de las placas antes y después del tratamiento con citrato. La bioimpresora 3D puede crear bacterias encapsulando hidrogeles en una variedad de formas bidimensionales y tridimensionales. Estas formas impresas se pueden utilizar para evaluar si la formación de biopelícula fue exitosa o si la matriz de alginato se disuelve completamente utilizando una solución de citrato de sodio.En el caso del bioenergía sin el plásmido de producción inducible Curli, el patrón impreso se disolvió por completo después del tratamiento del citrato de sodio, lo que significa que no se había formado ninguna red Curli de biopelícula. Las bacterias que contenían el plásmido de producción Inducible Curli no se disolvieron después del tratamiento de citrato de sodio, lo que indica que las bacterias impresas fueron capaces de formar una red Curli lo suficientemente extensa como para estabilizar el patrón impreso de bacterias. Para construir estructuras de varias capas, se pueden imprimir capas adicionales controlando el editor de código G.El aumento del número de capas impresas en una muestra hizo que el ancho y la altura de las estructuras impresas aumentaran incrementalmente. Cuando E.coli diseñó para producir induciblemente proteínas Curli se imprimieron en estructuras multicapa, el tratamiento de citrato de sodio no disuelvió las muestras, mientras que las estructuras multicapa que contenían E.coli no produce Curli se disolvieron. Las partes más críticas del procedimiento de impresión 3D son la calibración del eje Z y la coordinación de iniciar la impresión e iniciar la bomba de la jeringa.El bioencáner desarrollado para este proceso es bastante suave, con baja tenacidad. Se podrían hacer más modificaciones en el bioenlado, con el fin de proporcionar y mejorar la estabilidad mecánica. Esta técnica de impresión 3D permite la producción de biopelículas con excelentes propiedades mecánicas, lo que puede permitir la fabricación de materiales biomiméticos.Cuando manipule estas bacterias, use una protección adecuada, como guantes.

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Bioengineering

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