Name: Usando organoides intestinales derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos para estudiar y modificar la protección de células epiteliales contra Salmonella y otros patógenos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Aprende a usar organoides intestinales derivados de hiPSC para modelar la invasión epitelial por patógenos entéricos mediante microinyección. Este método permite estudiar interacciones huésped-patógeno con precisión.

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Este trabajo fue respaldado por la financiación de Wellcome Trust, la Fundación Gates y el centro de investigación biomédica de Cambridge. E.A.L. es un estudiante de doctorado clínico con el apoyo de Wellcome Trust.

1. culturación y Passaging de células madre pluripotentes inducidas
Nota: Todos los métodos descritos aquí utilizan líneas celulares humanas disponibles comercialmente. Todo el trabajo de cultivo de tejidos detallado a continuación se debe hacer en una campana de flujo laminar de clase II. los IPSC se mantienen rutinariamente en el medio de cultivo de células madre (véase la tabla de materiales), según las instrucciones del fabricante, lo que permite una cultura de iPSCs sin fin de semana. los IPSC se pueden adaptar de otros sistemas de cultivo de la IPCS con relativa facilidad.
<ol><li>Pasaje de las células una vez que las colonias cubren aproximadamente 80% – 90% de la superficie de la placa.</li>
	<li>Preparar las placas para el pasaje 1 h antes de su uso añadiendo vitronectina 10 μg/mL diluido en la solución salina de Dulbecco con tampón de fosfato (DPBS; sin calcio [ca] o magnesio [mg]) a placas tratadas con cultivo de tejido. Los volúmenes de recubrimiento dependen del tamaño de la placa y se pueden encontrar en las instrucciones del fabricante. Durante este tiempo, cultivo de células madre caliente medio a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Retire los soportes de los iPSCs listos para el paso y lave las celdas 2x con DPBS (sin CA o mg).</li>
	<li>Agregue la solución EDTA (consulte la tabla de materiales) a las placas, asegurándose de que toda la superficie esté recubierta e incube en RT durante 5 – 8 min. Cuando los agujeros empiezan a aparecer en el centro de las colonias de iPSC, aspiran y desechan la solución EDTA.</li>
	<li>Añadir medio de cultivo de células madre a los pozos; desalojar los iPSCs lavando suavemente los medios sobre la superficie de la placa unas cuantas veces. Los IPSC están pasados como grumos y no como celdas individuales, así que asegúrese de que la solución EDTA no se deja encendida durante demasiado tiempo. Mueva cualquier iPSCs desalojado a un tubo cónico de 15 mL.</li>
	<li>Aspirar la vitronectina de las placas prerecubiertas y reemplazarla con medio de cultivo de células madre. Invierta la suspensión iPSC varias veces para asegurarse de que los iPSCs no se hayan asentado en la parte inferior del tubo cónico, y agregue el volumen adecuado de suspensión para dar una dilución 1:10 de las células en una placa nueva. Las proporciones divididas pueden ajustarse en función de la tasa de crecimiento de la iPSC, que puede variar entre líneas iPSC.</li>
	<li>Rocía el plato para dispersar los IPSC sobre la superficie y colócalo en una incubadora a 37 ° c/5% CO2. Alimentar el iPSCs el día después de la passaging.</li>
</ol>2. diferenciación de los IPSC al hindgut
<ol><li>En el día 0, divida el iPSCs en un plato tratado con cultivo de tejido de 10 cm, prerecubierto con vitronectina como se describe en el paso 1,2, en 10 ml de medio de cultivo de células madre complementado con Activin a (10 ng/ml) + factor de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF; 12 ng/ml). Añadir los factores de crecimiento a los medios directamente antes de su uso; hacerlo en todos los pasos subsiguientes.</li>
	<li>En el día 1, cambie el medio (10 ml de medio de cultivo de células madre con Activin A [10 ng/ml] + bFGF [12 ng/ml]).</li>
	<li>En el día 2, comience la diferenciación cambiando el medio a 10 ml de medio de cultivo de células madre complementado con los siguientes factores de crecimiento: Activin a (100 ng/ml), bFGF (100 ng/ml), proteína morfolgenética ósea 4 (BMP-4; 10 ng/ml), Fosfoinositol 3- inhibidor de la quinasa LY294002 (10 μM) e inhibidor de GSK3 CHIR99021 (3 μM).</li>
	<li>En el día 3, cambie el medio a 10 ml de medio de cultivo de células madre complementado con Activin a (100 ng/ml), bfgf (100 ng/ml), BMP-4 (10 ng/ml) y LY294002 (10 μm). La especificación endoderm inducida por este medio debe dar lugar a cambios visibles en la morfología de la Colonia iPSC durante las próximas 24 h.</li>
	<li>En el día 4, cambie el medio a 10 ml de medios RPMI/B27 complementados con Activin a (100 ng/ml) y bfgf (100 ng/ml). Nota: Los medios RPMI/B27 contienen 500 mL de Medio RPMI con suplemento de L-glutamina (ver tabla 1), 10 ml de un suplemento B27 (50X, libre de suero) y 5 ml de aminoácidos no esenciales. Opcional: Añadir 5 mL de penicilina-streptomicina (10.000 U/mL). Esterilizar el filtro antes de su uso.</li>
	<li>En el día 5, cambie el medio a 10 ml de medios RPMI/B-27 complementados con Activin a (50 ng/ml).</li>
	<li>En el día 6, para comenzar a hacer un patrón del endodermo posterior al intestino trasero, cambie el medio a 10 ml de Medio RPMI/B27 COMPLEMENTADO con CHIR99021 (6 μm) + ácido retinoico (3 μm).</li>
	<li>En los días 7, 8y 9, repita el paso 2,7. Durante estos pasos, las estructuras 3-D visibles del intestino trasero deben ser evidentes, cubriendo la superficie de la placa.</li>
	<li>En el día 10, inserte el intestino trasero resultante en la matriz de membrana del sótano (consulte la tabla de materiales).</li>
</ol>3. incrustación de la tripa trasera en matriz de membrana sótano
<ol><li>Componen medios de crecimiento base iHO (500 mL de medio de águila modificada de Dulbecco avanzado [DMEM]/F12, 10 mL de suplemento B27 [50X, suero libre], 5 mL de suplemento N2 [100x, suero libre], 5 mL de 1 M 4-(2-hidroxietil) -1-ácido piperazineetanosulfónico (HEPES), y 5 mL de aminoácidos no esenciales [100x]. Opcional: Añadir 5 mL de penicilina-estreptomicina [10.000 U/mL]; esterilizar el filtro antes de su uso. Véase la tabla 1).</li>
	<li>
Retire los medios de la placa posterior del intestino, y lave la placa 1X con DPBS (sin CA o mg). Añadir 5 mL de solución de colagenasa a la placa e incubar a 37 ° c durante 5 min.
	<ol>
<li>Producir solución de colagenasa añadiendo 500 mg de polvo de colagenasa IV a 400 mL de DMEM/F12 avanzada. A continuación, añadir 100 mL de recambio sérico (ver tabla de materiales), 5 ml de L-glutamina (200 mm), y 3,5 μl de 2-Mercaptoetanol, y remover la solución para mezclar. Esterilizar la solución una vez que el polvo de la colagenasa se disuelva completamente. Nota: Esto se puede almacenar a-20 ° c durante un máximo de 6 meses en alícullitas más pequeñas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inactivar la colagenasa añadiendo 5 mL de medios de crecimiento base de iHO a la placa y raspar las células del intestino trasero utilizando un raspador celular, recogiendo la suspensión del intestino posterior en un tubo cónico de 15 mL.</li>
	<li>Centrifugar a 240 x g durante 1 min y pipetear el sobrenadante.</li>
	<li>Añadir 10 mL de medio, romper el intestino trasero en trozos más pequeños por pipetear suavemente, y centrifugar de nuevo a 95 x g durante 1 min.</li>
	<li>Lave las celdas 2x en los medios de crecimiento base de iHO repitiendo el paso 3,5. Resuspenda las células en un pequeño volumen de medio de crecimiento base (~ 300 – 500 μL) y agregue alrededor de 100 μL de esta solución a 1,5 mL de matriz de membrana basal. La matriz debe permanecer en el hielo durante este tiempo, ya que comenzará a solidificar rápidamente en RT.</li>
	<li>
Configurar una placa de 24-well en un calentador de placa a 37 ° c y detectar 60 μL en un pozo de la placa de 24-well. Permita que se ajuste brevemente y Compruebe la densidad bajo un microscopio.
	<ol>
<li>Si es necesario, agregue más solución intestinal posterior a la matriz de membrana del sótano en incrementos hasta que se logre la concentración deseada, y detectar la solución en los pozos restantes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar a 37 ° c durante 10 min; a continuación, añadir 800 μL de medios de crecimiento base de iHO que contengan factores de crecimiento a cada pozo de la placa de 24-well en las siguientes concentraciones (ver tabla 1): 500 ng/ml R-spondin-1, 100 ng/ml Noggin, 100 ng/ml factor de crecimiento epidérmico (EGF), 3 μm CHIR99021, 2,5 μm prostaglandina E2, y 10 μM Y-27632 diclorhidrato monohidrato (inhibidor de la roca).</li>
	<li>
Cambie los medios de crecimiento base de la iHO cada 2 – 3 días, o inmediatamente si los medios empiezan a decolorarlos. Después de la siembra inicial en la matriz de membrana del sótano, permita que los iHOs se desarrollen durante 7 días antes de dividirlos. En el día 3 – 4, las esferas distintas deben ser visibles en la cultura.
	<ol>
<li>Para el cambio de medios por sí solo, omita Y-27632, ya que esto solo es necesario cuando se divide o se siembra.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. mantenimiento y paso de iHOs
<ol><li>Para permitir el descongelamiento gradual, coloque el volumen requerido de matriz de membrana del sótano en una cubeta de hielo cubierta a 4 ° c durante la noche, 24 h antes de la división.</li>
	<li>
Retire los medios de los iHOs y reemplácelo con 500 μL de solución de elevación celular (consulte la tabla de materiales) por pozo. Incubar a 4 ° c durante 40 – 50 min, momento en el cual los iHOs deben estar flotando en la solución.
	<ol>
<li>Opcional: utilice un sistema de imágenes en el capó para seleccionar únicamente los iHOs con la morfología deseada (consulte la tabla de materiales).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pipetear suavemente la suspensión de la solución de elevación iHO/célula en tubos cónicos de 15 mL, tratando de no romper los iHOs. Permita que el IHOs se asiente durante 3 – 5 min y extraiga el sobrenadante y las células individuales.</li>
	<li>Resuspend el iHOs en 5 mL del medio de crecimiento base de iHO y pipetee suavemente para lavar. Centrifugar a 95 x g durante 2 min.</li>
	<li>Configure una placa de 24-well en un calentador de placas a 37 ° c dentro del capó.</li>
	<li>Extraer el sobrenadante y resuspensar los iHOs en ~ 300 – 500 μL de media de crecimiento base, utilizando una Piera P1000 para descomponer los iHOs en trozos más pequeños. Tenga en cuenta que la fuerza que debe aplicarse variará dependiendo de la línea de iHO y el estado de maduración, así que empiece suavemente, aumentando la fuerza si es necesario.</li>
	<li>Colocar ~ 100 μL de los iHOs (el volumen depende de la densidad de la solución) en 1,5 mL de la matriz de membrana del sótano y pipetear brevemente para mezclar.</li>
	<li>Detectar 1 x 60 μL de matriz de membrana del sótano en un pozo de la placa de 24-Well, dejarlo solidificar para ~ 30 s, y luego comprobar la densidad bajo el microscopio. Si la densidad es demasiado baja, agregue más iHOs a la matriz.</li>
	<li>Repita el paso 4,8 hasta que se adquiera la densidad correcta y, a continuación, descubra el resto de la matriz en una placa de 24-well.</li>
	<li>Colóquelo en una incubadora a 37 ° c durante 10 min y, a continuación, superponerlo con 800 μL de medio de crecimiento base con factores de crecimiento, como se describe en el paso 3,7.</li>
	<li>
Para preparar los iHOs para un experimento de ensayo de invasión (descrito a continuación), pasar los iHOs 4 – 5 días antes del experimento como se describe en los pasos 4.1 – 4.10, pero colocar 120 μL de la solución de iHO de matriz generada en el paso 4,7 en platos de microinyección con fondo de vidrio de 5 mm.
	<ol>
<li>En lugar de dejar la suspensión de la iHO en una gota como con el paso de rutina, esparcir la gota sobre la parte inferior del plato para crear una capa delgada de matriz. Cubrir con 2,5 mL de medio de crecimiento base más factores de crecimiento. Nota: Si se han utilizado antibióticos en medio de cultivo, estos deben eliminarse y reemplazarse con medios no antibióticos suplementados para experimentos de microinyección.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. prestimulación de iHOs con rhIL-22
<ol><li>Aspire los medios de comunicación de los iHOs y reemplácelo con medios de crecimiento de base frescos (que no deben contener antibióticos) 18 h antes del ensayo de invasión.</li>
	<li>Añadir rhIL-22 a los medios de cultivo a una concentración final de 100 ng/mL.</li>
</ol>6. microinyección de los ensayos de iHOs y invasión intracelular
<ol><li>El día anterior al experimento, configure S. Typhimurium SL1344 cultivo en 10 mL de caldo Luria-Bertani e incubar a 37 ° c durante la noche con agitación.</li>
	<li>El día del experimento, si hay disponible un microscopio con una cámara de calor cerrada, enciente y permita que la temperatura llegue a 37 ° c antes de iniciar el ensayo.</li>
	<li>Diluir cultivos bacterianos durante la noche en DPBS (conteniendo CA y mg) a una densidad óptica de 2 a 600 nm (OD600) y, a continuación, mezclar 1:1 con fenol rojo.</li>
	<li>Cargue el plato de microinyección que contiene iHOs en la etapa del microscopio, quite la tapa y coloque los iHOs en foco, listos para que comience la inyección.</li>
	<li>Encienda el inyector y las estaciones de control del brazo. Asegúrese de que el inyector esté ajustado a una presión de 600 kPa y un tiempo de inyección de 0,5 s. Si aún no está retrocedido en la etapa del microscopio, gire el brazo de inyección para asegurarse de que esté.</li>
	<li>Configure una punta de perforación de microinyección de 6 μm quitando el envoltorio y el cilindro de plástico de la aguja. Retire el cabezal de agarre del brazo de inyección.</li>
	<li>Cargue la punta del taladro con 10 μL del inóbulo, agarrando la punta del taladro suavemente en su extremo romo. Coloque la punta de perforación en el cabezal de agarre y vuelva a conectarlo al brazo de microinyección.</li>
	<li>
Mueva suavemente el brazo a su posición para que la aguja esté situada a 1 – 2 cm por encima de la placa de microinyección. Utilice el control de brazo para colocar la punta de la aguja en el centro de la antena y bajarla hasta que esté justo sobre la superficie de los medios.
	<ol>
<li>Programar la estación de control de brazo para devolver la aguja a este punto después de todas las inyecciones.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enfoca el microscopio en los iHOs y selecciona el objetivo a inyectar. Coloque la aguja justo arriba y a la derecha de la iHO para inyectarse y mover la aguja hacia abajo y lateralmente en el lumen del iHO.</li>
	<li>Presione el botón inyectar en el microinyector; la mezcla bacteriana manchada de fenol emergerá de la aguja. Inyecte cada iHO 3x. Inyecte al menos 30 iHOs por condición. Nota: Debido a la heterogeneidad en el tamaño y la estructura de la iHO dentro de una cultura, es necesario inyectar un gran número de iHOs para controlar la variación.</li>
	<li>Cuando se inyecten todos los iHOs requeridos, extraiga la placa de microinyección del escenario, sustituya la tapa e incube la placa a 37 ° c durante 90 min.</li>
	<li>Después de 90 min, aspirar el medio de crecimiento y reemplazarlo con 3 mL de solución de elevación celular; incubar a 4 ° c durante 45 min.</li>
	<li>Mueva suavemente la solución de levantamiento de iHOs/célula a un tubo cónico de 15 mL que contenga 5 mL de DPBS. Asegúrese de que todos los iHOs inyectados se hayan retirado de la placa (enjuague la placa con 1 mL del DPBS si es necesario). Centrifugar a 370 x g durante 3 min.</li>
	<li>Extraer el sobrenadante y resuspensar los iHOs en medios de crecimiento base que contengan gentamicina a 0,1 mg/mL (Añadir 1 mL de media; a continuación, utilice una picada P1000 ~ 50X para romper los iHOs, y añada 4 mL de otros medios).</li>
	<li>Incubar a 37 ° c durante 1 h para matar las bacterias extracelulares.</li>
	<li>Centrifugar los iHOs a 370 x g durante 3 min y aspirar el sobrenadante, dejando lo menos posible. Lavar el iHOs 1X con DPBS y centrifugar de nuevo. Nota: Este paso elimina la gentamicina, que es importante ya que cualquier gentamicina restante puede matar las bacterias intracelulares una vez que las células son lisadas.</li>
	<li>Resuspend el iHOs en 500 μL de tampón de lisis (ver tabla de materiales) y disocie manualmente los organoides pipeteando ~ 50X. Deje esta mezcla durante 5 min en RT.</li>
	<li>Diluir en serie la solución resultante 10 veces en DPBS para generar concentracionesde 10-1, 10-2y 10-3 . Pipetear 3 x 20 μL de gotas de las soluciones ordenadas y diluidas en placas de agar LB precalentadas.</li>
	<li>Incubar durante la noche a 37 ° c y realizar el conteo de colonias y el cálculo de las unidades formadoras de colonias (CFU). Los recuentos de colonias reflejarán el número de bacterias intracelulares que se liberaron durante el proceso de alisado celular.</li>
</ol>7. congelación y recuperación de la célula
Nota: Como se indicó anteriormente, es posible preservar criogénicamente los iHOs y reconstituirlos cuando se desee. A continuación se detallan los procesos de congelación y descongelamiento.
<ol><li>Seleccione los pozos de iHOs que desea congelar. Añadir la solución de elevación celular a los pozos e incubar durante 40 – 50 min a 4 ° c. Los iHOs deben estar flotando en la solución.</li>
	<li>Pipetear suavemente los iHOs en un tubo cónico de 15 mL y dejar que se asientan. Retire los medios y lave el iHOs 1X con medios de crecimiento base (sin factores de crecimiento).</li>
	<li>
Centrifugar a 95 x g durante 2 min, retirar el sobrenadante, y reemplazarlo con un volumen adecuado de medio de congelación celular (ver la tabla de materiales; utilice el medio según las instrucciones del fabricante), decantando los ihos en viales criogénicos.
	<ol>
<li>Almacene los viales en un congelador de-80 ° c durante la noche para permitir una congelación más gradual; Luego, transfiéralos al almacenamiento de nitrógeno líquido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Para reconstituir los iHOs, descongele rápidamente un vial criogénico a 37 ° c utilizando un baño de agua/talón; a continuación, pipetear suavemente su contenido en 10 mL de medio de crecimiento base (sin factores de crecimiento). Permita que los iHOs se asientan y reemplacen los medios con ~ 300 μL de media de crecimiento de base fresca.
	<ol>
<li>NO disocie manualmente los iHOs. Añadir iHOs a la matriz de membrana del sótano y la placa de salida como se describe en la sección 3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%28%2Bve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li>
<li>Huch, M., Boj, S. F., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%28%2B%29+liver+stem+cells%2C+hepatic+organoids+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lgr5(+) liver stem cells, hepatic organoids and regenerative medicine.</a> Regenerative Medicine. 8 (4), 385-387 (2013).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Mariani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+cortical+development+in+vitro+using+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12770-12775 (2012).</li>
<li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> eLife. 4, (2015).</li>
<li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li>
<li>Matano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+colorectal+cancer+using+CRISPR-Cas9-mediated+engineering+of+human+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modeling colorectal cancer using CRISPR-Cas9-mediated engineering of human intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 21 (3), 256-262 (2015).</li>
<li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+cholangiocytes+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 33 (8), 853-861 (2015).</li>
<li>Leha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-content+platform+to+characterise+human+induced+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A high-content platform to characterise human induced pluripotent stem cell lines.</a> Methods. 96, 85-96 (2016).</li>
<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+cancer+mutations+in+cultured+human+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells.</a> Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).</li>
<li>Schreiber, F., Arasteh, J. M., Lawley, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen+Resistance+Mediated+by+IL-22+Signaling+at+the+Epithelial-Microbiota+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Pathogen Resistance Mediated by IL-22 Signaling at the Epithelial-Microbiota Interface.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3676-3682 (2015).</li>
<li>Sabat, R., Ouyang, W., Wolk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+opportunities+of+the+IL-22-IL-22R1+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Therapeutic opportunities of the IL-22-IL-22R1 system.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (1), 21-38 (2014).</li>
<li>Kotenko, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+functional+interleukin-22+%28IL-22%29+receptor+complex%3A+the+IL-10R2+chain+%28IL-10Rbeta+%29+is+a+common+chain+of+both+the+IL-10+and+IL-22+%28IL-10-related+T+cell-derived+inducible+factor%2C+IL-TIF%29+receptor+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of the functional interleukin-22 (IL-22) receptor complex: the IL-10R2 chain (IL-10Rbeta ) is a common chain of both the IL-10 and IL-22 (IL-10-related T cell-derived inducible factor, IL-TIF) receptor complexes.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2725-2732 (2001).</li>
<li>Forbester, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-22+promotes+phagolysosomal+fusion+to+induce+protection+against+Salmonella+enterica+Typhimurium+in+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Interleukin-22 promotes phagolysosomal fusion to induce protection against Salmonella enterica Typhimurium in human epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10118-10123 (2018).</li>
<li>Nozaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+with+intestinal+epithelial+organoids+allows+efficient+expansion+and+motility+analysis+of+intraepithelial+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Co-culture with intestinal epithelial organoids allows efficient expansion and motility analysis of intraepithelial lymphocytes.</a> Journal of Gastroenterology. 51 (3), 206-213 (2016).</li>
<li>Dijkstra, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Tumor-Reactive+T+Cells+by+Co-culture+of+Peripheral+Blood+Lymphocytes+and+Tumor+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids.</a> Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).</li>
<li>Schlaermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+human+gastric+primary+cell+culture+system+for+modelling+Helicobacter+pylori+infection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro.</a> Gut. 65 (2), 202-213 (2016).</li>
<li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li>
<li>Saxena, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Intestinal+Enteroids%3A+a+New+Model+To+Study+Human+Rotavirus+Infection%2C+Host+Restriction%2C+and+Pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology.</a> Journal of Virology. 90 (1), 43-56 (2016).</li>
<li>Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids+model+human+responses+to+infection+by+commensal+and+Shiga+toxin+producing+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and Shiga toxin producing Escherichia coli.</a> PLOS ONE. 12 (6), e0178966(2017).</li>
<li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+Cryptosporidium+infection+in+human+small+intestinal+and+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids.</a> Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).</li>
<li>Garcez, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+impairs+growth+in+human+neurospheres+and+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids.</a> Science. 352 (6287), 816-818 (2016).</li>
<li>Forbester, J. L., Hannan, N., Vallier, L., Dougan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Intestinal+Organoids+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Use+as+an+Infection+System%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Derivation of Intestinal Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells for Use as an Infection System.</a> Methods in Molecular Biology. , (2016).</li>
<li>Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+intestinal+organoid+model+of+non-invasive+enteric+pathogen-epithelial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions.</a> Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe la diferenciación de los hiPSCs en los iHOs y su utilidad como modelo para simular infecciones entéricos. A continuación, describimos los pasos críticos en el protocolo y las modificaciones o mejoras que hemos realizado.
Este protocolo agiliza el proceso de diferenciación de los hiPSCs en comparación con el trabajo publicado anteriormente25. Los métodos utilizados anteriormente requerían la transferencia de los hiPSCs de otros sistemas de cultivo de hiPSC (por ejemplo, la cultura hiPSC dependiente del alimentador) al medio químicamente definido – alcohol polivinílico (CDM-PVA). Esta transferencia a CDM-PVA suele tardar de 2 a 3 semanas y requiere la alimentación diaria de los hiPSCs. Este protocolo tampoco fue consistentemente eficaz, con algunas diferenciaciones fallando; por lo tanto, se triplicó la diferenciación utilizando los mismos factores de crecimiento, pero comenzando con los hiPSCs cultivados en medio de cultivo de células madre (en lugar de CDM-PVA) y el reemplazo de CDM-PVA con medio de cultivo de células madre durante los días de diferenciación 0 – 3. Esto ha sido exitoso para las cinco líneas independientes de hiPSC, que hasta ahora se han triplicado, lo que hace que el proceso de diferenciación sea mucho más rápido y eficiente. Esto también permite el cultivo libre de fines de semana de los hiPSCs antes de la diferenciación, lo que permite una mayor flexibilidad en la cultura hiPSC. las líneas iHO producidas por este método han sido fenotipadas para los marcadores del epitelio intestinal como hemos descrito anteriormente para las líneas hiPSC Kolf2, Yemz1 y Lise116 y aparecen fenotípicamente indistinguibles de los ihos producidos usando el anterior Protocolo.
Después de la siembra, los iHOs requieren al menos 1 mes de paso de rutina, con la división cada 4 – 7 días para facilitar la maduración. Tenga en cuenta que habrá alguna variación en el desarrollo de la iHO dependiendo de la línea iPSC utilizada y la densidad de la cultura inicial. Durante los primeros pasajes, habrá células visiblemente contaminantes que no son iHOs. Estos eventualmente morirán, dejando una cultura limpia de esférica y, después de aproximadamente 4 semanas, iHOs en Cierva. Además, se puede utilizar un sistema de imagen en el capó para seleccionar y pasar únicamente los iHOs con la morfología deseada. A medida que los iHOs maduran, requerirán la división cada 6 – 7 días, dependiendo de la tasa de crecimiento y la densidad. Si ocurre cualquiera de los siguientes, los iHOs deben dividirse antes de este punto: las cavidades luminales de los iHOs empiezan a llenarse con células muertas, la matriz de membrana basal comienza a desintegrarse, los iHOs empiezan a crecer fuera de la matriz de membrana del sótano, o la cultura es demasiado denso y los medios empiezan a ir de amarillo muy rápidamente.
Una vez que se establece la cultura de la iHO, si en algún momento la aparición de los iHOs cambia o es diferente de lo esperado (por ejemplo, los cultivos permanecen esféricos, en lugar de en ciernes), fenotipado a través de inmunohistoquímica y qPCR para marcadores celulares deben ser repite para asegurar que la diferenciación de los tipos celulares dentro de los iHOs (p. ej., células de Copa, células de Paneth) permanezca intacta. Si los iHOs ya no son diferenciadores, entonces deben desecharse y reconstituirse o un pasaje anterior de los iHOs debe ser descongelado y reconstituido. Si los iHOs dejan de diferenciarse, las causas potenciales son la edad de la cultura (si tiene más de 6 meses de antigüedad), la actividad de los factores de crecimiento (Asegúrese de que se reconstituyen según las instrucciones del fabricante y se mantienen congeladas en pequeñas alícullitas para evitar múltiples ciclos de congelamiento-descongelación), pasajes demasiado frecuentes o violentos (en general, el passaging sólo debe ocurrir una vez a la semana, y si los iHOs se disocian manualmente con demasiada fuerza sobre una base regular, dejarán de diferenciarse por completo).
Establecimos a través de la secuenciación de ARN que la estimulación Il-22 18 h antes de la infección estimula genes antimicrobianos y los involucrados en el fenotipo de defensa de barrera. Antes del uso de nuevo ihso para ensayos que implican prestimulación con rhil-22 (o una citoquina alternativa si el sistema se está utilizando para esto), es aconsejable comprobar la actividad de los genes que se sabe que son alza por la citoquina (en el caso de Il-22 , usamos DUOX2 y LCN2) a través de qPCR después de la estimulación de los ihos, para asegurar la expresión del receptor y la señalización intacta. Antes del primer uso de IL-22, también llevamos a cabo la inmunohistoquímica para ubicar el receptor IL-22 en iHOs para establecer que la expresión del receptor IL-22 era basal, lo que significa que la prestimulación podría lograrse simplemente agregando rhIL-22 a la cultura iHO Medio. Sin embargo, si se expresa un receptor apicamente, este protocolo puede tener que ser adaptado para entregar los ligandos apicamente.
Las trampas relacionadas con el sistema de microinyección generalmente se relacionan con la delicadeza de las agujas requeridas para la inyección. Aquí, utilizamos puntas de taladro disponibles comercialmente con un lumen de 6 μm. Es posible tirar las agujas de inyección de los capilares de vidrio26 aunque esto puede ser menos uniforme, lo que conduce a fugas de la punta de la aguja o volúmenes inconsistentes que se inyectan en los ihos. Es importante asegurarse de que la inyección ha tenido lugar en el lumen del iHO, que es una razón para el uso de rojo fenol como un tinte; los iHOs se expandirán y sostenán visiblemente el inóbulo rojo, permitiendo la certeza sobre qué iHOs han sido inyectados. Ocasionalmente las agujas se obstruyen con escombros de la pared de la iHO; Si este es el caso, quite la punta de la aguja del interior de la iHO y presione el botón Clean en el sistema de microinyección. Esto producirá un breve período de mayor presión de aire que debe despejar el bloqueo. También inducirá alguna fuga del inóbulo bacteriano en la placa; por lo tanto, si esto ocurre, la acción limpia debe repetirse en todas las placas para asegurar la igualdad de inóbulo bacteriano por placa. Una gran ventaja de los iHOs derivados de hiPSC es su tamaño. Los organoides intestinales de los ratones y los organoides humanos primarios son mucho más pequeños (miden hasta ~ 100 μm y 100 – 300 μm, respectivamente27, versus 250 – 1500 μm para los ihos derivados de hipsc), lo que significa que las inyecciones de grandes cantidades de organoides serán más lentas. Esto permite que los experimentos de inyección a mayor escala sean trialed en los iHOs derivados de hiPSC. También es posible estudiar el contenido luminal de los iHOs cosechándolos después de la infección y disociando manualmente los iHOs en DPBS, liberando su contenido luminal. Para la microinyección, recomendamos el uso de una alta concentración de bacterias. Descubrimos que las concentraciones más bajas no eran suficientes para generar una respuesta de los IECs que comprendían los iHOs. Adicionalmente, fue difícil ubicar posteriormente bacterias internalizadas usando microscopía. Los ininlums pueden tener que optimizarse para diferentes cepas bacterianas.
En Resumen, los iHOs derivados de hiPSC proporcionan un modelo prometedor para diseccionar directamente la respuesta epitelial a las infecciones entínicas, ya sea mediante el estudio de recuentos de invasiones intracelulares, imágenes, medición de los niveles de citocinas en los sobrenadantes de la iHO o ARN de recolección para estudiar los cambios transcripcionales después de la exposición a patógenos. Su utilidad será aún más evidente en el futuro para el establecimiento de modelos de infección para patógenos de restricción humana y en la explotación de las posibilidades de utilizar esta tecnología para personalizar la investigación mediante el estudio de mutaciones genéticas relacionadas con enfermedades específicas y las respuestas de medicamentos.

En los últimos años, el estudio de las interacciones huésped-patógeno se ha mejorado con el desarrollo de modelos "organoides", en los que las representaciones en 3D del epitelio intestinal se pueden producir a partir de varios progenitores. Los organoides ' primarios ' pueden generarse directamente a partir de células madre intestinales cosechadas a partir de biopsias intestinales. Además, los organoides intestinales se pueden generar a partir de los hiPSCs. Lo mismo se puede decir de numerosos tejidos, con1gástrico, hígado2, pancreático3,4, cerebro5,6, pulmón7, y la próstata8 organoides utilizados por muchos investigadores para modelar Enfermedad. Hay numerosas aplicaciones emocionantes del sistema organoide, incluyendo el modelado de cáncer9 y la detección de drogas10, pero aquí nos centramos en el uso de ihos como un modelo de infección, utilizando S. enterica serovar typhimurium (S. Typhimurium) como un patógeno ejemplar y pretratamiento con IL-22 como terapia.
En este estudio, los hiPSCs utilizados para generar iHO son IPSC ' Kolf2 ', generados a partir de un individuo sano y disponibles en el consorcio de la iniciativa de células madre pluripotentes inducidas por el ser humano (HipSci; www.hipsci.org), un panel de referencia de acceso abierto de caracterizado líneas hiPSC11. Una ventaja de usar hiPSCs como progenitores para los organoides es que ahora hay extensos bancos de líneas iPSC de donantes sanos disponibles, lo que significa que los resultados pueden validarse en un número de líneas celulares con diferentes antecedentes genéticos. Además, si los investigadores desean ver los polimorfismos de nucleótidos únicos asociados a enfermedades específicas (SNPs), es posible utilizar CRISPR/Cas9 para diseñar mutaciones en una línea celular sana, produciendo así una línea mutante y conservando la isogénica línea de control para la comparación12. En nuestra experiencia, los organoides intestinales derivados de hiPSC son de mayor tamaño que sus homólogos primarios y más consistentes en la cultura, lo que hace que una microinyección menos complicada técnicamente y permita potencialmente una gama más diversa de patógenos para ser Estudiado. los iHOs pueden ser preservados criogénicamente, y hemos propagado cultivos iHO por hasta un año para producir material para la experimentación.
In vivo, los IECs desempeñan un papel clave en la regulación de la la homeostasis intestinal y pueden inhibir directamente los patógenos, aunque los mecanismos por los que esto ocurre no se entienden bien. La citoquina IL-22 es conocida por tener un papel en el mantenimiento de la barrera epitelial intestinal13 y está implicada en la inducción y secreción de péptidos antimicrobianos y quimioquinas en respuesta a la infección14. Se produce por las células T activadas (particularmente, Th17 células), así como por el asesino natural (NK) células y se une a un receptor heterodimérico compuesto de IL-22R1 y IL-10R2 subunidades15. El receptor de IL-22 se expresa basalmente en IECs, lo que significa que en el modelo iHO, es posible pretratar los organoides con rhIL-22 simplemente por su adición al medio de cultivo16. Una desventaja del sistema organoide es que carece de la respuesta inmune asociada normalmente entregada por otros tipos de células inmunitarias; sin embargo, surgen modelos que intentan coculture organoides con linfocitos intestinales para representar mejor este17,18.
El uso del sistema de microinyección es clave para simular infecciones en el modelo iHO, ya que esto permite la entrega directa de patógenos a la superficie apical del epitelio, como ocurriría en el caso de infección in vivo. La adición de fenol rojo a la solución bacteriana inyectada en la iHO marca los que han sido infectados, evitando así inyecciones repetidas de la misma iHO. Los organoides como recipientes para el modelado de infecciones están creciendo en uso, con patógenos como Helicobacter pylori,19 el norovirus,20 el rotavirus,21 Escherichia coliproductora de toxina Shiga22, Cryptosporidium23, y el virus del Zika24 habiendo demostrado sobrevivir y replicar dentro de estos sistemas. Esta tecnología podría aplicarse a una gama más amplia de patógenos, particularmente a los organismos que son difíciles de cultivo, como los protozoos, o patógenos humanos restringidos, con el fin de obtener información directa sobre la respuesta epitelial humana a la infección.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Platos de inyección con fondo de vidrio de 5 mm</td><td>MatTek corporation</td><td>P50G-0-14-F</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 647 faloidina</td><td>Life Technologies</td><td>A22287</td><td>Uso a una concentración de 1:1.000</td></tr><tr><td>B27 suplemento sin suero</td> Life <td>Technologies</td><td>17504044</td><td>Concentración de stock 50x, concentración final 1x</td></tr><tr><td>BMP-4 proteína humana recombinante</td><td>R& D</td><td>PHC9534</td><td>Concentración de existencias 10 &mu; g/mL, concentración final 10 ng/mL</td></tr><tr><td>Solución de recuperación celular (solución de elevación celular)</td><td>BD</td><td>354253</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>ab120890-5mg Concentración de</td><td>stock 3 mM, concentración final 3 y micro; M</td></tr><tr><td>colagenasa, polvo tipo IV</td><td>Life Technologies</td><td>17104019</td><td>Reconstituir al 0,1%</td></tr><tr><td>Viales criogénicos</td><td>Corning</td><td>430487</td><td></td></tr><tr><td>Costar TC tratados con 24 placas de cultivo de pocillos</td><td>Corning</td><td>CLS3527</td><td></td></tr><tr><td>DAPI dilactato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564-10MG</td><td>Uso a una concentración de 10 nM</td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS (No MgCl2 o CaCl2)</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS (con MgCl2 y CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento epidérmico</td><td>R& D</td><td>236-EG-200 Concentración de</td><td>existencias 100 &mu; g/mL, concentración final 100 ng/mL</td></tr><tr><td>Eppendorf TransferMan NK2 (sistema de microinyección)</td><td>Eppendorf</td><td>920000011</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtojet express&nbsp; (sistema de microinyección)</td><td>Eppendorf</td><td>5248 000.017</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Flex medium kit (medio de cultivo de células madre)</td>Sistema de imagen <td>Life Technologies</td><td>A2858501</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL (sistema de imagen en el capó)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1272-10ML Concentración de</td><td>stock 10 mg/mL, concentración final 0,1 mg/mL</td></tr><tr><td>Anti-Salmonella de cabra, CSA-1</td><td>Insight Biotechnology</td><td>02-91-99</td><td>Uso a concentración 1:20</td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Life Technologies</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement (reemplazo de setrum)</td><td>Gibco</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX supplement (suplemento de glutamina</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>A2916801</td><td>Concentración de stock 200 mM, concentración final 2 mM</td></tr><tr><td>LY294002</td><td>Promega UK</td><td>V1201</td><td>Concentración de existencias 50 mM, concentración final 10&mu; M</td></tr><tr><td>Matrigel, GFR, libre de fenol (matriz de membrana basal)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminoácidos no esenciales&nbsp; solución (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>N2 suplemento sin suero</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td>Concentración de stock 100x, concentración final 1x</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140163</td><td>Concentración de stock 10.000 U/mL, concentración final 100 U/mL</td></tr><tr><td>Rojo de fenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Piezo Drill Tip Mouse ICSI, 25&deg; ángulo de punta, 6 & micro; m diámetro interior</td><td>Eppendorf</td><td>5195000087</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandina E2</td><td></td><td>Sigma P0409-1MG Concentración de</td><td>existencias 2,5 mM, concentración final 2,5 mM</td></tr><tr><td>FGF humano recombinante básico</td><td>R& D</td><td>233-FB-025 Concentración de</td><td>existencias 100 &mu; g/mL, concentración final 100 ng/mL</td></tr><tr><td>IL-22 humana recombinante</td><td>R& D</td><td>6057-NG-100 Concentración de</td><td>existencias 100 &mu; g/mL, concentración final 100 ng/mL</td></tr><tr><td>Recombinante humano Noggin</td><td>R& D</td><td>6057-NG-100 Concentración de</td><td>existencias 100 &mu; g/mL, concentración final 100 ng/mL&nbsp;</td></tr><tr><td>R-espondina humana recombinante1</td><td>R& D</td><td>4645-RS-025 Concentración de</td><td>stock 25 mg/mL, concentración final 500 ng/mL</td></tr><tr><td>Recombinante humano/ratón/rata Activina A</td><td>R& D</td><td>338-AC-050 Concentración de</td><td>existencias 100 &mu; g/mL, concentración final 100 ng/mL</td></tr><tr><td>Medio de congelación de cultivo celular de recuperación (medio de congelación celular)</td><td>Gibco</td><td>12648010</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido retinoico</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>R2625-50MG Concentración de</td><td>existencias 3 &mu; M, concentración final 3 mM</td></tr><tr><td>Medios RPMI 1640 con suplemento Glutamax (Medio RPMI con suplemento de L-glutamina)</td><td>Life Technologies</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 (tampón de lisis celular)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES9690T-A101X</td><td>Uso a una concentración del 1%</td></tr><tr><td>Versene (solución de EDTA)</td><td>Life Technologies</td><td>15040066</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectina XF</td><td>Stemcell Technologies&nbsp;</td><td>7180</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 diclorhidrato monohidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-1MG Concentración de</td><td>material 3 mM, concentración final 10 mM</td></tr></tbody></table>

usando organoides intestinales derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos para estudiar y modificar la protección de células epiteliales contra salmonella y otros patógenos

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

El sistema de ' organoides ' (iHO) intestinal, caracterizado porque las estructuras 3D representativas del revestimiento epitelial del intestino humano pueden ser producidas a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSCs) y mantenidas en la cultura, proporciona una oportunidad emocionante para facilitar el modelado de la respuesta epitelial a las infecciones entéricos. In vivo, las células epiteliales intestinales (IECs) desempeñan un papel clave en la regulación de la la homeostasis intestinal y pueden inhibir directamente los patógenos, aunque los mecanismos por los que esto ocurre no están completamente dilucidados. La citocina interleucina-22 (IL-22) ha demostrado desempeñar un papel en el mantenimiento y la defensa de la barrera epitelial intestinal, incluyendo la inducción de una liberación de péptidos antimicrobianos y quimioquinas en respuesta a la infección.
Describimos la diferenciación de los hiPSCs de control saludable en iHOs a través de la adición de combinaciones de citoquinas específicas a su medio de cultivo antes de incrustarlas en un sistema de cultivo prointestinal basado en matriz de membrana sótano. Una vez incrustados, los iHOs se cultivan en medios complementados con Noggin, R-spondin-1, factor de crecimiento epidérmico (EGF), CHIR99021, prostaglandina E2, y diclorhidrato de Y-27632 monohidrato. Pasajes semanales por alteración manual de la ultrestructure iHO conducen a la formación de iHOs en Cierva, con algunos exhibiendo una estructura de cripta/vellosidades. Todos los iHOs demuestran un epitelio diferenciado compuesto por células de Copa, células enteroendocrinas, células de Paneth y enterocitos polarizados, que pueden confirmarse mediante inmunostenciamiento para marcadores específicos de cada subconjunto de células, microscopía electrónica de transmisión (TEM) y PCR cuantitativa (qPCR). Para modelar la infección, Salmonella enterica serovar typhimurium SL1344 se microinyecta en el lumen de los ihos e incubado por 90 min a 37 ° c, y se realiza un ensayo de protección de gentamicina modificada para identificar los niveles de invasión bacteriana. Algunos iHOs también son pretratados con IL-22 humano recombinante (rhIL-22) antes de la infección para determinar si esta citoquina es protectora contra la infección de Salmonella .

Después del comienzo del proceso de diferenciación, las células deben pasar a través de la etapa de la formación del endodermo definitivo seguida por el patrón posterior del intestino antes de la incrustación en la matriz de membrana del sótano. Se formarán esferoides y las culturas con grandes cantidades de material contaminante se aclararán durante un período de varias semanas a medida que los iHOs maduran. Las imágenes ejemplares de la diferenciación, incrustación y proceso de paso se muestran en la figura 1.
La configuración del sistema de microinyección es como se muestra en la figura 2. Los iHOs son microinyectados con la solución de rojo/bacteriano de fenol y conservan su color rojo, permitiendo la identificación de iHOs infectados para prevenir inyecciones duplicadas. Los recuentos de bacterias intracelulares chapadas se realizan siguiendo el ensayo de protección de gentamicina modificado; prestimulación con rhIL-22 restringe el S. Infección por typhimurium, con menos bacterias intracelulares observadas después del tratamiento con rhIL-22 (figura 3). También procesamos rutinariamente los iHOs infectados para inmunostaining, o TEM, con el fin de facilitar la visualización de las interacciones IEC-bacterianas hospedador (figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59478/59478fig1.jpg"> Figura 1: diferenciación dirigida de los IPSC a los iHOs. Secuencia representativa de diferenciación de IPSC a iHOs, demostrando los cambios morfológicos observados y los factores de crecimiento requeridos para impulsar estos cambios. El endodermo definitivo se forma en el día 4 de la diferenciación, tras la exposición a concentraciones específicas de combinaciones de Activin A, FGF, BMP-4, LY294002 y CHIR99021. Después de 8 días, el patrón de este endodermo definitivo con concentraciones específicas de CHIR99021 y ácido retinoico resulta en la formación del intestino. Se observa la formación de postincrustación y esferoide. Después de un paso prolongado usando una matriz de membrana basal de apoyo superpuesta con medio complementado con factores de proliferación prointestinal R-spondin 1, Noggin, EGF, CHIR99021, y prostaglandina E2, los esferoides progresan en el iHOs en Cierva. (Se tomaron imágenes a una magnificación de 4x – 10x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59478/59478fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59478/59478fig2v2.jpg"> Figura 2: microinyección de una iHO con S. Typhimurium. (A) el sistema de microinyección (ver la tabla de materiales) encerrado en la cámara ambiental; Esto permite la inyección de los iHOs en un ambiente controlado (37 ° c/5% CO2). (B) el inóbulo bacteriano se entrega directamente en el lumen IHO utilizando un microcapilar unido al sistema de microinyección. (C) mezclando inódulos bacterianos con fenol rojo, está claro qué ihos han sido infectados, evitando así inyecciones duplicadas de la misma IHO. Las imágenes fueron tomadas con un aumento de 10X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59478/59478fig2v2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59478/59478fig3.jpg"> Figura 3: El pretratamiento de iHOs derivado de la línea celular Kolf2 con rhIL-22 restringe la S. Typhimurium SL1344 invasión en células epiteliales intestinales. Para los ensayos de protección de gentamicina, los iHOs fueron tratados con 100 ng/mL de rhIL-22 18 h antes de la infección, o no se trataron, y se incuvaron durante 90 minutos después de la infección. Los datos son medios de tres réplicas técnicas para tres réplicas biológicas ± SEM. Para pruebas de significancia, se utilizaron pruebas U de Mann-Whitney; p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59478/59478fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59478/59478fig4v2.jpg"> Figura 4: interacción de las IECs con S. typhimurium SL1344. Estos paneles demuestran iHOs inyectados con S. Typhimurium SL1344 e incubado durante 3 h, antes de la fijación y procesamiento para (A) inmunofluorescencia o (B) microscopía electrónica de transmisión. En el panel A, las bacterias se ven dentro de la IHO lumen e interactúan con el epitelio. Los núcleos están manchados con 4 ′, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) dilactato (azul), las membranas celulares con Phalloidin (rojo), y las bacterias con CSA-1 (verde). Las imágenes se toman con un aumento de 20x. El panel B muestra tres vías de procesamiento intracelular diferentes de Salmonella tras la invasión; bacterias se observan (a) dentro de una vacuola que contiene Salmonella, (b) libre dentro del citoplasma, y (c) sometidos a autofagia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59478/59478fig4v2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Medio RPMI/B27</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Componente:</td>
			<td>Cantidad:</td>
		</tr>
<tr>
<td>RPMI 1640 medios con suplemento de glutamina</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>B27 sin suero suplemento 50X</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>medio de crecimiento base iHO</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Componente:</td>
			<td>Cantidad:</td>
		</tr>
<tr>
<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>B27 sin suero suplemento 50X</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Suplemento libre de suero N2 100x</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES 1 M</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutamina 200 mM</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Factores de crecimiento para el medio de crecimiento base iHO</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Componente:</td>
			<td>Cantidad:</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-spondin1 humano recombinante</td>
			<td>500 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Noggin humano recombinante</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Factor de crecimiento epidérmico (EGF)</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Prostaglandina E2</td>
			<td>2,5 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHIR99021</td>
			<td>3 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Y-27632 dihidrocloruro monohidrato</td>
			<td>10 μM</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: recetas de medios.

Los organoides intestinales derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) ofrecen oportunidades emocionantes para modelar enfermedades entérica in vitro. Demostramos la diferenciación de los hiPSCs en los organoides intestinales (iHOs), la estimulación de estos iHOs con citoquinas, y la microinyección de Salmonella typhimurium en el lumen IHO, permitiendo el estudio de una invasión epitelial por este Patógeno.

Usando organoides intestinales derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos para estudiar y modificar la protección de células epiteliales contra Salmonella y otros patógenos

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Este protocolo demuestra la utilidad del sistema organoide intestinal derivado de células madre para modelar la invasión epitelial por patógenos entéricos, y la modificación de este proceso utilizando citoquinas. La microinyección permite que el patógeno de interés se entregue directamente en la cavidad lumenal del organoide, replicando más de cerca el proceso de infección in vivo. Este método podría aplicarse al estudio de diferentes patógenos entéricos o citoquinas alternativas de interés.Yo sugeriría completar una ejecución de prueba del procedimiento con rojo fenol sólo con el fin de dominar la técnica de micro-inyección antes de usar patógenos. En el segundo día, comenzar la diferenciación cambiando los medios a 10 mililitros de medio de cultivo de células madre, complementado con factores de crecimiento. En el sexto día, cambie los medios a 10 mililitros de medios RPMI-B27, complementados con seis micromolares CHIR99021, más tres micromolares de ácido retinoico para comenzar a modelar el endodermo posterior a la placa posterior.En el día de diferenciación 10, incruste la bandeja posterior en la matriz de membrana del sótano. En primer lugar, retire el medio de la placa posterior y lave la placa con DPPS sin magnesio de calcio una vez. Añadir cinco mililitros de solución de colagenasa a la placa e incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos.A continuación, inactivar la colagenasa añadiendo cinco mililitros del medio de crecimiento de la base organoides a la placa. Las celdas posteriores deben estar flotando en este punto. Recoger la suspensión posterior en un tubo cónico de 15 mililitros.Luego centrifugar a 240 veces-G durante un minuto. Después de la centrifugación, pipetear el sobrenadante, añadir 10 mililitros de los medios de crecimiento de la base organoides, dividir la columna posterior en trozos más pequeños por pipeteo suave, y centrifugar de nuevo a 95 veces-G durante un minuto. Lavar las células en el medio de crecimiento de la base organoides dos veces.Resuspender las células en 300 a 500 microlitros del medio de crecimiento base, y añadir aproximadamente 100 microlitros de esta solución a 1,5 mililitros de la matriz de membrana del sótano. Coloca una placa de 24 pozos en un calentador de placas a 37 grados Celsius. y detectar 60 microlitros de la mezcla de matriz celular de la parte posterior en un pozo de la placa de 24 pozos.Permita que se ajuste brevemente y compruebe la densidad bajo un microscopio. Después de detectar el resto de la matriz en la placa de 24 pozos, incubar la placa a 37 grados Celsius durante 10 minutos. A continuación, agregue 800 microlitros de los medios de crecimiento base que contienen factores de crecimiento a cada pozo de la placa de 24 pozos.Para pasar organoides, primero retire el medio de ellos, y reemplácelo con 500 microlitros por pozo de la solución de elevación celular. Incubar a cuatro grados Centígrados durante 40 a 50 minutos, momento en el que los organoides deben estar flotando en la solución. Pipetear suavemente los organoides y la solución de elevación celular en tubos cónicos de 15 mililitros, tratando de no romper los organoides.Después de permitir que los organoides se asienten durante tres a cinco minutos, retire el sobrenadante y las células individuales. Resuspender los organoides en cinco mililitros del medio de crecimiento base, y pipetearlos suavemente para lavar. Centrifugar a 95 veces-G durante dos minutos.A continuación, coloca la placa de 24 pozos en un calentador de placas a 37 grados Celsius dentro de la capucha, y retira el sobrenadante del pellet organoide. Luego, usando una pipeta P1000, resuspendir los organoides en 300 a 500 microlitros de los medios de crecimiento base para dividir los organoides en trozos más pequeños. Coloque aproximadamente 100 microlitros de los organoides en 1,5 mililitros de la matriz de membrana del sótano y pipeta brevemente para mezclar.Detectar 60 microlitros de la matriz de membrana del sótano en un pozo de la placa de 24 pozos. Después de dejarlo solidificar durante 30 segundos, compruebe la densidad bajo el microscopio. Después de detectar el resto de la matriz en una placa de 24 pozos, coloque la placa en una incubadora a 37 grados celsius durante 10 minutos, y luego superponga con 800 microlitros del medio de crecimiento base con factores de crecimiento según el manuscrito.Para ensayos de microinyección con preestimulación IL-22 humana recombinante, añada IL-22 humano recombinante a los medios de cultivo a una concentración final de 100 nanogramos por mililitro 18 horas antes de las inyecciones. Cargue el plato de microinyección que contiene organoides en la etapa del microscopio, retire la tapa y ponga los organoides en el foco, listos para que comience la inyección. Encienda el inyector y las estaciones de control de brazos.Asegúrese de que el inyector esté ajustado a una presión de 600 kilopascales y a un tiempo de inyección de 0,5 segundos. Si aún no está alejado de la etapa del microscopio, gire el brazo de inyección para asegurarse de que lo está y retire su cabezal de agarre. Cargue la punta del taladro con 10 microlitros del inóculo, agarrando suavemente la punta del taladro en su extremo romo.Coloque la punta de la broca en la cabeza de agarre y vuelva a colocarla en el brazo de microinyección. Mueva suavemente el brazo en una posición en la que la aguja esté situada de uno a dos centímetros por encima de la placa de microinyección. Utilice el control del brazo para colocar la punta de la aguja en el centro de la placa y bajarla hasta que esté justo sobre la superficie del medio.Programe la estación de control del brazo para devolver la aguja a este punto después de todas las inyecciones. Enfoque el microscopio en los organoides y seleccione el objetivo a inyectar. Coloque la aguja justo encima y a la derecha del organoide que se va a inyectar, y mueva la aguja hacia abajo y lateralmente hacia el lumen organoide.Presione el botón de inyección en el microinyector para dejar que la mezcla de bacterias manchadas de fenol salga de la aguja. E inyectar cada organoide tres veces. Cuando se inyecten todos los organoides necesarios, retire la placa de microinyección de la etapa, reemplace la tapa e incuba la placa a 37 grados centígrados durante 90 minutos.Después de la incubación, aspirar los medios de crecimiento y reemplazarlo con tres mililitros de solución de elevación celular. Luego, incubar a cuatro grados centígrados durante 45 minutos. A continuación, mueva suavemente los organoides y la solución de elevación celular a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de DPBS.Centrifugar a 370 veces-G durante tres minutos. Retire el sobrenadante y agregue un mililitro del medio de crecimiento base que contiene 0,1 miligramos por mililitro de gentamicina. A continuación, con un P1000, pipeta hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 50 veces para romper los organoides.Añadir cuatro mililitros más medios, e incubar a 37 grados Celsius durante una hora para matar las bacterias extracelulares. A continuación, centrifugar los organoides a 370 veces-G durante tres minutos. Aspirar el sobrenadante, dejando lo menos posible.Lave los organoides con DPBS una vez y centrifugar de nuevo. Añadir 500 microlitros del tampón de la lelisis, y pipetear hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 50 veces para disociar manualmente los organoides intestinales humanos. Después de incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos, diluir en serie la solución resultante diez veces en DPBS.Pipetear tres gotas de 20 micras de las soluciones limpias y diluidas en placas de agar LB precaleadas. Finalmente, incubar a 37 grados centígrados durante la noche y proceder con el recuento de colonias. Los organoides intestinales humanos fueron micro-inyectados con la solución bacteriana roja fenol.La retención de este color rojo por los organoides previene las inyecciones duplicadas. El pretratamiento de los organoides intestinales humanos derivados de la línea celular COF-2 con IL-22 humano recombinante restringe la invasión de S.typhimurium SL1344 en células epiteliales intestinales. Los organoides infectados se procesaron para inmunomantelación, o microscopía electrónica de transmisión, con el fin de facilitar la visualización de las interacciones bacterianas del IEC del huésped.El ARN se puede extraer de los organoides inyectados para examinar la respuesta transcriptómica a la infección. La fluorescencia y la microscopía electrónica también se pueden utilizar para observar las interacciones de los patógenos del huésped con más detalle. Lo más importante a recordar es asegurarse de que usted ha tenido suficiente práctica en el micro-inyector para ser capaz de completar sus inyecciones de forma rápida y eficiente para obtener resultados consistentes.Las puntas de perforación de microinyección tienen un punto fino y afilado, y se debe tener cuidado al cargarlas y descargarlas del microinyector. Esta técnica permite estudiar las interacciones de patógenos de células epiteliales con detalles previamente inalcanzables. Este modelo de infección será de particular utilidad para aquellos que estudian patógenos específicos del ser humano.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Describimos un método para establecer enteroides humanos a partir de criptas del intestino delgado y colonoides a partir de criptas de colon recogidas tanto de tejido quirúrgico como de biopsias. En este artículo metodológico, presentamos las modalidades de cultivo que son esenciales para el crecimiento y mantenimiento exitoso de enteroides y colonoides humanos.

Establecimiento de Human epitelial Enteroids y Colonoids de Whole Tejidos y Biopsia

Este protocolo describe la medición de la permeabilidad de la barrera epitelial en el tratamiento farmacológico siguiente en tiempo real en humanos organitas intestinal mediante microscopía fluorescente y vivo microscopia celular.

Medición en tiempo real de la permeabilidad de la barrera epitelial en organoides Intestinal humano

Este protocolo permite la diferenciación de células pluripotentes humanas en organoides intestinales. El protocolo imita el desarrollo humano normal mediante la diferenciación de células en una población de endodermo definitivo, endodermo del intestino posterior y luego epitelio intestinal. Esto hace que el protocolo sea adecuado para estudiar tanto el desarrollo intestinal como las aplicaciones de modelización de enfermedades.

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Monocapa epitelial derivada de organoides: un modelo in vitro clínicamente relevante para la función de barrera intestinal

Aquí presentamos dos protocolos que permiten el modelado de interacciones intestinales apical-específicas. las monocapas intestinales Organoide-derivadas y las culturas de la interfaz aire-líquido (ALI) facilitan la generación de epitelios bien diferenciados accesibles de lados luminales y basolaterales, mientras que los organoids intestinales polaridad-invertidos exponen su lado apical y son susceptibles a los análisis de alto rendimiento.

Métodos de cultivo para estudiar las interacciones apicales específicas utilizando modelos organoides intestinales

Aquí, se describen métodos detallados para generar, mantener y caracterizar organoides de intestino delgado y colon derivados de células madre pluripotentes humanas. Estos métodos están diseñados para mejorar la reproducibilidad, ampliar la escalabilidad y disminuir el tiempo de trabajo necesario para el recubrimiento y el paso de organoides.

Generación, mantenimiento y caracterización de organoides intestinales y colónicos derivados de células madre pluripotentes humanas

Este protocolo detalla el establecimiento de enteroides, un modelo intestinal tridimensional, a partir del tejido intestinal fetal. Se utilizaron imágenes inmunofluorescentes de biomarcadores epiteliales para la caracterización del modelo. La exposición apical de lipopolisacáridos, una endotoxina bacteriana, mediante la técnica de microinyección indujo la permeabilidad epitelial de una manera dependiente de la dosis medida por la fuga de dextrano fluorescente.

Prueba de permeabilidad epitelial en enteroides derivados de tejido fetal

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Estudio de los efectos epiteliales de la inflamación intestinal in vitro en colonoides murinos establecidos

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Uso de organoides intestinales humanos para comprender el epitelio del intestino delgado a nivel transcripcional de una sola célula

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Un cultivo de organoides bidimensional sobre una invasina o extracto de membrana basal para estudiar las interacciones huésped-bacteria

Aprende a usar organoides intestinales derivados de hiPSC para modelar la invasión epitelial por patógenos entéricos mediante microinyección. Este método permite estudiar interacciones huésped-patógeno con precisión.

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Usando organoides intestinales derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos para estudiar y modificar la protección de células epiteliales contra Salmonella y otros patógenos

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