Name: Generación de hidrogeles a base de colágeno 3D para analizar el crecimiento y el comportamiento axonal durante el desarrollo del sistema nervioso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Aprende a generar hidrogeles de colágeno 3D para estudiar el crecimiento axonal y la migración neuronal durante el desarrollo del sistema nervioso. Este método utiliza células COS-1 transfectadas y tejido cerebral embrionario de rata.

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Los autores agradecen a Tom Yohannan por el asesoramiento editorial y a M. Segura-Feliu por la asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por el Programa CERCA y por la Comisión de Universidades e Investigación del Departamento de Innovación, Universidades y Empresa de la Generalitat de Catalunya (SGR2017-648). Este trabajo fue financiado por el Ministerio de Investigación, Innovación y Universidad de España (MEICO) a través de BFU2015-67777-R y RTI2018-099773-B-100, la Red Española de Morones (Prionet España AGL2017-90665-REDT), y el Instituto Carlos III, CIBERNED ( PRY-2018-2).

Todos los experimentos con animales se realizaron bajo las directrices y protocolos del Comité Ético de Experimentación Animal (CEEA) de la Universidad de Barcelona, y el protocolo para el uso de roedores en este estudio fue revisado y aprobado por el CEEA de la CEEA de la Universidad de Barcelona (aprobación de la CEEA #276/16 y 141/15).
1. Purificación del colágeno de la cola de rata
<ol><li>Recoger colas de rata Sprague-Dawley adultas (8-9 semanas de edad) después de sacrificar al animal siguiendo las pautas éticas y enjuagar en 95% etanol. Colocar 2-4 colas sobre hielo (4oC) y mantenerlas cubiertas de hielo durante el proceso.</li>
	<li>Para obtener tendones de cola, fijar la cola en las vértebras más caudales de la cola usando un hemostat y comprimir la cola con un segundo hemostat situado alrededor de 5-7 mm desde el primero. Rompe la cola torciéndola bruscamente con ambos hemostats. Para ello, doble/desdoble las vértebras varias veces hasta que se rompa.</li>
	<li>Tire de las vértebras lentamente con el hemostat para separar los tendones de su vaina a medida que sale. En este momento, cortar tendones con tijeras pequeñas. Mantenga estas piezas de tendón en un plato estéril de 100 mm Petri sobre hielo.</li>
	<li>Repita la sujeción y deslizamiento durante el resto de la cola hasta que los tendones estén totalmente extraídos.</li>
	<li>Repita los pasos 1.2-1.4 para todas las colas obtenidas.</li>
	<li>Observe los tendones bajo un microscopio. Deseche los vasos sanguíneos cortando con tijeras pequeñas y sosteniendo con fórceps finos rectos para mejorar la pureza del tendón y enjuague los tendones 3 veces con agua ultrapura.</li>
	<li>Recoger 3-4 g de tendones húmedos. Disolver los tendones en 150 ml de ácido acético glacial al 3% a 4 oC en un matraz cónico de vidrio de 200-250 ml durante 24-36 h, bajo agitación suave.</li>
	<li>Centrífuga a 20.000 x g durante 1 h. En paralelo, prepare la membrana de tubos de diálisis cortando una pieza de alrededor de 10-15 cm de longitud y hervirla en agua ultrapura que contenga 1 mM de ácido etilendiaminetetraacético (EDTA) durante 15 minutos. A continuación, enjuague suavemente la membrana de diálisis con agua ultrapura.</li>
	<li>Después de la centrifugación, recoja el sobrenadante en la membrana de tubos de diálisis por decantación. El pellet contiene material insoluble ácido (proteínas no colágenos) y el sobrenadante contiene proteínas de colágeno solubles.</li>
	<li>Dialyze el sobrenadante contra 2 L de águila media esencial mínima de 0,1x estéril (MEM), pH 4.0 en un vaso de vidrio de 2-5 L. Dialyze durante 3 días. Cambie la solución MEM 0,1x al menos dos veces al día comprobando el pH en cada cambio antes de usar. Si el pH se ha vuelto básico, modifíquelo con unas gotas de ácido acético de 0,1 M hasta que el pH sea 4,0.</li>
	<li>Después de la diálisis, agregue antibióticos (1,5 ml de penicilina/estreptomicina (Pen-Strep)) a la solución de colágeno dializado. Hacer alícuotas de 5 ml de la solución de callos y almacenar a 4 oC. NOTA: A partir de este punto, todos los procedimientos de manipulación deben realizarse en condiciones estériles en una campana de flujo laminar.</li>
	<li>
Proceda con la prueba de gelificación de la solución de colágeno preparada siguiendo los siguientes pasos.
	<ol>
<li>Dado que el colágeno en stock suele estar demasiado concentrado, preparar 3 diluciones de trabajo (75%, 50% y 25% solución de colágeno) diluyendo el stock en 0.1x MEM, pH 4.0. El volumen final recomendado para cada dilución de trabajo es de 5 ml. En cada condición, compruebe la concentración de proteínas utilizando un ensayo colorimétrico de proteínas.</li>
		<li>Colocar varios tubos centrífugos cónicos vacíos de 1,5 ml (uno para cada dilución de trabajo), 10 tubos MEM, 7,5% de solución de bicarbonato sódico y diferentes diluciones de trabajo de colágeno sobre hielo. Espere hasta que se enfríen.</li>
		<li>Añadir 40-50 l de 10 MEM a un tubo centrífugo frío (4 oC). A continuación, mezcle suavemente con 7-8 ml de solución de bicarbonato sódico.</li>
		<li>Añadir 310-330 l de una de las diferentes diluciones de colágeno a este tubo y mezclarsuavemente con la pipeta evitando cualquier formación de burbujas. Mantenga la mezcla de bicarbonato de colágeno-MEM-sodio sobre hielo (4 oC) durante al menos 5 minutos.</li>
		<li>Pipetear 10-25 l de la mezcla en una placa Petri de 35 mm.</li>
		<li>Colocar la placa Petri en la incubadora de CO2 a 37oC hasta que se observe la gelifación del hidrogel (a 15-20 min).</li>
		<li>Repita los pasos 1.12.3-1.12.6 para las diluciones de colágeno restantes en diferentes platos de Petri.</li>
		<li>Seleccione la dilución de trabajo de colágeno que represente los mejores resultados. NOTA: El mejor hidrogel gelizado debe tener una textura translúcida uniforme, color gris y no debe ser abultado o frito. En nuestra experiencia, una dilución de 3:1 (Colágeno: 0,1x MEM) genera los mejores resultados experimentales.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparación de células (COS1) Agregados genéticamente modificados para secretar una molécula candidata en hidrogeles de colágeno 3-D
<ol><li>Placa 2 x 106 COS1 células en un 35 mm platos Deli e incubar con medio de cultivo completo compuesto por 100 ml de D-MEM que contiene 10% (vol/vol) suero bovino fetal inactivado por calor, 0,5% (wt/vol) glutamina y 1% (wt/vol) Pen/Strep en un cultivo celular incubadora, con el fin de alcanzar el 70-80% de confluencia durante la noche. Prepare un plato de Petri para cada procedimiento de transfección.</li>
	<li>
Al día siguiente, las células COS1 transfectos con el ADN codifican la molécula candidata (Netrin-1 o Sema3E) utilizando el método de transfección basado en liposomas siguiendo las instrucciones del fabricante.
	<ol>
<li>Para ello, mezcle 250 ml de medio libre de suero y ADN (1-2 g por condición) en un tubo centrífugo de 1,5 ml (tubo de ADN) y mezcle. Incubar a temperatura ambiente (RT) durante 5 min. Preparar un segundo tubo (tubo liposomal) añadiendo 240 ml del medio libre de suero y 10 ml del reactivo de transfección liposomal. Incubar a RT durante 5 min.</li>
		<li>Después de la incubación, agregue el contenido del tubo de ADN al tubo liposomal y mezcle suavemente. Ahora incubar a RT durante 15 minutos. Reemplace el medio en las células cultivadas con 1,5 ml del medio libre de suero y agregue la mezcla de liposomas de ADN a la placa Petri lentamente en gota. Incubar durante 3 h en la incubadora de cultivo celular CO 2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de 3 h de incubación de transfección, sustituya el medio por el medio de cultivo completo e incubadurante durante la noche en la incubadora.</li>
	<li>Al día siguiente, enjuague las células con 0,1 M de solución salina tamponada de fosfato de Dulbecco (D-PBS), trate los cultivos con trippsina-EDTA (800 ml por cada plato durante 5-15 minutos en la incubadora de CO 2) y recoja las células separadas con 15 ml de medio de cultivo completo.</li>
	<li>Centrifugar las células a 4oC a 130 x g durante 5 min. Después de la centrifugación, retire los medios y conserve el pellet que contiene células COS1 en hielo.</li>
	<li>Repita los pasos 1.12.3-1.12.6 para preparar la mezcla de trabajo de colágeno.</li>
	<li>Añadir 100-150 l de la mezcla de colágeno al pellet de las células transsemicadas y mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo y esparcir 45-50 l de esta mezcla en una placa Petri (35 mm de diámetro) para formar una banda uniforme de células de colágeno de alrededor de 1-1,5 cm de longitud. Colocar el plato en la incubadora a 37oC (5% CO2) hasta que se observe la gelidación (a 15-20 min).</li>
	<li>Preparar una segunda tira que contenga células de control (transfección simulada) en un segundo plato de cultivo y placarla en la incubadora (15-20 min) y cuando se complete la gelidación añadir 3-4 ml de COS1 COS1 caliente medio de cultivo completo a cada plato que contenga el gelizado las tiras de células de colágeno y mantenerlas en la incubadora de cultivo celular de CO 2. A partir de entonces, corte las tiras de células de colágeno para generar pequeñas piezas cuadradas (400 a 500 m de longitud) usando un bisturí fino o un helicóptero de tejido.</li>
	<li>Transfiera todas las secciones de la misma condición de transfección a una placa Petri que contenga 3-3,5 ml de medios de cultivo neuronal (NCM) y compruebe bajo un microscopio de disección la calidad de las piezas. Una vez más, manténgalos en la incubadora de cultivo celular de CO 2. NOTA: El medio de cultivo neuronal consiste en medio neurobasal que contiene 1-5% (vol/vol) suero de caballo inactivado por calor, 2 mM de glutamina, 0,5% (wt/vol) glucosa, 1% (wt/vol) Pen-Strep solución y 0.044% (wt/vol) NaHCO3. Asegúrese de que el pH esté entre 7,2-7,3.</li>
</ol>3. Generación de Explant embrionario para el cultivo
<ol><li>Esterilice las herramientas quirúrgicas (tijeras, mango de la cuchilla del bisturí, fórceps rectos y curvos) autoclavendo siguiendo las pautas de esterilización rutinarias. En paralelo preparar 500 ml del tampón equilibrado de solución de sal-glucosa de Hank y 4-5 platos de Petri (100 mm de diámetro) que contienen 10 ml de HBSS-G. Coloque estas placas sobre hielo (4oC).</li>
	<li>Sacrificar a la rata embarazada (día embrionario 16.5) fuera de la zona estéril, siguiendo los procedimientos éticos aprobados. Corta los cuernos embrionarios con tijeras de la cavidad abdominal y colócalos en un plato grande de Petri que contenga HBSS-G frío.</li>
	<li>Coloque el plato en la campana de flujo laminar y extraiga los embriones con fórceps rectos. Colóquelos en un plato nuevo que contenga HBSS-G frío. A continuación, retire la piel del embrión usando pequeños fórceps y diseccione cuidadosamente el cerebro usando los fórceps curvos y rectos. Colóquelos en un plato que contenga HBSS-G frío.</li>
	<li>Bajo un microscopio de disección, corta el cerebro por la mitad a lo largo de la línea media para separar ambos hemisferios con el bisturí o tijeras finas y eliminar el diencéfalo, las meninges y los vasos sanguíneos de las piezas cerebrales con fórceps finos.</li>
	<li>Repita los pasos 3.3-3.4 con el resto de los embriones. No retrase la disección durante más de 2 h para preservar la calidad del tejido.</li>
	<li>Limpie todas las partes del helicóptero de tejido con 100% de etanol (especialmente la placa de corte de politetrafluoroetileno (PTFE) y la cuchilla de afeitar). Mantenga el helicóptero de tejido en la campana de flujo laminar bajo iluminación UV durante 15 minutos.</li>
	<li>Transfiera cada pieza de tejido (por ejemplo, corteza con hipocampo) a la placa de corte del helicóptero de tejido. Para el hipocampo, colóquelo perpendicular a la cuchilla de afeitar y obtenga secciones de tejido de 450-500 m de espesor.</li>
	<li>Preparar varios platos Petri de 35 mm con 3-4 ml de NCM completo y transferir piezas de tejido de la placa de chopper de tejido a los platos Petri. Muchos platos pueden ser necesarios ya que las regiones de interés se diseccionan.</li>
	<li>Terminar la disección de tejido en el MNC completo usando agujas finas de tungsteno. Compruebe la calidad de las rodajas obtenidas bajo el microscopio de disección. Asegúrese de que las capas son claramente identificables en la óptica de campo oscuro y diseccionar la región de interés (por ejemplo, la región de CA del hipocampo) con agujas de tungsteno. Deseche las rodajas dañadas. Mantenga los explantes hipocampales en medio NCM completo en la incubadora de CO 2.</li>
</ol>4. Preparación de cocultivos 3D en hidrogeles de colágeno
<ol><li>Coloque varias placas de cultivo estériles de 4 pocillos en la campana de flujo laminar y prepare una mezcla de trabajo de colágeno como se indicó anteriormente en los pasos 1.12.2-1.12.6.</li>
	<li>Colocar 15-20 l de la mezcla de hidrogel en la parte inferior de un pozo para producir una base circular de colágeno. Repita este paso para el resto de los pozos. No prepare más de cinco placas al mismo tiempo para evitar la evaporación excesiva de líquidode la base de hidrogel.</li>
	<li>Conservar los platos en la incubadora hasta que se observe la gelación completa (15-20 min) y sacar las placas de la incubadora sólo cuando se complete la gelidación. Compruebe la calidad del colágeno gelizado.</li>
	<li>Transfiera una pequeña pieza de agregado de células COS1 con una pipeta. Colóquelo en la base del hidrogel y coloque una pieza de tejido en la misma base con una pipeta cerca de la pieza de las células agregadas en un tamaño explanta.</li>
	<li>Preparar una nueva mezcla de colágeno de trabajo sobre hielo como en los pasos 1.12.2-1.12.6.</li>
	<li>Pipetear suavemente 15-20 l de esta nueva mezcla y cubrir el explant y el agregado celular. Se observará un cultivo de hidrogel similar a un sándwich. En este momento, reorientar la explantación con una aguja de tungsteno fino (¡no toque el agregado de celda COS1!), por lo que se enfrenta al agregado de celda a 500-600 m.</li>
	<li>Devolver la placa a la incubadora hasta que se observe la gelidación (10-15 min), y 0,5 ml de NCM completo complementado con suplemento de 2% B27y mantener los cultivos durante 36 a 48 h en la incubadora (37 oC, 5% CO 2).</li>
</ol>5. Fijación de cocultivos agregados de células explantas y procedimiento inmunocitoquímico
<ol><li>Después de 36-48 h de incubación, retire el medio y enjuague con 0.1 M de fosfato salina tamponada (PBS), pH 7.3. A partir de entonces, fijar los cultivos durante 1 h con 4% de paraformaldehído en tampón de fosfato de 0,1 M (PB), pH 7,3, a 4 oC.</li>
	<li>Retire el fijador y enjuague suavemente los cultivos 3-4 veces (10-15 min cada uno) en 0,1 M PB, pH 7,3.</li>
	<li>Separe el sándwich de hidrogel de la parte inferior del pozo con espátula o fórceps. Transfiera el bloque de colágeno con un pincel fino a una placa de cultivo de 6 pocillos que contenga 0,1 M PBS con un detergente no iónico al 0,5%.</li>
	<li>Incubar hidrogeles flotantes en la solución de bloqueo (10% suero, 0,5% tensioactivo no iónico y 0,2% de gelatina en 0,1 M PBS) durante 2-3 h a RT con agitación suave.</li>
	<li>Enjuague 3 veces (10-15 min cada uno) con 0,1 M PBS que contenga un tensioactivo no iónico al 0,5%.</li>
	<li>Incubar con anticuerpo primario diluido en PBS que contenga un 5% de suero, un tensioactivo no iónico al 0,5%, una gelatina al 0,2% y un 0,02% de azida sódica. Incubar con el anticuerpo primario durante 36-48 h a 4oC en una coctelera. NOTA: Por lo general, se utiliza un anticuerpo contra la clase III de la tubulina (-TUJ-1) (diluido 1:2.000) para definir el crecimiento axonal en cultivos de hidrogel 3-D.</li>
	<li>Después de la incubación, enjuague como en el paso 5.5.</li>
	<li>Incubar con anticuerpo secundario durante 4 h a RT (o 6-7 h a 4oC) sobre una coctelera diluida en suero del 5%, un tensioactivo no iónico al 0,5% y una gelatina al 0,2%. En este experimento se utiliza un anticuerpo biotinilado antiratón de caballo (diluido 1:200).</li>
	<li>Enjuague los cultivos como en 5.5.</li>
	<li>Incubar los cultivos durante 2 días a 4 oC con solución compleja de avidina-biotina (ABC) 1:100 diluida en PBS que contiene un 5% de suero, un tensioactivo no iónico al 0,5% y una gelatina al 0,2%. Alternativamente, utilice la peroxidasa de rábano picante (HRP) con la etiqueta streptavidina (diluida 1:300-400) en el mismo búfer.</li>
	<li>Enjuague los cultivos como se describe en 5.5.</li>
	<li>Enjuague los cultivos varias veces con un tampón Tris-HCl de 0,1 M, pH 7,6 durante 1 h.</li>
	<li>Incubar los cultivos con 0,03% de solución de tetrahidrocloruro de diaminobenzidina (DAB) al 0,3 o-diaminobenzidina en 0,1 M Tris-HCl, pH 7,6.</li>
	<li>Añadir 5-8 l de 1% H2O2 y esperar 10-15 min. Monitorear el desarrollo de DAB bajo un microscopio usando un objetivo de 4-10x.</li>
	<li>Detenga la reacción eliminando la solución DAB con un tampón Tris-HCl de 0,1 M, pH 7.6.</li>
	<li>Enjuague los cultivos en PBS durante 30 min (varios cambios).</li>
	<li>Monte los hidrogeles en portaobjetos de vidrio utilizando medios de montaje acuosos.</li>
	<li>Analice la longitud y distribución de los axones dentro del hidrogel utilizando el plug-in de análisis Sholl o con el plug-in NeuriteJ para el software ImageJ30.</li>
</ol>

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<li>Montolio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semaphorin+3A+inhibitor+blocks+axonal+chemorepulsion+and+enhances+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Biology%22%5BJournal%5D)">A semaphorin 3A inhibitor blocks axonal chemorepulsion and enhances axon regeneration.</a> Chemistry and Biology. 16 (7), 691-701 (2009).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El crecimiento de los axons en desarrollo es principalmente invasivo e incluye la degradación y remodelación de ECM. Utilizando el procedimiento presentado aquí, los investigadores pueden obtener una matriz 3D homogénea formada por el colágeno natural tipo I en el que los axons (o células) pueden responder a un gradiente químico secretado por células modificadas genéticamente como lo hacen in vivo. Diferentes respuestas axonales a gradientes de señales atractivas o inhibitorias (proteínas, lípidos, etc.) se pueden compar...

Los axónicos neuronales, que terminan en conos de crecimiento axonal, migran largas distancias a través de la matriz extracelular (ECM) del embrión sobre vías específicas para alcanzar sus objetivos apropiados. El cono de crecimiento es la porción distal del axón y estáespecializado para detectar el entorno físico y molecular de la célula 1,2. Desde un punto de vista molecular, los conos de crecimiento se guían por al menos cuatro mecanismos moleculares diferentes: atracción de contacto, quimioatracción, repulsión de contacto y quemorepulsión desencadenada por diferentes señales de orientación axonal3,4 , 5 , 6.Los procesos mediados por contacto pueden monitorizarse parcialmente en cultivos bidimensionales (2D) en sustratos micropatrones (por ejemplo, con rayas 7,8 o manchas9 que contengan las moléculas). Sin embargo, los axons pueden navegar a su objetivo de una manera no difusa mediante la sensación de varias moléculas atractivas y repulsivas de las células de la guía en el medio ambiente4,5,10. Aquí, describimos un método fácil de cultivo 3D para comprobar si una molécula secretada induce efectos chemorepulsivas o quimioatractivos en el desarrollo de axones.
Los primeros estudios tenían como objetivo determinar los efectos de las señales de orientación de axón utilizadas en cultivos explantados en matrices tridimensionales (3-D) para generar gradientes que simulaban en condiciones vivas11,12. Este enfoque, junto con los experimentos in vivo, permitió la identificación de cuatro familias principales de señales de orientación: Netrins, Slits, Semaphorins, y Ephrins4,5,6. Estas señales moleculares y otros factores13 están integradas por los axons en crecimiento, desencadenando la dinámica de los complejos de adhesión y transduciendo las fuerzas mecánicas a través del citoesqueleto14,15,16. Para generar gradientes moleculares en cultivos tridimensionales para la navegación axonal, investigadores pioneros utilizaron sustratos de coágulos plasmáticos17,que también se utilizaron para preparaciones de rodajas organotípicas18. Sin embargo, en 1958, se informó de un nuevo protocolo para generar hidrogeles de colágeno 3D para estudiar con los dispositivos de Maximow19,una plataforma de cultivo, utilizada en varios estudios adecuados para observaciones microscópicas20. Otro estudio pionero informó el gel de colágeno como una herramienta para incrustar fibroblastos humanos para estudiar la diferenciación de fibroblastos en miofibroblastos en procesos de cicatrización de heridas21. Paralelamente, Lumsden y Davies aplicaron colágeno de la dermis bovina para analizar el efecto putativo del factor de crecimiento nervioso (NGF) en la orientación de las fibras nerviosas sensoriales22. Con el desarrollo de nuevas plataformas de cultivo (por ejemplo, placas multipozos) pordiferentes empresas y laboratorios, los cultivos de colágeno se adaptaron a estos nuevos dispositivos 6,23,24,25 ,26. Paralelamente, un extracto de material ECM derivado de la línea de células tumorales Engelbreth-Holm-Swarm se puso a disposición comercialmente para ampliar estos estudios27.
Recientemente, se han desarrollado varios protocolos para generar gradientes moleculares con funciones putativas en la orientación de axón utilizando hidrogeles 3D (por ejemplo, colágeno, fibrina, etc.) 28. Alternativamente, la molécula candidata puede ser inmovilizada a diferente concentración en una matriz porosa (por ejemplo, NGF29) o generada por el cultivo en una pequeña región de los agregados de células hidrogel 3D que segregan la molécula para generar una gradiente4,23,24,25,26. La última posibilidad se explicará en este protocolo.
El procedimiento presentado aquí es un método fácil, rápido y altamente reproducible basado en el análisis del crecimiento axonal en cultivos de hidrogel 3D del cerebro de ratón embrionario. En comparación con otros métodos, el protocolo es adecuado para investigadores no entrenados y se puede desarrollar completamente después de un breve entrenamiento (1-2 semanas). En este protocolo, primero aislamos el colágeno de las colas de rata adultas para generar matrices tridimensionales en las que los agregados celulares modificados genéticamente se cultivan frente al tejido neuronal embrionario. Estos agregados celulares forman gradientes químicos radiales de una molécula candidata que provoca una respuesta para los axones en crecimiento. Por último, la evaluación de los efectos de la molécula en los axónicos en crecimiento se puede realizar fácilmente mediante una microscopía de contraste de fase o, alternativamente, métodos inmunocitoquímicos.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Material</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-Diaminobencidina tetraclorhidrato 10 mg comprimidos (DAB)</td><td>Sigma</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>Ratas Sprague-Dawley adultas (8 a 9 semanas de edad)&nbsp;</td><td>Criffa-Credo, Lyon, Francia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Complejo avidina-biotina-peroxidasa (ABC)</td><td>Vector Labs</td><td>PK-4000</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento sin suero 50x&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas de ácido bicinconínico (BCA)</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>vectores de plásmidos de ADNc líneas celulares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>COS1</td><td>ATTC</td><td>CRL-1570</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucosa</td><td>Sigma</td><td>16325</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucosa (solución al 45% en agua) para medio neurobasal completo</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) para el medio de cultivo COS1</td><td>Invitrogen</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s solución salina tamponada con fosfato 10x (sin Ca2+ y Mg2++) (D-PBS) para cultivos</td><td>Invitrogen</td><td>14200</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&nbsp;</td><td>merck</td><td>108543</td><td></td></tr><tr><td>Sal disódica disolutática de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Medios de montaje de fluorescencia (p. ej., Fluoromount-G o similar)</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica (EMS)</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina en polvo&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial (Panreac, n.º de cat. 211008)</td><td>Panreac</td><td>211008</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s solución salina equilibrada &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>24020083</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino inactivado por calor&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10108-165</td><td></td></tr><tr><td>Suero de caballo inactivado por calor&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno (H2O2, 32 a 33% en agua)</td><td>Sigma</td><td>316989</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina 200 mM solución (100x) para medio completo Neurobasal y COS1</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Ratones hembras preñadas (día embrionario 12,5 a 16,5; E12.5-16.5)&nbsp;</td><td>Criffa-Credo, Lyon, Francia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medio Esencial Mínimo Modificado Eagle (MEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11012-044</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal contra clase III &beta;-tubulina (clon TUJ-1)</td><td>Biolegend</td><td>801201</td><td></td></tr><tr><td>N-2 suplemento 100x&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Medio neurobasal&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído Merck</td><td></td><td>1,040,051,000</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina solución 100x&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15140-22</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato 10x (PBS) para inmunocitoquímica</td><td>Invitrogen</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario: caballo biotinilado anti-ratón&nbsp;</td><td>Vector Labs</td><td>BA-2000</td><td></td></tr><tr><td>Medio sin suero (Opti-MEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica&nbsp;</td><td>Panreac</td><td>162712</td><td></td></tr><tr><td>Solución de bicarbonato de sodio 7,5%&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>Cultivo estéril grado H2O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>TritonTM X-100&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (Tripsina (0.05% (wt/vol) con EDTA (1x)</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr>1 <tr><td>tijeras curvas grandes y 1 pequeña para disección&nbsp;</td><td>Herramientas finas Instrumentos o similares</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cónicos de 1,5 mL&nbsp;</td>Tubos de centrífuga cónicos <td>Eppendorf o similares</td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>15 mL&nbsp;</td><td>Corning o similar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 hemostáticos&nbsp; &nbsp;</td><td>Herramientas finas Instrumentos o similares</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 tijeras de disección rectas pequeñas</td><td>Herramientas finas Instrumentos o similares</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 200 mL para centrifugación</td><td>Nalgene o similar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matraces</td><td></td><td></td><td></td>cónicos de vidrio estéril de 200 mL</tr><tr><td>Vaso de precipitados</td><td></td><td></td><td></td>de vidrio de 2 L</tr><tr><td>Placas de cultivo de 4 y 6 pocillos&nbsp;</td><td>Nunc</td><td>176740 y 140675</td><td></td></tr><tr><td>Bombas automáticas de pipetas y pipetas de plástico estériles desechables de 10 mL y 25 mL que contienen filtro.</td><td>Gilson, Brand, Eppendorf o similar&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas automáticas, puntas de filtro estériles y puntas estériles actuales&nbsp;</td>Microcentrífuga de sobremesa <td>Gilson, Eppendorf o similar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>con rotor fijo en ángulo&nbsp;</td><td>Eppendorf, Beckman Coulter o similar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada de sobremesa con rotor de cubo oscilante (con adaptadores de tubo de 1,5, 15 y 50 mL)</td><td>Eppendorf, Beckman Coulter o similar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultivo celular a 37 &deg; C, 5% CO2 y 95% aire</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de diálisis membrana de celulosa</td><td>Sigma</td><td>D9402</td><td></td></tr><tr><td>Cierres de tubos de diálisis&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Z37101-7</td><td></td></tr><tr>Pipetas <td></td><td></td><td></td>de<td>vidrio desechables</td></tr><tr><td>Microscopio de disección con óptica de campo oscuro&nbsp;</td><td>Olympus SZ51 o similar&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada de alta velocidad Beckman Coulter o similar con rotor</td><td></td><td></td><td></td>fijo en ángulo</tr><tr><td>Campana</td><td></td><td></td><td></td>de flujo laminar</tr><tr><td>Grandes 100 mm, 60 mm y pequeñas 35 mm &Oslash; placas de cultivo celular&nbsp;</td><td>Nunc</td><td>&nbsp; 150679 , 150288 y 150318, respectivamente</td><td></td></tr><tr><td>Agitador magnético y barras de centrifugación magnéticas</td><td>Picadora</td> de tejidos McIlwain o similar <td></td><td></td></tr><tr>Ingeniería de laboratorio de<td>Mickle</td><td></td> Un <td></td><td></td></tr><tr><td>par de pinzas rectas finas y un par de pinzas curvas&nbsp;</td><td>Herramientas finas Instrumentos o similares</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hojas de afeitar para el picador</td><td></td><td></td><td></td>de tejidos</tr><tr><td>Bisturíes (números 15 y 11)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dos pares de espátulas finas para transferir trozos de colágeno y tejido</td><td>Herramientas finas Instrumentos o similares</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generación de hidrogeles a base de colágeno 3d para analizar el crecimiento y el comportamiento axonal durante el desarrollo del sistema nervioso

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

Este protocolo utiliza colágeno natural tipo I para generar hidrogel tridimensional (3-D) para monitorear y analizar el crecimiento axonal. El protocolo se centra en el cultivo de pequeños trozos de cerebros de roedores embrionarios o postnatales tempranos dentro de un hidrogel 3D formado por el colágeno tipo I derivado del tendón de la cola de rata con porosidad específica. Las piezas de tejido se cultivan dentro del hidrogel y se enfrentan a fragmentos cerebrales específicos o agregados celulares modificados genéticamente para producir y secretar moléculas adecuadas para crear un gradiente dentro de la matriz porosa. Los pasos de este protocolo son simples y reproducibles, pero incluyen pasos críticos a considerar cuidadosamente durante su desarrollo. Además, el comportamiento de los axons en crecimiento se puede monitorear y analizar directamente utilizando un microscopio de contraste de fase o un microscopio de fluorescencia mono/multifoto después de la fijación mediante métodos inmunocitoquímicos.

Aquí, presentamos una metodología ampliamente accesible para estudiar el crecimiento axonal en cultivos de colágeno de hidrogel 3-D del sistema nervioso de ratón embrionario. Con este fin, aislamos el colágeno de las colas de rata adultas para generar matrices tridimensionales en las que cultivamos agregados celulares modificados genéticamente expresando Netrin-1 o Sema3E confrontados con tejido neuronal embrionario (por ejemplo, región CA del hipocampo). Estos agregados celulares formaron un gradiente distribuido radial...

Aquí, proporcionamos un método para analizar el comportamiento del crecimiento de axons en matrices 3D, imitando su desarrollo natural.

Generación de hidrogeles a base de colágeno 3D para analizar el crecimiento y el comportamiento axonal durante el desarrollo del sistema nervioso

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Este método es útil para analizar el papel de algunas moléculas en la guía axonal y la migración neuronal durante el desarrollo del sistema neurológico. La principal ventaja de esta técnica es que el análisis de los resultados es rápido y sencillo y no requiere un software complejo que implicaría mucha formación para los investigadores. Demostrando el procedimiento estará Mirian Segura-Feliu, un técnico de nuestro laboratorio y yo.Para comenzar la placa 200,000 COS-1 células en platos Petri de 35 milímetros e incubar con medio de cultivo completo en una incubadora de cultivo celular con el fin de leer 70 a 80% de confluencia durante la noche. Al día siguiente, transfectar células COS-1 con el ADN codificando la molécula candidata utilizando el método de transfección basado en liposomas. Primero mezcle 250 microlitros de medio libre de suero y ADN de uno a 2 microgramos en un tubo centrífugo de 1,5 mililitros e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos.Para preparar un tubo liposomal, añadir 240 microlitros del medio libre de suero y 10 microlitros de reactivo de transfección liposomal, e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de la incubación, añadir el contenido del tubo de ADN al tubo lipsomal. Mezclar e incubar suavemente a temperatura ambiente durante 15 minutos.Sustituya el medio de las células cultivadas por 1,5 mililitros del medio libre de suero. Agregue la mezcla de liposomas de ADN lentamente y deje caer sabiamente a las células. Incubar en la incubadora de cultivo celular de dióxido de carbono durante tres horas.Después de la incubación completa, sustituya el medio por el medio de cultivo completo e incubar durante la noche en la incubadora. Al día siguiente, enjuague las células con PBS de 0,1 molares de Dulbecco. Añadir 800 microlitros de trippsina EDTA por cada plato e incubar durante cinco a 15 minutos en la incubadora de dióxido de carbono.Recoger células separadas con dos mililitros de medio de cultivo completo en un tubo centrífugo de 15 mililitros y añadir 10 mililitros del mismo medio. Centrifugar las células a cuatro grados centígrados a 130 veces g durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y conserve el pellet que contiene células COS-1 sobre hielo.Después de preparar la mezcla de trabajo de colágeno, agregue de 100 a 150 microlitros de la mezcla de colágeno al pellet de las células trans infectadas y mezcle suavemente en pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Esparce de 45 a 50 microlitros de la mezcla de pellets de células de colágeno en un plato de Petri de 35 milímetros para formar una banda uniforme de células de colágeno, de aproximadamente uno a 1,5 centímetros de largo. Coloque el plato en la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono hasta que se observe la geleración.Preparar una segunda tira que contenga células de control en un segundo plato de cultivo y colocarla en la incubadora. Cuando se complete la geleración, añada de tres a cuatro mililitros de medio de cultivo completo COS-1 calentado de 37 grados centígrados a cada plato que contenga las tiras de células de colágeno gelificadas y colóquelas en la incubadora. Utilice un bisturí fino o un helicóptero de tejido para cortar las tiras celulares de colágeno para generar piezas cuadradas pequeñas, de 400 a 500 micrómetros de longitud.Transfiera todas las secciones de la misma condición de transfección a un plato de Petri que contenga de tres a 3,5 mililitros de medios de cultivo neuronal. Compruebe bajo un microscopio de disección la calidad de las piezas y coloque los platos en la incubadora. Use tijeras para cortar cuernos embrionarios en el día embrionario 16.5 de la cavidad abdominal de una rata hembra embarazada sacrificada y colóquelos en un plato grande de Petri que contenga un tampón frío de HBSSg.Coloque el plato en la capucha de flujo laminar y use fórceps rectos para extraer los embriones y colóquelos en un nuevo plato que contenga HBBSg frío. Con pequeños fórceps, retire la piel, y luego con fórceps curvos y rectos, diseccione cuidadosamente el cerebro y colóquelo en un plato que contenga HBSSg frío. Bajo un microscopio diseccionando, usando un bisturí o tijeras finas, corta el cerebro por la mitad a lo largo de la línea media para separar ambos hemisferios.Luego, retire el diencéfalo y con fórceps finos, retire las meninges y los vasos sanguíneos de las piezas cerebrales. Utilice 100%etanol para limpiar todas las partes del helicóptero de tejido, especialmente la placa de corte de PTFE y la cuchilla de afeitar, y mantenga el helicóptero de tejido en la capucha de flujo laminar bajo iluminación UV durante 15 minutos. Transfiera cada pieza de tejido a la placa de corte del helicóptero de tejido.Después de cortar el tejido, transfiera las piezas de los platos Petri de 35 milímetros llenos de tres a cuatro mililitros de NCM completo. Usando agujas finas de tungsteno, termine la disección de tejido en NCM completo. Compruebe la calidad de las rebanadas obtenidas bajo el microscopio de disección, asegurándose de que las capas son claramente identificables en la óptica de campo oscuro y disecciona la región de interés con agujas de tungsteno.Conservar las piezas de buena calidad en un medio NCM completo en la incubadora de dióxido de carbono. La demostración visual es fundamental en los pasos relacionados con la preparación de las co-culturas que facilita las palabras para entender el proceso. Coloque varias placas estériles de cultivo de cuatro pozos en la campana de flujo laminar y prepare una mezcla de trabajo de colágeno como anteriormente.Añadir de 15 a 20 microlitros de la mezcla de hidrogel en la parte inferior de cada pozo para producir una base circular de colágeno. Coloque los platos en la incubadora hasta que se observe la geleración completa. Y comprobar la calidad del colágeno gelizado.Con una pipeta, transfiera un pequeño trozo de agregado de celda COS-1 a la base del hidrogel, luego use una pipeta para colocar una pieza de tejido en la misma base, cerca de la pieza de las células agregadas a una distancia de un tamaño de explant. Después de preparar una nueva mezcla de colágeno en hielo, pipetee suavemente 15 a 20 microlitros de esta nueva mezcla para cubrir el explant y el agregado celular, haciendo un sándwich como el cultivo de hidrogel. Utilice una aguja de tungsteno fino para reorientar el explant para que se enfrente al agregado celular en 500 a 600 micrómetros.Devolver la placa a la incubadora hasta que se observe la gelificación y luego añadir 0,5 mililitros de NCM completo complementado con 2%B27 suplemento y mantener los cultivos durante 36 a 48 horas en la incubadora. Cuando los axones hipocampales se enfrentaron con Netrin-1, crecieron preferentemente hacia la fuente de Netrin-1, lo que indica que Netrin-1 actúa como una molécula quimio atractiva para estos axones. En la condición de control, o transfección simulada, todos los axones crecieron radialmente, sin ninguna preferencia direccional.Cuando los axones del hipocampo se confrontaron con las células secretoras de Sema3E, la mayoría de ellos crecieron opuestos al agregado celular, lo que indica que Sema3E actúa como una molécula quimio repulsiva para estos axones. Esta representación esquemática del método de respuesta y cuantificación axonal muestra que en condiciones de control, los axones se distribuyeron equitativamente en cuadrantes proximales y distales, mostrados con crecimiento radial. Esto indicaba una relación distal o PD proximal de uno.Cuando los explantes mostraron un mayor número de axones en el cuadrante proximal en comparación con el distal, lo que indica que la atracción de quimio, la proporción de DP fue mayor que una. Cuando el número de axones era mayor en el cuadrante distal que en el proximal, lo que indica la repulsión de quimio, la relación de DP era menor que una. Siguiendo este método, los investigadores pueden obtener información esencial sobre el papel de algunas moléculas durante el desarrollo neuronal, lo que nos permite establecer un punto de partida para explorar más a fondo las funciones.Aunque esta técnica es útil en el desarrollo neuronal como esto, también podría aplicarse en el cribado farmacológico, angiogénesis, e ingeniería de tejidos como estrategias.

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Este video muestra un método para generar andamios de astrocitos tridimensionales dentro de microcolumnas de hidrogel. El interior de las microcolumnas está recubierto de colágeno. Se introducen astrocitos, que se adhieren al colágeno y, con una incubación posterior, se autoensamblan en un andamio tridimensional.

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En este trabajo, presentamos una técnica para la fabricación rápida de tejidos vasculares vivos mediante el cultivo directo de colágeno, células musculares lisas y células endoteliales. Además, se describe un nuevo protocolo para la caracterización mecánica de tejidos vasculares artificiales.

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La comprensión de las complejas acciones del cerebro requiere herramientas de investigación avanzadas. Aquí demostramos un novedoso modelo de ingeniería 3D basado en colágeno de seda de tejido neuronal que se asemeja a una arquitectura similar a la del cerebro. El modelo se puede utilizar para estudiar el ensamblaje de redes neuronales, la guía axonal, las interacciones célula-célula y la actividad eléctrica.

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El colágeno es un componente central de la ECM, y proporciona indicaciones esenciales para varios procesos celulares que van desde la migración a la diferenciación y la proliferación. Aquí se incluye es un protocolo para la incorporación de las células dentro de los hidrogeles de colágeno en 3D, y una técnica más avanzada para la generación de matrices de colágeno aleatorios o alineados utilizando PDMS microcanales.

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Nos muestra el desarrollo de los paquetes uno mismo-montado, tridimensionales de somata astrocytic longitudinalmente alineado y procesos dentro de un protector nuevo biomaterial. Estos diseñados "andamios de vida", que diámetro de la escala del micrón pero extiende centímetros de longitud, puede servir como bancos de pruebas para estudiar los mecanismos del desarrollo neurológico o facilitar la Neurorregeneración por dirige la migración neuronal y axonal pathfinding.

Ingeniería tisular tridimensional alineado astrositos redes para recapitular los mecanismos del desarrollo y facilitar la regeneración del sistema nervioso

Adjunto, presentamos un protocolo para el cultivo 3D de rata células glia derivado del cerebro, incluyendo astrocitos, microglia y oligodendrocitos. Demostramos cultivo celular primario, síntesis de hidrogel desarrolla el ácido hialurónico (HAMA), encapsulación HAMAphoto-polimerización y de la célula y muestra de procesamiento para la proyección de imagen microscópica electrónica de barrido y confocal.

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Generación de hidrogeles a base de colágeno 3D para analizar el crecimiento y el comportamiento axonal durante el desarrollo del sistema nervioso (Video) | JoVE Journal

Generación de hidrogeles a base de colágeno 3D para analizar el crecimiento y el comportamiento axonal durante el desarrollo del sistema nervioso

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