Name: Combinación de análisis de SDS-página no-reducción y reticulación química para detectar complejos multiméricos estabilizados por enlaces de disulfuro en células de mamíferos en la cultura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Aprenda a detectar complejos multiméricos estabilizados por enlaces disulfuro en células de mamífero mediante SDS-PAGE no reductora y reticulación química. Este método rápido y económico facilita el análisis de interacciones proteicas.

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Agradecemos gratamente los esfuerzos realizados por la Dra. Jennifer Fischer para la purificación del anticuerpo policlonales de dUTPase y Kerri ciccaglione por todos sus esfuerzos para ayudar a editar este manuscrito. Esta investigación fue apoyada parcialmente por una subvención de la Fundación de salud de Nueva Jersey (Grant #PC 11-18).

1. bloqueo de residuos de cisteína libre usando Iodoacetamida
<ol><li>Crecer células U-2 OS en un 6 cm2 plato a 50% – 60% confluencia en medio esencial mínimo con alta glucosa que contiene 10% suero bovino fetal y 1% piruvato sódico a 37 ° c en 5% Co2.</li>
	<li>Haga un caldo fresco de iodoacetamida de 10 mM justo antes de su uso, luego deseche cualquier reactivo no utilizado.</li>
	<li>Añadir 0,1 mM de concentración final iodoacetamida directamente al medio de cultivo celular. Rocía suavemente el plato a temperatura ambiente durante 2 min.</li>
</ol>2. cosechar las células
<ol><li>Aspiran los medios de las células.</li>
	<li>Lave tres veces las células con 5 mL de solución salina con tampón de fosfato frío (PBS). Aspirar la solución final de lavado PBS y luego añadir 1 mL de PBS frío.</li>
	<li>Raspe las células de la parte inferior del plato usando un raspador celular. El uso de una pipetas de 1 mL extraerá el PBS y la suspensión celular y dispensará todo el líquido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
	<li>Gire las células a 7.500 x g durante tres minutos a 4 ° c. Aspiran el PBS, dejando el pellet de células detrás. El pellet de células se puede almacenar a-80 ° c hasta el procesamiento</li>
</ol>3. extracción de proteína
<ol><li>Preparar 100 μL de un tampón de lisis 1x diluido en ddH2O (ver tabla de materiales). Agregar fluoruro de fenilmetilsulfonyl (PMSF) inmediatamente antes de su uso a una concentración final de 1 mM.</li>
	<li>Añadir 50 μL del tampón de lisis 1x directamente al pellet de células y suspender. Incubar esto sobre hielo durante 5 min.</li>
	<li>Sonicar para 8 s utilizando el modo de pulso constante en 40% (ver tabla de materiales para el sonicador; ajustar según sea necesario para diferentes sonicadores), manteniendo el extracto en hielo.</li>
	<li>Gire el extracto a 4 ° c durante 5 min a 16.000 x g. El sobrenadante es la fracción de proteína soluble. El análisis de Bradford se puede realizar para determinar la concentración de proteína si se desea.</li>
</ol>4. preparación de la muestra
<ol><li>Tomar 10 μL del extracto proteico soluble y añadir 10 μL de un tampón 1x Laemmli SDS-muestra (4% SDS, 20% glicerol, 0,004% azul de bromofenol, y 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8). No agregue reactivos reductores.</li>
	<li>Mantenga las muestras en hielo si el análisis de la página SDS se realizará ese día; para almacenamiento a largo plazo,-20 ° c es apropiado. Justo antes de ejecutar el gel, calentar la muestra durante 5 min a 85 ° c.</li>
</ol>5. en vivo formaldehído reticulación de proteínas endógenas en U-2 OS células
<ol><li>Crezca las células del SO U-2 en un matraz de 175 cm2 a 70% – 80% de confluencia (ver sección 1).</li>
	<li>
Realizar la reacción de reticulación de formaldehído
	<ol>
<li>En una campana de humo, alícuota una solución de formaldehído 37% comprada de fuentes comerciales. Añadir el fijador de formaldehído directamente al medio a una concentración final del 1% e incubar a temperatura ambiente con agitación suave durante 15 min.</li>
		<li>Para saciar la reacción, añadir 1,25 M de glicina a una concentración final de 0,125 M e incubar a temperatura ambiente con agitación suave en un balancín durante 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavar las células con 5 mL de PBS frío tres veces. Aspirar la solución final de lavado PBS y añadir 10 mL de PBS. Raspar las células de la parte inferior del matraz con un raspador celular.</li>
	<li>Utilizando una Piera de 10 mL, elabore el PBS y la suspensión celular y dispense todo el líquido en un tubo de centrífuga cónica de 15 mL. Gire las células a 500 x g durante 2 min a 4 ° c. Aspiran el PBS, dejando el pellet de células detrás.</li>
</ol>6. fraccionamiento de núcleos
<ol><li>Preparar 10 mL de tampón de homogeneización: 0,25 M sacarosa, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, y 0,5% BSA a pH 7,4. Añadir PMSF inmediatamente antes de su uso a una concentración final de 1 mM y 3mL de tampón de suspensión de núcleos (0,1% Triton X-100 en PBS).</li>
	<li>Añadir 5 mL de tampón de homogeneización directamente al pellet de células y suspender por completo. Centrifugar la suspensión a 500 x g durante 2 min a 4 ° c y desechar el sobrenadante.</li>
	<li>Suspender el pellet en 5 mL de tampón de homogeneización. Utilice un homogeneizador de vidrio-teflón ceñido, las células de homogenizar de la Dounce a 10 golpes/500 rpm.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión a 1.500 x g durante 10 min a 4 ° c, luego deseche el sobrenadante. Nota: Utilice el sobrenadante para el aislamiento de las mitocondrias centrifugando a 10.000 x g durante 10 min.</li>
	<li>Suspender el pellet en tampón de suspensión de núcleos de 1 ml e incubar sobre hielo durante 10 min.</li>
	<li>Centrifugar a 600 x g durante 10 min desechar el sobrenadante.</li>
	<li>Suspender el pellet en 1 mL de tampón de suspensión de núcleos y centrifugar de nuevo. Deseche el sobrenadante. El pellet final será núcleos aislados.</li>
</ol>7. extracción de proteína
<ol><li>Repetir la sección 4, excepto añadir 25 μL del tampón de lisis 1x directamente al pellet de la célula y luego suspenderlo.</li>
</ol>8. preparación de la muestra
<ol><li>Preparar dos muestras para la SDS-página tomando 10 μL cada uno del extracto de proteína soluble y añadir 10 μL de 2x Laemmli SDS-muestra tampón y 1 μL de 2-Mercaptoetanol (BME).</li>
	<li>Calentar una muestra durante 5 min a 37 ° c y la segunda muestra durante 15 min a 98 ° c para revertir el enlace cruzado de formaldehído.</li>
</ol>9. Análisis de SDS-PAGE
<ol><li>Prepare 1 L de 1x Tris-tampón de correr glicina (Tris 25 mM, 192 mM glicina, 0,1% (p/v) SDS).</li>
	<li>
Configure el aparato de ejecución SDS-PAGE. Nota: este protocolo utiliza un 16% preast TGX SDS-PAGE. Cabe destacar que cualquier porcentaje de gel se puede utilizar.<ol>
<li>Por el protocolo del fabricante, abra el paquete en el que se almacena el gel y extraiga el cassette.</li>
		<li>Retire el peine que está alineando los pozos y la cinta de la parte inferior del cassette.</li>
		<li>Coloque el gel en el aparato corriente.</li>
		<li>Llene la cámara con el amortiguador de corriente 1x hasta que los pozos estén sumergidos en líquido. Con un Pipet de plástico, enjuague los pozos con el tampón de correr.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cargue las muestras en el gel junto con 10 μL de marcador estándar preactivado.</li>
	<li>Ejecutar el gel a 200 V hasta que el frente de tinte es de aproximadamente 1 cm de la parte inferior del gel.</li>
</ol>10. Western Blot
<ol><li>Prepare 1 L de buffer de transferencia 1x (Tris de 25 mM, 192 mM de glicina, 20% de metanol) y almacene a 4 ° c hasta su uso.</li>
	<li>Retire con cuidado el gel y abra el cassette. Con una cuchilla de afeitar, corte y deseche cuidadosamente el gel de apilamiento. Coge el gel usando una esquina y colócalo en una bandeja con tampón de transferencia, permitiendo que se rocía suavemente durante 5 min.</li>
	<li>Mientras el gel está balanceando, coloque un bloque de hielo (almacenado en-20 ° c) en el tanque de transferencia y agregue el búfer de transferencia a 3/4 lleno.</li>
	<li>Humedezca la membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) remojando el 100% de metanol durante 30 s.</li>
	<li>Una vez pasados los 5 min, prepárese para configurar la transferencia en una bandeja con búfer de transferencia. El búfer de transferencia debe ser suficiente para sumergir completamente la mancha. Configure la transferencia de la mancha de la siguiente manera: en la parte inferior, la parte inferior del soporte del cassette (negro); luego una esponja gruesa, papel de engorde extra grueso, el gel de poliacrilamida, una membrana de PVDF, papel secante extra grueso, y una esponja gruesa; a continuación, finalmente, la parte superior del soporte de cassette (blanco) en la parte superior.</li>
	<li>Bloquee el cassette y coloque la unidad en el tanque de transferencia con la membrana PVDF hacia el ánodo positivo y el gel hacia el negativo. Tapa la unidad con búfer de transferencia hasta que la transferencia esté completamente sumergida.</li>
	<li>Coloque la unidad encima de una placa de agitación. Agregue una barra de agitación a la unidad y empiece a agitar a 125 rpm.</li>
	<li>Ejecutar a 100 V para 60 min.</li>
	<li>Mientras se está ejecutando la transferencia, prepare una solución de 5% de leche en polvo disuelta en la solución salina tamponada Tris, con Tween-20, pH 7,5 (TBST).</li>
	<li>Desmontar la unidad y retirar la membrana, señalando que lado estaba en contacto con el gel; Asegúrese de que este lado permanezca en la bandeja para los pasos restantes.</li>
	<li>Sumergir la membrana durante 2 min en solución salina tamponada Tris (TBS) seguida de bloqueo de la membrana incubando en 5 mL de solución de leche-TBST al 5% durante 30 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Sustituir la leche con 4 mL de solución de leche-TBST al 5% y añadir el anticuerpo primario en la dilución adecuada (en este caso, nuestra dilución es 1:2000 para el anticuerpo dUTPase) e incubar durante la noche con balanceo suave a 4 ° c.</li>
	<li>Al día siguiente, retire la mancha del Rocker de 4 ° c a un balancín de temperatura ambiente, desechando la solución de anticuerpos primarios.</li>
	<li>Haga tres lavados rápidos con TBST, utilizando suficiente líquido para sumergir completamente la mancha, seguida de 3 lavados, 5 min cada uno, balanceándose lentamente.</li>
	<li>Después del último lavado, añadir 5 mL de la solución de 5% de leche-TBST y rocía la mancha durante 15 min y luego desechar.</li>
	<li>Añadir anticuerpo secundario diluido en 5% Milk-TBST a la concentración deseada. (En este caso, 1:5000 dilución de cabra anti-conejo diluido en 5 mL de 5% de solución de leche-TBST)</li>
	<li>Incubar a temperatura ambiente, balanceando durante 1 h, luego deseche la solución.</li>
	<li>Haga tres lavados rápidos con TBST seguidos de 3 lavados, 5 min cada uno, balanceándose lentamente, luego deseche el lavado final y añada 5 mL de TBS.</li>
	<li>Prepare una mezcla de 1:1 de una solución de detección quimiluminiscente ECL (1 mL de cada reactivo para un volumen final de 2 mL) y añádela directamente a la mancha incubando durante 1 min.</li>
	<li>Retire la membrana usando pinzas y frote la esquina con una toallita de laboratorio, eliminando cualquier exceso de solución. Coloque la membrana en envoltura retráctil y coloque la proteína hacia arriba en un cassette de rayos x.</li>
	<li>Exponga la membrana a la película de rayos x. El tiempo de exposición variará.</li>
</ol>

<ol><li>Klomsiri, C., Karplus, P. A., Poole, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine-based+redox+switches+in+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Cysteine-based redox switches in enzymes.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1065-1077 (2011).</li>
<li>Antelmann, H., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-based+redox+switches+and+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Thiol-based redox switches and gene regulation.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1049-1063 (2011).</li>
<li>Brandes, N., Schmitt, S., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-based+redox+switches+in+eukaryotic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Thiol-based redox switches in eukaryotic proteins.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 11 (5), 997-1014 (2009).</li>
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<li>Gorman, J. J., Wallis, T. P., Pitt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+disulfide+bond+determination+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Protein disulfide bond determination by mass spectrometry.</a> Mass Spectrometry Reviews. 21 (3), 183-216 (2002).</li>
<li>Li, X., Yang, X., Hoang, V., Liu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Protein+Disulfide+Linkages+by+MS+In-Source+Dissociation+Comparing+to+CID+and+ETD+Tandem+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Characterization of Protein Disulfide Linkages by MS In-Source Dissociation Comparing to CID and ETD Tandem MS.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. , (2018).</li>
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<li>Klockenbusch, C., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+formaldehyde+cross-linking+for+protein+interaction+analysis+of+non-tagged+integrin+beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 927585(2010).</li>
<li>Gavrilov, A., Razin, S. V., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+formaldehyde+cross-linking%3A+it+is+time+for+black+box+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">In vivo formaldehyde cross-linking: it is time for black box analysis.</a> Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 163-165 (2015).</li>
<li>Rotoli, S. M., Jones, J. L., Caradonna, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine+residues+contribute+to+the+dimerization+and+enzymatic+activity+of+human+nuclear+dUTP+nucleotidohydrolase+%28nDut%29%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Cysteine residues contribute to the dimerization and enzymatic activity of human nuclear dUTP nucleotidohydrolase (nDut).</a> Protein Science. , (2018).</li>
<li>Caradonna, S., Muller-Weeks, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+of+enzymes+involved+in+uracil-DNA+repair%3A+isoform+characteristics+of+proteins+responsible+for+nuclear+and+mitochondrial+genomic+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protein+and+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">The nature of enzymes involved in uracil-DNA repair: isoform characteristics of proteins responsible for nuclear and mitochondrial genomic integrity.</a> Current Protein and Peptide Science. 2 (4), 335-347 (2001).</li>
<li>Macpherson, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noxious+compounds+activate+TRPA1+ion+channels+through+covalent+modification+of+cysteines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Noxious compounds activate TRPA1 ion channels through covalent modification of cysteines.</a> Nature. 445 (7127), 541-545 (2007).</li>
<li>Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation (ChIP).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen conflictos de interés con el contenido de este manuscrito.

El método descrito aquí da un protocolo recto para el análisis de complejos multiméricos estabilizados a través de enlaces de disulfuro. Este protocolo se puede adaptar fácilmente a otras líneas de cultivo celular, tejidos y organismos que permiten una amplia gama de aplicaciones.
Un paso importante en este procedimiento es garantizar que los enlaces de disulfuro no sean una consecuencia del procedimiento de extracción. Cualquier residuo de cisteína libre puede ser bloqueado usando iodoacetami...

Durante mucho tiempo se ha sabido que los vínculos de disulfuro estabilizan la estructura de muchas proteínas. En los trabajos recientes, este lazo también se ha clasificado como una modificación post-translacional reversible, actuando como un "interruptor redox" basado en la cisteína que permite la modulación de la función de la proteína, ubicación e interacción1,2, 3,4. Por lo tanto, es importante poder estudiar esta modificación. Un método simple para analizar estos complejos multiméricos de la cisteína estabilizada es a través de análisis de SDS-PAGE no-reducción5. El análisis de SDS-PAGE es una técnica utilizada en muchos laboratorios, donde los resultados se pueden obtener e interpretar de forma rápida, fácil y con costos mínimos, y es ventajoso sobre otras técnicas utilizadas para identificar enlaces de disulfuro como la espectrometría de masas6 ,7 y dicroísmo circular8.
Un paso importante para determinar si este método es una técnica apropiada para ayudar en un estudio es examinar a fondo la secuencia primaria de la proteína de interés para asegurar que hay residuos de cisteína presentes. Otro paso útil es investigar cualquier estructura cristalina anterior publicada o utilizar una aplicación de bioinformática para explorar las tres estructuras dimensionales de la proteína de interés para visualizar donde pueden estar localizados los residuos de cisteína. Si el residuo (s) está presente en la superficie exterior puede ser un mejor candidato para formar un enlace de disulfuro en lugar de un residuo de cisteína enterrado en el interior de la estructura. Sin embargo, es importante tener en cuenta que las proteínas pueden someterse a cambios estructurales en las interacciones de sustrato o interacciones proteína-proteína permitiendo que estos residuos a continuación, se exponen al medio ambiente, así.
Los complejos multiméricos identificados se pueden verificar con la reticulación química utilizando formaldehído. El formaldehído es un enlace cruzado ideal para esta técnica de verificación debido a la alta permeabilidad de las células y a la corta distancia cruzada de ~ 2-3 Å, asegurando la detección de interacciones proteína-proteína específicas9,10. Aquí, este método se ilustra mediante el análisis de la isoforma nuclear de dUTPase de la línea de células osteosarcoma ósea humana U-2 OS11. Sin embargo, este protocolo puede ser adaptado para otras líneas celulares, tejidos y organismos.

<table><tbody><tr><td>16% geles prefabricados TGX</td><td>ThermoFisher</td><td>Xp00160</td><td></td></tr><tr><td>175 cm2 Frasco</td><td>Cell estrella</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>18CO</td><td>ATCC</td><td>CRL-1459</td><td></td></tr><tr><td>6 cm2 plato</td><td>VWR</td><td>10861-588</td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Kit de detección ECL</td><td>GE</td><td></td><td></td>16817200</tr><tr><td>Aparato de transferencia Blot</td><td>Biorad</td><td>153BR76789</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo proteico Bradford</td><td>Biorad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Azul</td><td></td><td></td><td></td>de bromofenol</tr><tr><td>BSA</td><td>Señalización celular</td><td>99985</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisis celular</td><td>Señalización celular</td><td>9803</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendor</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Taladro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M101</td><td></td></tr><tr><td>Aparato de electroforesis</td><td>Invitrogen</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>Papel secante occidental extra grueso</td><td>ThermoFisher</td><td>88610</td><td></td></tr><tr><td>Fetal suero bovino</td><td>Gibco</td><td>1932693</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>ThermoFisher</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador</td><td></td><td></td><td></td>de vidrio y teflón</tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>65516</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>RPI</td><td>636050</td><td></td></tr><tr><td>Bloque de calor</td><td>Denville</td><td>10285-D</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0527</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>VWR</td><td>2018010431</td><td></td></tr><tr><td>Yodoacetamida</td><td>ThermoFisher</td><td>90034</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Pharmco</td><td>339000000</td><td></td></tr><tr><td>Leche en polvo desnatada</td><td>Señalización celular</td><td>99995</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>329-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Posi-click</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de alimentación</td><td>Biorad</td><td>200120</td><td></td></tr><tr><td>Rotulador prestained</td><td>ThermoFisher</td><td>26619</td><td></td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Biorad</td><td>162-0177</td><td></td></tr><tr><td>Rocker</td><td>Reliable Scientific</td><td>55</td><td></td></tr><tr><td>Saos2</td><td>ATCC</td><td>HTB-85</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Biorad</td><td>161-0302</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario</td><td>Señalización celular</td><td>70748</td><td></td></tr><tr><td>Rascador de células pequeñas</td><td>Tygon</td><td>S-50HL clase VI</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>RPI</td><td>S23020</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>450</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla de esponja para secante</td><td>Invitrogen</td><td>E19051</td><td></td></tr><tr><td>Placa de agitación</td><td>Corning</td><td>PC353</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-1888</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>RPI</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>Tris Solución salina tamponada, con Tween 20, pH 7.5</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SRE0031</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de funcionamiento Tris-Glycine</td><td>VWR</td><td>J61006</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>U-2 OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>Película de rayos X</td><td>ThermoFisher</td><td>34090</td><td></td></tr></tbody></table>

combinación de análisis de sds-página no-reducción y reticulación química para detectar complejos multiméricos estabilizados por enlaces de disulfuro en células de mamíferos en la cultura

Combining Non-reducing SDS-PAGE Analysis and Chemical Crosslinking to Detect Multimeric Complexes Stabilized by Disulfide Linkages in Mammalian Cells in Culture

Las estructuras de muchas proteínas se estabilizan a través de enlaces de disulfuro covalente. En los trabajos recientes, este vínculo también se ha clasificado como una modificación post-translacional. Por lo tanto, es importante poder estudiar esta modificación en las células vivas. Un método simple para analizar estos complejos multiméricos de la cisteína estabilizada es a través de un método de dos pasos de no reducir el análisis de SDS-PAGE y la reticulación de formaldehído. Este método de dos pasos es ventajoso como el primer paso para descubrir complejos multiméricos estabilizados por enlaces de disulfuro debido a su facilidad técnica y bajo costo de operación. Aquí, la línea de células osteosarcoma ósea humana U-2 OS se utiliza para ilustrar este método mediante el análisis específico de la isoforma nuclear de dUTPase.

Nuclear dUTPase forma un varillaje de disulfuro intermoleculares formando una configuración de dímero estable a través de la interacción de dos residuos de cisteína colocados en el tercer aminoácido de cada proteína monomérica11. Esto se demuestra en la figura 1A, B. Para garantizar que esta vinculación de disulfuro no era una interacción no específica debido a anomalías en la migración en el entorno no reducido, la in...

Durante mucho tiempo se ha sabido que los vínculos de disulfuro estabilizan la estructura de muchas proteínas. Un método simple para analizar complejos multiméricos estabilizados por estos vínculos es mediante el análisis de SDS-PAGE no reductor. Aquí, este método se ilustra mediante el análisis de la isoforma nuclear de dUTPase de la línea de células de osteosarcoma ósea humana U-2 OS.

Combinación de análisis de SDS-página no-reducción y reticulación química para detectar complejos multiméricos estabilizados por enlaces de disulfuro en células de mamíferos en la cultura

The structures of many proteins are stabilized through covalent disulfide linkages. In recent work, this bond has also been classified as a ...

Se ha establecido que las estructuras de muchas proteínas se estabilizan en enlaces de disulfuro covalente. En trabajos recientes, este bono se ha clasificado como una modificación post-traduccional. Por lo tanto, es importante ser capaz de identificar complejos multimer estabilizados con cisteína en células vivas usando un método que sea rápido y simple.La principal ventaja de esta técnica es que los resultados se pueden obtener e interpretar de forma rápida, fácil y con un coste mínimo. Para empezar, cultiva células U-2 OS en un plato de seis centímetros cuadrados en Nivel Esencial De Glucosa Media Alta, complementada con 10%FBS y 1%piruvato sódico a 37 grados Celsius en 5%dióxido de carbono. Haga un nuevo stock de 10 iodoacetamida milimétricas justo antes de su uso.Después de que las células alcancen 50 a 60%confluencia, agregue 0,1 iodoacetamida de concentración final milimolar directamente al medio de cultivo celular. Mece suavemente el plato a temperatura ambiente durante dos minutos. A continuación, aspirar los medios de las células, y lavar las células con cinco mililitros de PBS frío tres veces.Aspirar la solución final de lavado PBS y añadir un mililitros de PBS frío. Raspa las células de la parte inferior del plato usando un rascador de células. Usando una pipeta de un mililitro, extraiga el PBS y la suspensión celular y dispense todo el líquido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.Gire las células a 7.500 veces g en cuatro grados Centígrados durante tres minutos. Aspirar el PBS dejando atrás el gránulo celular. El pellet celular se puede almacenar a menos 80 grados Celsius hasta su procesamiento.Para extraer la proteína, prepare 100 microlitros de un tampón de lisis 1X diluido en agua doble destilada. Añadir PMSF inmediatamente antes de su uso a una concentración final de un milimolar. A continuación, agregue 50 microlitros del búfer de lisis 1X directamente al pellet celular y vuelva a suspender.Incubar el extracto sobre hielo durante cinco minutos. Sonicar durante ocho segundos usando el modo de pulso constante en 40%manteniendo el extracto en hielo. Gire el extracto a cuatro grados centígrados y 16.000 veces g durante cinco minutos.Realice el análisis de Bradford para determinar la concentración de proteínas si se desea. Para preparar la muestra, tome 10 microlitros del extracto de proteína soluble y añada 10 microlitros de un tampón de muestra 1X Laemmli SDS. Mantenga las muestras en hielo.Caliente la muestra a 85 grados centígrados durante cinco minutos antes de ejecutar el gel. Para comenzar la reticulación de formaldehído, haga crecer las células del sistema operativo U-2 en un matraz de 175 centímetros cuadrados a 70 a 80% de confluencia. En una campana de humo añadir el fijador de formaldehído directamente al medio a una concentración final del 1% e incubar a temperatura ambiente con agitación suave durante 15 minutos.Para apagar la reacción añadir 1,25 glicina molar a una concentración final de 0.125 molares e incubar a temperatura ambiente con agitación suave en un balancín durante cinco minutos. Lavar las células con cinco mililitros de PBS frío tres veces. Aspirar la solución final de lavado PBS y añadir 10 mililitros de PBS.Raspa las células de la parte inferior del matraz usando un rascador de células. Usando una pipeta de 10 mililitros, extraiga el PBS y la suspensión celular y dispense todo el líquido en un tubo de centrífuga cónica de 15 mililitros. Gire las células a 500 veces g y cuatro grados Celsius durante dos minutos.Aspirar el PBS dejando atrás el gránulo celular. Preparar 10 mililitros del tampón de homogeneización añadiendo 0,25 sacarosas molares, una EDTA milimétrica, 10 HEPES mililolares y 0,5%BSA a pH 7,4. Inmediatamente antes de su uso, agregue PMSF a una concentración final de un milimolar y tres mililitros del tampón de suspensión de núcleos.Añadir cinco mililitros del buffer de homogeneización directamente al pellet celular y resuspend completamente. Centrifugar la suspensión a 500 veces g y cuatro grados centígrados durante dos minutos. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y resusppend el pellet en cinco mililitros del tampón de homogeneización.Luego, con un vidrio ajustado Teflon homogeneizador dounce homogeneizar las células a 10 golpes por 500 RPM y centrifugar la suspensión a 1.500 veces g y cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante. Resuspender el pellet en un mililitro del tampón de suspensión de núcleos e incubar en hielo durante 10 minutos.Después de la incubación, centrifugar a 600 veces g durante 10 minutos. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante, resuspender el pellet en un mililitro del tampón de suspensión de núcleos y centrifugar de nuevo. El pellet final serán los núcleos aislados.Extraiga las proteínas como se describe antes de agregar 25 microlitros del tampón de lisis 1X directamente al pellet celular. A continuación, prepare dos muestras para SDS PAGE tomando 10 microlitros cada uno del extracto de proteína soluble y agregue 10 microlitros de tampón de muestra 2X Laemmli SDS y un microlitros de BME. Caliente una muestra a 37 grados centígrados durante cinco minutos y la segunda muestra a 98 grados centígrados durante 15 minutos para invertir el enlace cruzado de formaldehído.Preparar un litro de 1X Tris-glicina tampón de funcionamiento mezclando 25 tris milimétricos, 192 glicina milimolar y 0.1% de peso por volumen SD. A continuación, configure el aparato de funcionamiento SDS PAGE. Abra el paquete TGX SDS-PAGE 16% prefabricado según el protocolo del fabricante y retire el cassette. Retire el peine que está forrando los pozos y la cinta de la parte inferior del cassette y coloque el gel en el aparato de carrera.Llene la cámara con el tampón de funcionamiento 1X hasta que los pozos se sumerjan en líquido. Con una pipeta de plástico enjuague los pozos con tampón de funcionamiento. Cargue las muestras en el gel junto con 10 microlitros del marcador estándar pre-stained.Finalmente, ejecuta el gel a 200 voltios hasta que el frente del tinte esté aproximadamente a un centímetro de la parte inferior del gel. Un análisis de manchas occidentales de extractos celulares totales en ausencia de agente reductor de BME demostró una formación de complejos multiméricos en diferentes poblaciones de células humanas. El complejo desapareció con la adición de BME en las cuatro líneas celulares examinadas, lo que indica la presencia de un enlace de disulfuro.La confirmación monomérica de dUTPase en células humanas en el momento de la cosecha es una combinación de al menos tres de las isoformas de dUTPase: la isoforma mitocondrial, la isoforma nuclear y una versión truncada observada en M24. La isoforma mitocondrial utilizada como control no formó un enlace de disulfuro y migró al peso molecular previsto para la proteína monomérica. La reticulación de formaldehído de la dUTPasa nuclear demostró la formación de complejos multiméricos.Cuando el enlace cruzado se invirtió incubando la muestra a 95 grados centígrados durante 15 minutos, el complejo se desestabilizó y se pudo visualizar en su estado monomérico. La adición de iodoacetamida es un paso importante en este procedimiento para bloquear los residuos de cisteína libres y para asegurarse de que los enlaces de disulfuro no son una consecuencia del procedimiento de extracción. Es importante recordar no agregar ningún agente reductor, como BME o DDT a sus muestras SDS-PAGE, ya que estos reducirán los vínculos de disulfuro presentes en la muestra.

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