Name: Molécula pequeña comunicación entre tejidos y células mediante espectrometría de masas en la proyección de imagen de captura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Aprende a mapear la comunicación de moléculas pequeñas entre células y tejidos mediante espectrometría de masas en imagen sin etiquetas. Este método revela dianas terapéuticas en la metástasis del cáncer de ovario.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

La financiación fue proporcionada por el consorcio biomédico de Chicago con el apoyo de los fondos de Searle en el Chicago Community Trust (C-076) (L.M.S.); Universidad de Illinois en Chicago Inicio fondos (L.M.S.); Donación de 543296 de la Alianza de fondo de investigación de cáncer de ovario (M.D.); y ES029073 UG3 (J.E.B.) y por el centro nacional para avanzar traslacional Ciencias, Instituto Nacional de salud, a través de subsidio UL1TR002003 (JEB & LMS).

Todos los procedimientos animales estaban de acuerdo con directrices para los institutos nacionales de salud para el cuidado y uso de animales de laboratorio y aprobaron por el Comité institucional de Animal de uso y cuidado (IACUC) de la Universidad de Illinois en Chicago.
1. preparación de reactivos
<ol><li>Mantener células del epitelio oviducto murino (MOE) a 37° C con 5% CO2 en una incubadora humidificada en alfa medios medio esencial mínimo (αMEM) suplementados con suero bovino fetal 10% selenio (FBS), 2 mM L-glutamina, 10 mg/mL insulina, transferrina, (ITS) , ng/mL 1.8 factor de crecimiento epidérmico (EGF), 100 U/mL penicilina-estreptomicina, gentamicina 1 mg/mL y estradiol-17β 18.2 ng/mL. Pasar las células cada 3-4 días, asegurando que hay suficientes células en el mismo día los ratones serán sacrificados.</li>
	<li>1 g de agarosa de bajo punto de fusión de la mezcla con 50 mL de agua destilada para preparar agarosa al 2%. Autoclave de la agarosa, deje que se enfríe, y luego alícuota (1 mL) en 2 mL tubos (véase Tabla de materiales) antes de que solidifique la agarosa. Agarosa puede almacenarse a-20 ° C indefinidamente.</li>
	<li>Preparar por lo menos 2 mL de medio de medio (DMEM) modificado Eagle de 1 x Dulbecco.</li>
	<li>Para la matriz de MALDI-TOF MS, prepare 10 mL de 5 mg/mL 1:1 ácido de alfa-ciano-4-hyroxycinnamic (CHCA): ácido dihydroxybenzoic (DHB) (véase Tabla de materiales) en 90: 10 ACN:H2O + 0.1% de ácido trifluoroacético (TFA). Someter a ultrasonidos solución hasta que se disuelva la matriz.</li>
</ol>2. Colonia y extirpación de ovario de ratón
<ol><li>Mantener las parejas reproductoras de ratones CD-1 utilizando procedimientos estándar de la vivienda. Cerca del día del parto, revise los ratones todos los días por lo que se conoce la edad de los cachorros.</li>
	<li>Eutanasia de cachorros en 16 – 18 días de edad por la inhalación de CO2 por directrices de los NIH. Entregar el CO2 (100%) en un flujo tasa de 10% – 20% cámara de volumen por minuto y continuar durante dos minutos después había parado la respiración. Confirmar la eutanasia por dislocación cervical.</li>
	<li>Desinfecte todo el equipo quirúrgico sumergiendo en etanol al 70%. Caliente media de Leibovitz L-15 penicilina-estreptomicina de 1 x a 37 ° C.</li>
	<li>Humedezca la superficie abdominal con etanol al 70% para desinfectar la zona y minimizar la contaminación con el pelo. Sujete la piel que cubre la pared abdominal usando blunt tijeras quirúrgicas pinzas y uso para hacer una gran forma de V corta a través de la piel y pared abdominal, exponer los órganos internos.</li>
	<li>Hacia el lado con unas pinzas a los órganos internos. Individualmente agarra cada cuerno uterino con pinzas finas y levante ligeramente.</li>
	<li>Localizar el ovario, que será el final del cuerno uterino, inmediatamente por debajo de los riñones. Utilice tijeras quirúrgicas para diseccionar el ovario libre de tejido conectivo. Luego, corte el cuerno ovario en la mitad.</li>
	<li>Mover el ovario, oviducto y aproximadamente una mitad de cada cuerno uterino a medios de comunicación de L-15 precalentado de Leibovitz.</li>
	<li>Con un microscopio de disección mueva cuidadosamente cada ovario de la bursa circundante, liberándola de cualquier tejido adiposo, el oviducto y bursa. Hacia una nueva placa de los medios de comunicación L-15 de Leibovitz a cada ovario.</li>
	<li>Corte axial cada ovario en la mitad. Mantenga las piezas ováricas (ahora llamadas explantes) mantenidas a 37 ° C hasta placas de agarosa.</li>
</ol>3. puesta en funcionamiento e incubar el portaobjetos tratados con ITO Cocultures
<ol><li>
Cocultures indivisos
	<ol>
<li>Licuar la agarosa a 70 ° C en una placa caliente.</li>
		<li>Coloque el divisor 8-bien en la parte superior del tinoxide de indio (ITO)-diapositiva tratada (figura 1A). La parte inferior de goma en el divisor del SIDA en la adherencia a la diapositiva, pero no se olvide de aplicar presión continua suave durante placas de agarosa para ninguÌ n escaparse o mezcla entre pozos.</li>
		<li>Recoger las células en un tubo cónico de 15 mL, centrifugar (a 5 minutos a 800 rpm) y vuelva a suspender a 50k células por 150 μL en medios x DMEM 1. Si una densidad celular diferentes es óptima, asegúrese de que en este paso la suspensión celular es 2 x la densidad final deseada (por ejemplo, para una concentración final de 50.000 células en 300 μL, densidad celular en este paso es 50.000 células en 150 μL).</li>
		<li>Antes de platear el cultivo celular, añadir ovario explante al centro del pozo (figura 1B).</li>
		<li>Añadir agarosa a cada cultivo celular en tubos individuales 2 mL justo antes de la galjanoplastia. Para cada bien, combinar 200 μL de suspensión celular y 200 μL de agarosa licuado en un tubo de 2 mL. Por ejemplo, para los cuatro pozos, combinar 800 μl de suspensión celular y 800 μl de agarosa al 2%. Algunos mezcla quedará, pero haciendo un poco más de lo necesario evita las burbujas de aire durante el pipeteo.<ol>
<li>Añadir agarosa a cultivos celulares individuales inmediatamente antes de eso cultura de célula de la galjanoplastia. La agarosa se enfríe en menos de un minuto, así que preparados para placa rápidamente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Inmediatamente añadir 300 μL de la mezcla de agarosa/células a cada pozo (figura 1). Figura 1 muestra tres condiciones de la célula y la condición de media, que cada uno plateado con y sin un ovario.</li>
		<li>Incubar los portaobjetos a 37 ° C y 5% de CO2 en una incubadora humidificada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cocultures divididas.
	<ol>
<li>Corte los separadores de plástico delgado y liso (figura 2A). Nota: Este experimento utiliza las partes de una cuenca de medios desechables estériles porque son planas y delgadas. Cortar sólo lo suficientemente ancho como para que calcen bien en la hipotenusa del pozo (~ 13 mm).</li>
		<li>Licuar la agarosa a 70 ° C en una placa caliente.</li>
		<li>Coloque el divisor 8-bien encima de la diapositiva de ITO-tratada (figura 2B). La parte inferior de goma en el divisor del SIDA en la adherencia a la diapositiva, pero no se olvide de aplicar presión continua suave durante placas de agarosa para ninguÌ n escaparse o mezcla entre pozos.</li>
		<li>Recoger las células en un tubo cónico de 15 mL, centrifugar (a 5 minutos a 800 rpm) y vuelva a suspender a 50k células por 150 μL en medios x DMEM 1. Si una densidad celular diferentes es óptimo, asegúrese de que en este paso la suspensión celular es 2 x la densidad final deseada (por ejemplo, para una concentración final de 50.000 células en 300 μL, densidad celular en este paso es 50.000 células en 150 μL).</li>
		<li>Inserte separadores plástico diagonalmente en pozos (figura 2).</li>
		<li>Añadir agarosa a cada suspensión celular uno en un momento justo antes de la galjanoplastia. Para cada bien, mezclar 100 μl de suspensión celular y 100 μl de agarosa licuado en un tubo de 2 mL. Por ejemplo, combinan cuatro pozos, 400 μL del cultivo celular y 400 μL de agarosa al 2%. Algunos mezcla de agarosa/celular quedará pero haciendo un poco más de lo necesario evita las burbujas de aire durante el pipeteo.<ol>
<li>Añadir agarosa a cultivos celulares individuales inmediatamente antes de eso cultura de célula de la galjanoplastia. La agarosa se enfríe en menos de un minuto, así que preparados para placa rápidamente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>En un lado del divisor, placa 150 μL de mezcla de agarosa/célula. Permita que la agarosa se enfríe y solidifique (aproximadamente un minuto) y luego retire el divisor (Figura 2D).</li>
		<li>Coloque el explante de ovario en el centro de la mitad vacía del pozo. Mezcla de medios de comunicación/agarosa lugar 150 μL sobre la parte superior del ovario y sólo en el lado correcto del pozo (Figura 2E).</li>
		<li>Incubar los portaobjetos a 37 ° C y 5% de CO2 en una incubadora humidificada.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Deslice el secado y preparación para MALDI-TOF MS
<ol><li>Después de cuatro días (o cualquier punto del tiempo preferido), retire el divisor de la cámara de los tacos de agarosa y la diapositiva (figura 1). Separe suavemente los lados de la agarosa de la cámara con una espátula plana y tire suavemente la cámara hacia arriba, teniendo cuidado de no mover enchufes de agarosa. Si se mueven, suavemente resituarlos para que no toquen entre sí.</li>
	<li>Colocar el portaobjetos en un horno de 37 ° C durante aproximadamente 4 h, rotando 90 º cada h. Nota: La rotación de la diapositiva es importante para asegurar la distribución de calor uniforme a lo largo de la muestra.</li>
	<li>Una vez seco, retire la corredera del horno (Figura 1E).</li>
	<li>Aplique la solución de la matriz usando el rociador (Figura 1F), con los siguientes parámetros: temperatura = 30 ° C, flujo = 0,2 mL/min, número de pasadas = 8, dirección = CC y la distancia de la boquilla = 40 mm. Nota: En lugar de un rociador de matriz, un aerógrafo artístico puede utilizarse para aplicar matriz líquida. La misma solución de matriz puede utilizarse para rociar, pero se requiere aproximadamente dos veces más solución. Con la diapositiva con abrazadera que cuelgue verticalmente, rocíe la diapositiva desde un ángulo de 90° aproximadamente un pie de distancia (adaptado de Hoffmann15) hasta la matriz de la capa es visible.</li>
	<li>Añadir 1 μl de calibrant (fósforo rojo para objetivos < 500 Da, una mezcla de péptidos (véase Tabla de materiales) para objetivos < Da 5.000) de claro ver en diapositiva. Fósforo rojo no requiere ninguna mezcla con la matriz, pero la mezcla de péptidos requiere mezcla 1:1 con la matriz para facilitar la ionización. Espere calibrant secar.</li>
	<li>Dibujar una X con un marcador permanente en cada esquina de la diapositiva y tomar una imagen óptica con una cámara o un escáner de 1.200 ppp.</li>
</ol>5. proyección de imagen de adquisición de datos de espectrometría de masas
<ol><li>Abrir una nueva secuencia en el software de análisis de datos IMS (véase Tabla de materiales). Establecer el ancho de la trama deseada resolución espacial, por lo menos 50 μm.</li>
	<li>Cargar la imagen óptica de la diapositiva en el software de análisis y enseñan a establecer tres puntos usando las intersecciones en la x en cada esquina.</li>
	<li>Designar las regiones de interés para la proyección de imagen en el software de adquisición y el nombre les por consiguiente.</li>
	<li>Calibrar el instrumento con el software de adquisición de datos (véase Tabla de materiales) dentro de error de 5 ppm.</li>
	<li>Guarde el método optimizado y comenzar a ejecutar. Este experimento optimizado los parámetros siguientes: polaridad = positivo, Detector = Reflectron, tamaño del Laser = 2, energía del Laser = 50%, Reflector modo detector aumento = x 3.</li>
</ol>6. procesamiento de datos IMS
<ol><li>Importar archivo de .mis en software estadístico (véase Tabla de materiales) para el análisis de la significación.</li>
</ol>

<ol><li>Paine, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Reproductive+System+Non-Negative+Matrix+Factorization+Mass+Spectrometry+Imaging+of+an+Early-Stage+Ovarian+Cancer+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Whole Reproductive System Non-Negative Matrix Factorization Mass Spectrometry Imaging of an Early-Stage Ovarian Cancer Mouse Model.</a> PLoS One. 11 (5), e0154837(2016).</li>
<li>Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+Metabolic+Exchange+with+Imaging+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Translating Metabolic Exchange with Imaging Mass Spectrometry.</a> Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).</li>
<li>Li, H., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Mass+Spectrometry+of+Three-Dimensional+Cell+Culture+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Imaging Mass Spectrometry of Three-Dimensional Cell Culture Systems.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8794-8801 (2011).</li>
<li>Yang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+on+Agar-Based+Microbial+Imaging+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Primer on Agar-Based Microbial Imaging Mass Spectrometry.</a> Journal of Bacteriology. 194 (22), 6023-6028 (2012).</li>
<li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Proteomic+Profiling+of+Ovarian+Cancer+Cell+Lines+Reveals+Precursor+Cell+Associated+Proteins+and+Functional+Status%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Integrative Proteomic Profiling of Ovarian Cancer Cell Lines Reveals Precursor Cell Associated Proteins and Functional Status.</a> Nature Communications. 7, 12645(2016).</li>
<li>Labidi-Galy, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Grade+Serous+Ovarian+Carcinomas+Originate+in+the+Fallopian+Tube%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High Grade Serous Ovarian Carcinomas Originate in the Fallopian Tube.</a> Nature Communications. 8 (1), (2018).</li>
<li>Klinkebiel, D., Zhang, W., Akers, S. N., Odunsi, K., Karpf, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Methylome+Analyses+Implicate+Fallopian+Tube+Epithelia+as+the+Origin+for+High-Grade+Serous+Ovarian+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">DNA Methylome Analyses Implicate Fallopian Tube Epithelia as the Origin for High-Grade Serous Ovarian Cancer.</a> Molecular Cancer Research. 14 (9), 787-794 (2016).</li>
<li>Falconer, H., Yin, L., Gronberg, H., Altman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+Cancer+Risk+After+Salpingectomy%3A+A+Nationwide+Population-Based+Study%5BTitle%5D)+AND+%22JNCI+Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Ovarian Cancer Risk After Salpingectomy: A Nationwide Population-Based Study.</a> JNCI Journal of the National Cancer Institute. 107 (2), dju410(2015).</li>
<li>Dean, M., Davis, D. A., Burdette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+A+Stimulates+Migration+of+the+Fallopian+Tube+Epithelium%2C+an+Origin+of+High-Grade+Serous+Ovarian+Cancer%2C+through+Non-Canonical+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Activin A Stimulates Migration of the Fallopian Tube Epithelium, an Origin of High-Grade Serous Ovarian Cancer, through Non-Canonical Signaling.</a> Cancer Letters. 391, 114-124 (2017).</li>
<li>King, S. M., Burdette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+Progenitor+Cells+of+Ovarian+Cancer%3A+Analysis+of+Current+Animal+Models%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Reports%22%5BJournal%5D)">Evaluating the Progenitor Cells of Ovarian Cancer: Analysis of Current Animal Models.</a> BMB Reports. 44 (7), 435(2011).</li>
<li>Reznik, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+Metabolic+Variation+across+Tumor+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Landscape of Metabolic Variation across Tumor Types.</a> Cell Systems. 6 (3), 301-313 (2018).</li>
<li>Watkins, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Impact+of+Selective+and+Nonselective+Beta-Blockers+on+Survival+in+Patients+with+Ovarian+Cancer%3A+Beta-Blockers+and+Ovarian+Cancer+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Clinical Impact of Selective and Nonselective Beta-Blockers on Survival in Patients with Ovarian Cancer: Beta-Blockers and Ovarian Cancer Survival.</a> Cancer. 121 (19), 3444-3451 (2015).</li>
<li>Lutgendorf, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-Related+Mediators+Stimulate+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Secretion+by+Two+Ovarian+Cancer+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Stress-Related Mediators Stimulate Vascular Endothelial Growth Factor Secretion by Two Ovarian Cancer Cell Lines.</a> Clinical Cancer Research. 9 (12), 4514-4521 (2003).</li>
<li>Sood, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+Hormone-Mediated+Invasion+of+Ovarian+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Stress Hormone-Mediated Invasion of Ovarian Cancer Cells.</a> Clinical Cancer Research. 12 (2), 369-375 (2006).</li>
<li>Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+Matrix+Deposition+on+Dried+Agar+for+MALDI+Imaging+Mass+Spectrometry+of+Microbial+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+The+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Homogeneous Matrix Deposition on Dried Agar for MALDI Imaging Mass Spectrometry of Microbial Cultures.</a> Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1959-1962 (2015).</li>
<li>Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Mass+Spectrometry+Reveals+Crosstalk+between+the+Fallopian+Tube+and+the+Ovary+That+Drives+Primary+Metastasis+of+Ovarian+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">Imaging Mass Spectrometry Reveals Crosstalk between the Fallopian Tube and the Ovary That Drives Primary Metastasis of Ovarian Cancer.</a> ACS Central Science. 4 (10), 1360-1370 (2018).</li>
<li>Armaiz-Pena, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Src+Activation+by+%CE%B2-Adrenoreceptors+Is+a+Key+Switch+for+Tumour+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Src Activation by β-Adrenoreceptors Is a Key Switch for Tumour Metastasis.</a> Nature Communications. 4, 1403(2013).</li>
<li>Choi, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTERT+Mediates+Norepinephrine-Induced+Slug+Expression+and+Ovarian+Cancer+Aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">HTERT Mediates Norepinephrine-Induced Slug Expression and Ovarian Cancer Aggressiveness.</a> Oncogene. 34 (26), 3402(2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar

Hay un cuerpo creciente de evidencia que implica el papel de la norepinefrina en el HGSOC12,17,18, y esta técnica ha aportado información más mecanicista. Con al menos ocho condiciones biológicas presentes en la misma diapositiva, el método puede explicar controles biológicos tales como gene y especificidad celular así como controles de los medios de comunicación en un solo IMS. Mientras que el método fue optimizado evaluar inte...

Espectrometría de masas (IMS) de imágenes ha sido optimizada para caracterizar la distribución espacial de características moleculares en tres aplicaciones ampliamente utilizadas: rebanadas de tejido, esferoides y colonias microbianas1,2,3. Rebanadas de tejido pueden utilizarse para evaluar la localización de los metabolitos en el contexto de las condiciones biológicas en un host, ya sea dirigido o no dirigido dentro de un intervalo específico de masa. Sin embargo, las diferencias entre características moleculares son los más evidentes y significativos comparados con un tejido sano es una condición enferma, por ejemplo, un tumor. Este enfoque IMS es particularmente adaptado a la detección de biomarcadores de la enfermedad, sin embargo, adquirir muestras de tejido en etapas discretas de progresión de la enfermedad (por ejemplo, grados de tumor) impide la identificación de señales que podrían ser importantes para la iniciación de la de la enfermedad. El intercambio de información a través del espacio es una característica omnipresente de muchos sistemas biológicos, y rebanadas de tejido no pueden capturar esta dinámica química relé. Una técnica que es capaz de visualizar la difusión y el intercambio químico es IMS de microbianas colonias cultivadas en placas de agar; pequeñas moléculas son capaces de difundir a través de y en el agar y pueden ser capturadas mediante láser asistida por matriz (MALDI-TOF) de desorción/ionización espectrometría de masas4. Esta configuración de crecimiento puede utilizarse para identificar moléculas intercambiadas entre entidades biológicas discretas (colonias) y también puede determinar la direccionalidad de la producción del metabolito. La plataforma diseñada originalmente para el crecimiento de la Colonia microbiana se adaptó para explorar el metabolismo primario de explantes de tejido convertido células de mamífero, y IMS se utilizó para evaluar el intercambio químico dinámico en un sistema mamífero in vitro.
En los últimos años, ha quedado claro que el cáncer de ovario seroso de alto grado (HGSOC) a menudo se origina en el epitelio de la trompa de Falopio (FTE) y luego se extiende por metástasis al ovario durante la enfermedad temprana de desarrollo5,6, 7 , 8. la razón por la que FTE tumorigenic células propagación al ovario, donde grandes tumores eventualmente forman y hacen metástasis más, es actualmente confusa. Investigaciones anteriores se ha centrado en el papel de proteínas ováricos primaria metástasis al ovario; sin embargo, recientemente ha sido demostrado que la transición de una saludable a un tejido tumorigenic resulta en interrupción masiva del metabolismo celular y altera la producción de moléculas pequeñas9,10,11. Por lo tanto, la hipótesis de que moléculas pequeñas entre la FTE y el ovario pueden ser en parte responsables primaria metástasis de HGSOC.
Con nuestro procedimiento IMS desarrollado recientemente, hemos determinado que cocultivo de FTE tumorigenic y tejido ovárico sano induce la producción de norepinefrina desde el ovario. Sin embargo, otros tipos de la célula o células FTE normales no provocan este efecto. Un beneficio extraordinario de este método es que se pueden visualizar la producción molecular e intercambio de señales que representan moléculas reales, por lo que incluso en un cocultivo es posible determinar la fuente de una señal. Esto es una ventaja sobre el análisis de las muestras homogeneizadas, donde se pierde toda la información espacial. En nuestro sistema modelo, hemos sido capaces de asignar claramente la producción de noradrenalina al ovario. La noradrenalina se ha relacionado con la metástasis y la quimiorresistencia de cánceres ováricos, y la detección de esta molécula ha validado que el novedoso método IMS puede descubrir moléculas biológicamente relevantes12,13, 14. Esta validación nos permite proponer que esta nueva aplicación de IMS puede ser particularmente útil para grupos que están intentando identificar moléculas pequeñas en entornos de cocultivo y para entender los acontecimientos tempranos que influyen en la transformación de la célula de investigación y metástasis. El objetivo general de este método es aclarar la identidad y la distribución espacial de moléculas pequeñas durante el intercambio entre los tejidos y órganos, representados en vitro los cultivos celulares 3D o tejido vivo ex .

<table><tbody><tr><td>15 mL Tubos Falcon</td><td>Denville</td><td>C1017-O</td><td>Para recolectar células</td></tr><tr><td>Cámara de 8 pocillos (Millipore EZ-slide chamber)</td><td>Millipore</td><td>PEZGS0816</td><td>Reutilizado de Millipore Millicell EZ-slide chamber</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34998-4L</td><td>Solvente para matriz pulverizada</td></tr><tr><td>Alpha Minimum Essential Medium (&alpha; MEM)</td><td>Fisher</td><td>10-022-CV</td><td>Medios de cultivo celular</td></tr><tr><td>Velocidad Autoflex MALDI-TOF LRF</td><td>Bruker</td><td></td><td>Para el análisis de datos IMS</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>Para recoger células y eliminar el sobrenadante</td></tr><tr><td>CHCA Matrix</td><td>Bruker Daltonic</td><td></td><td>8201344 Matrix pulverizado sobre portaobjetos</td></tr><tr><td>secos DHB Matrix</td><td>Bruker Daltonic</td><td>8201346</td><td>Matrix pulverizado en portaobjetos secos</td></tr><tr><td>Bisturíes desechables</td><td>Fisher</td><td>22-079-707</td><td>Para la extracción de los ovarios</td></tr><tr><td>Tijeras de disección</td><td>Fisher</td><td>13-804-6</td><td>Para la extracción de los ovarios</td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Medios mezclados con</td></tr><tr><td>agarosa factor de crecimiento epidérmico</td><td>Peprotech Inc.</td><td>100-15</td><td>Suplemento de medios de cultivo celular</td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-282</td><td>Para alícuotas de agarosa</td></tr><tr><td>Estradiol-17 y beta;</td><td>Simga-Aldrich</td><td>E2758</td><td>Suplemento de medios de cultivo celular</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Denville</td><td>fb5001</td><td>Suplemento de medios de cultivo celular</td></tr><tr><td>FlexControl 3.4</td><td>Bruker Daltonic</td><td></td><td>software de adquisición de datos IMS</td></tr><tr><td>FlexImaging 4.1</td><td>Bruker Daltonic</td><td></td><td>IMS software de análisis de datos</td></tr><tr><td>Pinzas (fina)</td><td>Fsiher</td><td>22-327379</td><td>Para la extracción de la </td></tr><tr><td>ovarios Gentamicina</td><td>Cellgro</td><td>30-005-CR</td><td>Suplemento de medios de cultivo celular</td></tr><tr><td>Insulina, Transferrina, Selenio (ITS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11074547001</td><td>Suplemento de medios de cultivo celular</td></tr><tr><td>portaobjetos recubierto de ITO</td><td>Bruker</td><td>8237001</td><td>Plataforma para la incubación de cocultivo</td></tr><tr><td>Medio L-15 de Leibovitz</td><td>Gibco</td><td>11415064</td><td>medios utilizados durante el tejido disección</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-081 Suplemento de medios de</td><td>cultivo celular</td></tr><tr><td>Agarosa de bajo punto de fusión</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414-10G</td><td>Mezclado con medios para el recubrimiento</td></tr><tr><td>Cuenca</td><td>de medios Corning</td><td>4870</td><td>Se utiliza para cortar divisores de plástico para cámaras divididas</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122 Suplemento</td><td></td></tr> <tr><td>de medios de cultivo celularEstándar de calibración de péptidos</td><td>Bruker Daltonic</td><td>8206195</td><td>Calibrante para rango de masa medio</td></tr><tr><td>Rojo de fóforo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>343-242-5G</td><td>Calibrante para rango de masa baja</td></tr><tr><td>SCiLS Lab 2015 Bruker</td><td>Daltonic</td><td></td><td>Análisis estadístico de datos IMS</td></tr><tr><td>Pinza quirúrgica (roma)</td><td>Fisher</td><td>08-875-8B</td><td>Para la extirpación de los ovarios</td></tr><tr><td>TFA</td><td>Fisher Tecnologías</td><td>A116-50</td><td>Añadido a la solución de matriz</td></tr><tr><td>TM Pulverizador</td><td>HTX Tecnologías</td><td></td><td>Para la aplicación de matriz</td></tr></tbody></table>

molécula pequeña comunicación entre tejidos y células mediante espectrometría de masas en la proyección de imagen de captura

Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

Espectrometría de masas (IMS) la proyección de imagen rutinaria se ha aplicado a tres tipos de muestras: tejido, esferoides y colonias microbianas. Estos tipos de muestras se han analizado mediante láser asistida por matriz de desorción/ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF MS) para visualizar la distribución de las proteínas, lípidos y metabolitos en muestras biológicas de interés. Hemos desarrollado un método de preparación de la novela muestra que combina las ventajas de las tres aplicaciones anteriores para abordar un enfoque underexplored para la identificación de comunicación química en cáncer, por la siembra de cultivos de células mamíferas en agarosa en cocultivo con tejidos sanos, seguidos de desecación de la muestra. Las células y tejidos de mamíferos son morfología en proximidad cercana, permitiendo la comunicación química a través de la difusión entre el tejido y las células. En momentos específicos, se seca la muestra basado en la agarosa de la misma manera que las colonias microbianas preparado para el análisis IMS. Nuestro método se desarrolló para modelar la comunicación entre el cáncer de ovario seroso de alto grado derivada de la trompa de Falopio como interactúa con el ovario durante la metástasis. Optimización de la preparación de la muestra dio como resultado la identificación de la noradrenalina como un componente clave de la química en el microambiente ovárico. Este nuevo método puede aplicarse a otros sistemas biológicos que requieren una comprensión de la comunicación química entre las células adyacentes o los tejidos.

Una óptimo secada diapositiva ITO tendrá como resultado una plana muestra desecada con mínimo sin arrugas en la superficie de la agarosa y agarosa piezas que mantienen la separación espacial de la diapositiva (figura 3). Figura 3A muestra secado óptimo, mientras que la figura 3B muestra las arrugas que deben ser evitadas. Esta optimización requiere cuidadoso monitoreo de la diapositiva en el horno, c...

Un novedoso método de preparación de la muestra fue desarrollado para acomodar el cocultivo de células y tejidos para detectar cambio de molécula pequeña usando spectrometry total de la proyección de imagen.

Molécula pequeña comunicación entre tejidos y células mediante espectrometría de masas en la proyección de imagen de captura

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample ...

Nuestro protocolo puede mapear la comunicación química de moléculas pequeñas entre células y tejidos, y hemos aplicado específicamente esto para explorar moléculas pequeñas en la metatesis de cáncer de ovario. La principal ventaja de nuestra técnica es la capacidad de medir moléculas pequeñas de una manera libre de etiquetas mientras se mantiene la integridad espacial de las células y tejidos en 2D. Esta técnica nos ha permitido interrogar la contribución de pequeñas moléculas en las metástasis del cáncer de ovario de una manera no objetivo.Esto podría revelar nuevas dianas terapéuticas y vías que previamente han sido pasadas por alto. Esta metodología podría extenderse fácilmente a otros tipos de cáncer que se pueden cultivar en agarosa y cualquier otra enfermedad en la que un componente espacial podría ser importante para el fenotipo celular resultante. Asegurar que todas las células y componentes estén en la mano y la paciencia con el proceso de secado es esencial para este protocolo.Un paso de desicación apresurado a menudo puede conducir a datos de espectrometría de masas de mala calidad. La demostración visual de este método es útil para comprender nuestros pasos de preparación y desicación de muestras, ya que se desvían en gran medida de los experimentos típicos de espectrometría de masas por imágenes que utilizan tejidos o microbios en el agar. Para empezar, licuar la agarosa a 70 grados Celsius en un plato caliente.Coloque el divisor de ocho pozos encima de la diapositiva tratada con ITO. Mediante el tratamiento estándar de la trippsina, recoja las células MOE en un tubo cónico de 15 mililitros, centrífuga, y agregue una vez medios DMEM a resuspend para obtener una concentración de 50.000 células por cada 150 microlitros, que es dos veces la densidad final deseada. Para coculturas indivisas, utilice fórceps para agregar explanta ovárica al centro de los cuatro pozos.Justo antes del enchapado, combine 200 microlitros de suspensión celular y 200 microlitros de agarosa licuada en tubos individuales de dos mililitros. Evite las burbujas de aire durante el pipeteo. Inmediatamente, agregue 300 microlitros de la mezcla de agarosa celular a cada pozo, y aplique una suave presión descendente continua sobre el divisor para asegurar que no se filtren ni mezclen entre pozos.Asegúrese de que no haya burbujas de aire y que el ovario permanezca en el centro del pozo. Si la agarosa pipetado alteró el ovario, utilice suavemente la punta de la pipeta para centrarla antes de que la agarosa se enfríe. Luego, incuba el tobogán a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en una incubadora humidificada.Para coculturas divididas, corte los divisores de plástico fino y liso. Se utilizan los lados de una cuenca de medios estéril y desechable. Cortarlos lo suficientemente ancho para encajar perfectamente en la hipotenusa del pozo.Coloque el divisor de ocho pozos en la parte superior de la corredera tratada con ITO e inserte divisores de plástico diagonalmente en pozos. Preparar cultivos celulares como se hizo anteriormente, y combinar 100 microlitros de suspensión celular y 100 microlitros de agarosa licuada en un tubo de dos mililitros. Inmediatamente, placa 150 microlitros de la mezcla de agarosa celular en un lado del divisor manteniendo la presión hacia abajo en el divisor.Deje que la agarosa se enfríe y solidifique durante aproximadamente un minuto, y luego retire el divisor. Utilice fórceps para colocar el ovario explant en el centro de la mitad vacía del pozo. Añadir 150 microlitros de mezcla de células-agarosa sobre la parte superior del ovario.Incubar el tobogán a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en una incubadora humidificada. Después de cuatro días, retire el divisor de la cámara de los tapones de agarosa. Con una espátula plana, separe los lados de la agarosa de la cámara y tire suavemente de la cámara hacia arriba.Si se mueve algún tapón de agarosa, vuelva a colocarlos suavemente para que no se toquen unos a otros. Coloque el portaobjetos en un horno Celsius de 37 grados durante aproximadamente cuatro horas y gire 90 grados cada hora para garantizar una distribución uniforme del calor a lo largo de la muestra. El portaobjetos debe estar completamente seco.De lo contrario, puede provocar una explosión de la muestra en el entorno de alto vacío del espectrómetro de masas MALDI-TOF. Secar la diapositiva y monitorear el progreso es el paso más crítico para lograr una alta resolución espacial y espectros de masa de calidad. Si se produce descamación o arrugas excesivas, no recomendamos recopilar los datos de espectrometría de masas.Con los parámetros establecidos en el pulverizador de matriz, aplique la solución de matriz a la diapositiva. Para utilizar Phosphorus Red como calibrador, agregue un microlitro de Phosphorus Red a un punto claro en la diapositiva. Para utilizar la mezcla de péptidos como calibrador, mezcle con la matriz en Parafilm en una relación de uno a uno para ayudar a la ionización, y detecte 0.5 a un microlitro en la diapositiva.Espere a que el calibrador se seque antes de la adquisición de datos de espectrometría de masas por imágenes. Dibuje una X utilizando un marcador permanente en cada esquina de la diapositiva y tome una imagen óptica usando una cámara o un escáner a 1200 ppp. En este experimento, un control cuidadoso del portaobjetos en el horno es esencial para asegurar un portaobjetos ITO seco óptimo, lo que resulta en una muestra plana desecada con arrugas mínimas o nulas a través de la superficie de la agarosa.Esta figura muestra las arrugas que deben evitarse. Las arrugas pueden afectar ligeramente a la altura y, por lo tanto, a la precisión de masa de las señales de espectrometría de masas de imágenes. Las arrugas leves no afectarán la calidad de los datos.Un tejido localizado de forma óptima debe estar lo más cerca posible del centro. El tejido utilizado debe estar en el centro del pozo si no está dividido o en el centro del medio triángulo si se divide para que la adquisición de datos IMS no esté contaminada con efectos de borde. El tejido mal posicionado, cuando se muestra en imagen, puede dar lugar a señales de masa falsas de los efectos del borde.La imagen de diapositiva seca se utiliza para enseñar al espectrómetro de masas MALDI-TOF qué regiones se deben imaginar. Se seleccionaron pequeñas regiones alrededor del tejido ovárico para el IMS a 50 micrómetros. Se muestra una imagen representativa de una señal m-over-z para coculturas no divididas, así como para la configuración de cámara dividida.Lo más importante a recordar es que los datos resultantes son tan buenos como la preparación de la muestra. Preste especial atención al proceso de secado. El aspecto más emocionante es validar las pequeñas moléculas descubiertas de esta manera utilizando otros experimentos, como ensayos de invasión o ensayos de colonización, para informar sobre la concentración efectiva y traducir a la biología humana.Esperamos que esto abra la puerta para descubrir nuevas vías de posibles dianas terapéuticas para el cáncer de ovario mediante una mejor comprensión de los procesos en la metatesis primaria del cáncer de ovario.

capturing-small-molecule-communication-between-tissues-cells-using

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

La desorción de ionización por electrospray espectrometría de masas (DESI-MS) es un método por el cual las muestras ambiente, incluidos los tejidos biológicos, se pueden obtener imágenes con la preparación mínima de la muestra. Por rastering la muestra por debajo de la sonda de ionización, esta técnica de aerosol a base proporciona una resolución espacial suficiente para discernir las características moleculares de interés dentro de las secciones de tejido.

Obtención de imágenes de tejidos biológicos por desorción ionización electrospray espectrometría de masas

Aquí, presentamos protocolos para realizar tanto imágenes de espectrometría de masas ambiental (MSI) de tejidos como análisis in situ de MS de células individuales vivas (SCMS) utilizando la sonda única, que es un dispositivo multifuncional miniaturizado para el análisis de MS.

Aplicaciones de la sonda: Single-Imaging espectrometría de masas y análisis de celda única bajo condiciones ambientales

Una plataforma de manipulación de células integrada se desarrolla para su uso en conjunto con una configuración de espectrometría de masas de una sola sonda para el análisis en línea de células de suspensión individuales en condiciones ambientales.

Plataforma de manipulación celular integrada junto con la sonda única para el análisis de espectrometría de masas de fármacos y metabolitos en células de suspensión única

El objetivo de este protocolo es proporcionar una guía detallada sobre la preparación de la muestra al planificar experimentos con MALDI MSI para maximizar la detección metabólica y molecular en muestras biológicas.

Preparación de muestras para perfiles metabólicos utilizando imágenes de espectrometría de masas MALDI

En la era de la inmunoterapia contra el cáncer, el interés en dilucidar la dinámica del microambiente tumoral ha aumentado sorprendentemente. Este protocolo detalla una técnica de imagen de espectrometría de masas con respecto a sus pasos de tinción e imagen, que permiten un análisis espacial altamente multiplexado.

Ampliación de la comprensión del microambiente tumoral mediante imágenes de espectrometría de masas de muestras de tejido fijadas en formalina e incrustadas en parafina

Se demuestra un nuevo método de preparación de muestras para el análisis de macrocolonias bacterianas basadas en agar mediante espectrometría de masas de imágenes de ionización / desorción láser asistida por matriz.

Investigación de la cooperación microbiana a través del análisis de espectrometría de masas de imágenes de colonias bacterianas cultivadas en agar y en tejidos durante la infección

Se desarrolló un método avanzado para la obtención de imágenes por espectrometría de masas (MSI) de organoides cerebrales que permite mapear las distribuciones de metabolitos dentro de estos modelos. Esta tecnología ofrece información sobre las vías metabólicas del cerebro y las firmas de metabolitos durante el desarrollo temprano y en la enfermedad, lo que promete una comprensión más profunda de la función cerebral humana.

Imágenes moleculares de organoides cerebrales humanos mediante espectrometría de masas 

Este protocolo describe el uso de microMS para la espectrometría de masas MALDI-2 unicelular guiada por fluorescencia, lo que permite un mejor perfil molecular de las células neuronales primarias de rata.

Desorción/ionización láser asistida por matriz guiada por fluorescencia con espectrometría de masas de posionización inducida por láser de células neuronales de rata individuales

Este protocolo tiene como objetivo preservar los metabolitos celulares para la espectrometría de masas unicelular (SCMS) mediante la combinación de lavado con solución salina volátil, enfriamiento rápido de nitrógeno líquido, liofilización y almacenamiento a -8 °C. Demuestra que el enfriamiento con nitrógeno líquido es esencial para mantener los perfiles de metabolitos, mientras que el almacenamiento prolongado en frío debe minimizarse para evitar alteraciones metabólicas.

Preparación de muestras para espectrometría de masas unicelular Estudios metabolómicos: lavado, enfriamiento, secado y almacenamiento combinados de células

Este protocolo describe la imagen por espectrometría de masas de célula única de células OVCAR-8 utilizando ionización por electropulverización por desorción acoplada a espectrómetros de masas Orbitrap para análisis metabolómico de alta resolución espacial.

Imagen por espectrometría de masas de célula única usando ionización por electrospray por desorción acoplada a espectrómetros de masas Orbitrap

Aprende a mapear la comunicación de moléculas pequeñas entre células y tejidos mediante espectrometría de masas en imagen sin etiquetas. Este método revela dianas terapéuticas en la metástasis del cáncer de ovario.

Molécula pequeña comunicación entre tejidos y células mediante espectrometría de masas en la proyección de imagen de captura

Explorar más videos