Name: Identificación y disección de diversos depósitos de adipose de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Aprenda a diseccionar diversos depósitos de tejido adiposo en ratones, incluyendo BAT interescapular, WAT subcutáneo, visceral y poplíteo. Este protocolo estandarizado permite análisis histológicos y de expresión génica.

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O.A.M. es apoyado por las subvenciones NIH DK062876 y DK092759; D.P.B. cuenta con el apoyo del Programa de Capacitación de Científicos Médicos de la Universidad de Michigan (T32GM007863), el Programa de Capacitación de la Universidad de Michigan en Organogénesis (T32HD007605), la Beca al Mérito rackham de la Universidad de Michigan y la beca Tylenol Future Care Fellowship.

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<li>Scheller, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-specific+variation+in+the+properties+of+skeletal+adipocytes+reveals+regulated+and+constitutive+marrow+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Region-specific variation in the properties of skeletal adipocytes reveals regulated and constitutive marrow adipose tissues.</a> Nature Communications. 6, 7808(2015).</li>
<li>Scheller, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+osmium+tetroxide+staining+with+microcomputerized+tomography+to+visualize+and+quantify+bone+marrow+adipose+tissue+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Use of osmium tetroxide staining with microcomputerized tomography to visualize and quantify bone marrow adipose tissue in vivo.</a> Methods in Enzymology. 537, 123-139 (2014).</li>
<li>Lukjanenko, L., Brachat, S., Pierrel, E., Lach-Trifilieff, E., Feige, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+profiling+reveals+that+transient+adipogenic+activation+is+a+hallmark+of+mouse+models+of+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic profiling reveals that transient adipogenic activation is a hallmark of mouse models of skeletal muscle regeneration.</a> PLoS One. 8 (8), e71084(2013).</li>
<li>Pagano, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Regeneration+with+Intermuscular+Adipose+Tissue+%28IMAT%29+Accumulation+Is+Modulated+by+Mechanical+Constraints%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Muscle Regeneration with Intermuscular Adipose Tissue (IMAT) Accumulation Is Modulated by Mechanical Constraints.</a> PLoS One. 10 (12), e0144230(2015).</li>
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<li>Sulston, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Circulating+Adiponectin+in+Response+to+Thiazolidinediones%3A+Investigating+the+Role+of+Bone+Marrow+Adipose+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Increased Circulating Adiponectin in Response to Thiazolidinediones: Investigating the Role of Bone Marrow Adipose Tissue.</a> Frontiers in Endocrinology. 7, 128(2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

A medida que se reconoce cada vez más la importancia de las diversas características moleculares y funcionales de los grupos de adipocitos discretos, es crucial que los investigadores dentro del campo identifiquen y exifren uniformemente los depósitos de adiposo para análisis posteriores. Hasta la fecha, existen pocos protocolos para la localización estandarizada y el aislamiento de la amplia gama de depósitos adiposos de ratón. Los métodos publicados anteriormente se centran principalmente en uno o dos depósitos y carec...

Los tejidos adiposos desempeñan un papel fundamental en la homeostasis de todo el cuerpo, incluido el almacenamiento y la liberación de energía en respuesta a las necesidades locales y mundiales, la termorregulación y la secreción de adipolinas para regular el equilibrio energético, el metabolismo y las respuestas inmunitarias1 , 2. Los adipocitos se distribuyen por todo el cuerpo en depósitos discretos, y en algunos casos cumplen funciones especializadas dentro de sus microambientes3,4,5. Históricamente, el estudio del tejido adiposo se ha centrado en el tejido adiposo blanco (WAT), y su papel en el mantenimiento de la homeostasis energética. La mayoría de los adipocitos se distribuyen por todo el cuerpo en depósitos WAT subcutáneos y viscerales. Las características de estos depósitos son importantes para la susceptibilidad diferencial a las enfermedades metabólicas. Los adipocitos subcutáneos, situados debajo de la piel, se han asociado con efectos metabólicos protectores5. Los adipocitos viscerales, que rodean los órganos vitales y están contenidos dentro de los depósitos gonadal, perirenal, retroperitoneal, omental y pericárdico, están comúnmente vinculados a trastornos metabólicos, incluyendo diabetes tipo 2 y enfermedades cardiovasculares2 . Los tejidos adiposos marrones (BAT) también se han estudiado extensamente. Los adipocitos marrones y marrones expresan la proteína desacoplamiento 1 (UCP1) y desempeñan un papel importante en la termogénesis adaptativa y la homeostasis de glucosa6,7. Los adipocitos marrones clásicos se encuentran enel depósito interescapular BAT 8. Los racimos de adipocitos marrones también se encuentran en otros lugares, incluyendo supraclavicular, infra/subscapular, cervical, paravertebral y depósitos periaorticos8,9.
Además de su ubicación en los principales depósitos WAT y BAT, losadipocitos existen en nichos discretos en todo el cuerpo 4, donde pueden realizar funciones especializadas dentro de sus respectivos microambientes. Por ejemplo, el tejido adiposo de médula ósea (BMAT) sirve como reservorio de lípidos, es una fuente importante de adiponectina circulante, e interactúa estrechamente con osteoblastos, osteoclastos y células hematopoyéticas10,11. Los adipocitos dérmicos contribuyen a procesos generalizados, incluyendo la cicatrización de heridas, la respuesta inmune, la termorregulación y el crecimiento del folículo piloso12,13. Además, los adipocitos epicardiales pueden producir varias adipunos y quimioquinas que ejercen efectos locales y sistémicos sobre el desarrollo y progresión de la enfermedad de las arterias coronarias14. La expansión del WAT intermuscular se ha correlacionado positivamente con el aumento de la adiposidad, la resistencia sistémica a la insulina y la disminución de la fuerza muscular y la movilidad15. Además, los adipocitos popliteales sirven como reservorio de lípidos para la expansión linfática durante la infección16. Mientras que las funciones específicas de diferentes depósitos articulares son generalmente desconocidas, el depósito de Hoffa (infrapatellar) dentro de la rodilla ahora se piensa para contribuir a las patologías, incluyendo dolor de rodilla anterior y osteoartritis17.
Mientras que las diferencias regionales en el carácter y la función de los adipocitos están bajo un estudio intenso, el campo está actualmente limitado por la falta de un protocolo estandarizado para la identificación y disección de diversos depósitos de ratones. Los métodos publicados anteriormente normalmente han descrito el aislamiento de uno o dos depósitos específicos y carecen del nivel de detalle necesario para la escisión uniforme18,19. El protocolo descrito en este manuscrito proporciona una guía completa para los lugares anatómicos específicos y los pasos de aislamiento de muchos depósitos adiposos de ratón diferentes. Aunque los depósitos WAT son el foco principal de este manuscrito, la escisión de BAT interescapular también se describe en detalle. Los tejidos adiposos extusos utilizando este protocolo se pueden utilizar para una amplia variedad de puntos finales experimentales, incluidos estudios explantados, histología y análisis de expresión génica.
El objetivo de este manuscrito es proporcionar a los investigadores un protocolo detallado para identificar y aislar de forma clara y precisa los depósitos de adiposos de ratón prominentes y menos estudiados (Figura1). Este recurso facilitará una investigación más completa de las características de desarrollo, moleculares y funcionales de los adipocitos dentro de diversos nichos.
<img alt="Diagrama de anatomía de roedores que muestra las ubicaciones del tejido adiposo; los detalles incluyen pericárdico, omental, WAT." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59499/59499fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Representación esquemática de depósitos adiposos de ratón diseccionados en este protocolo. Esta imagen ha sido adaptada de Bagchi et al., 20184. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59499/59499fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Formalina tamponada neutra al 10 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-110-869</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 24 pocillos, sin tratar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3738</td><td></td></tr><tr><td>70 % de etanol (diluido desde el 95 %)</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-226</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de disección con puntas curvas</td><td>VWR</td><td>89259-946</td><td></td></tr><tr><td>Pan de disección</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td></td><td></td>629004</tr><tr><td>Tijeras de disección (punta afilada/roma)</td><td>VWR</td><td>82027-588</td><td></td></tr><tr><td>Esponjas de gasa</td><td>Vitality Medical</td><td>2634</td><td>Curity Esponja de gasa de 4 pulgadas x 4 pulgadas, 12 capas</td></tr><tr><td>Handi-Pins para disección</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>629132</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de iris (rectas)</td><td>VWR</td><td>470018-890</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>VetOne</td><td></td><td></td>501017</tr><tr><td>Bisturí</td><td>VWR</td><td>100499-578</td><td>Mango de bisturí de plumas con hoja, desechable</td></tr></tbody></table>

identificación y disección de diversos depósitos de adipose de ratón

Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots

Los tejidos adiposos son órganos complejos con una amplia gama de funciones, incluyendo el almacenamiento y movilización de energía en respuesta a las necesidades locales y globales, el desacoplamiento del metabolismo para generar calor y la secreción de adipolinas para regular la homeostasis de todo el cuerpo y respuestas inmunitarias. La investigación emergente está identificando importantes diferencias regionales en los perfiles de desarrollo, moleculares y funcionales de los adipocitos ubicados en depósitos discretos en todo el cuerpo. Diferentes propiedades de los depósitos son médicamente relevantes ya que las enfermedades metabólicas a menudo demuestran efectos específicos del depósito. Este protocolo proporcionará a los investigadores una guía detallada de atlas anatómicos y disección para la identificación y escisión reproducibles y precisas de diversos tejidos adiposos de ratón. La disección estandarizada de depósitos adiposos discretos permitirá realizar comparaciones detalladas de sus características moleculares y metabólicas y contribuciones a estados patológicos locales y sistémicos en diversas condiciones nutricionales y ambientales.

La identificación y el aislamiento exitosos de varios depósitos adiposos de ratón se pueden lograr utilizando el protocolo descrito anteriormente. Las ubicaciones anatómicas brutas de los depósitos subcutáneos (A, E-F), marrones (B), viscerales (C, D, G-J) y popliteal (K) se muestran en la Figura2.
<img alt="Imágenes de disección de anatomía; etiquetado de órganos internos, estudio de biología educa...

Los adipocitos existen en depósitos discretos y tienen diversos roles dentro de sus microambientes únicos. A medida que se descubren las diferencias regionales en el carácter y la función de los adipocitos, la identificación y el aislamiento estandarizados de los depósitos es crucial para el avance del campo. Aquí, presentamos un protocolo detallado para la escisión de varios depósitos adiposos de ratón.

Identificación y disección de diversos depósitos de adipose de ratón

Adipose tissues are complex organs with a wide array of functions, including storage and mobilization of energy in response to local and global needs, ...

Una metodología estandarizada para identificar y diseccionar depósitos adiposos en todo el cuerpo es fundamental para la investigación de las diferencias en el carácter y la función de los adipocitos dentro de nichos anatómicos discretos. La principal ventaja de esta técnica es que es un método fiable y preciso para identificar y excitar los depósitos adiposos de roedores comunes y menos estudiados. Para la identificación y aislamiento de LA BAT interescapular, utilice tijeras de iris para cortar horizontalmente a lo largo del borde inferior del tejido subcutáneo anterior de un ratón eutanasiado siguiendo el borde natural del depósito.Hacer dos incisiones verticales a lo largo de los bordes laterales del depósito siguiendo los bordes naturales del tejido. Utilice fórceps para voltear cuidadosamente el depósito para revelar el tejido adiposo marrón interescapular en forma de mariposa incrustado dentro del tejido adiposo blanco. A continuación, disecciona cuidadosamente el BAT lejos del WAT circundante.Almacene los tejidos adiposos en recipientes apropiados para el análisis posterior. Para la identificación y aislamiento de WAT subcutáneo posterior, coloque el ratón en la posición supina y asegure las extremidades del animal. Use fórceps para levantar la piel en la base del esternón y hacer una incisión cutánea de un milímetro.Inserte una hoja de las tijeras de iris en el corte y haga una incisión de piel de línea media de cuatro a cinco centímetros comenzando en la base del esternón y ascendiendo a la base de la cola. A continuación, haga dos incisiones horizontales de un centímetro en la parte superior de la incisión vertical inicial que se extiende lateralmente desde la línea media. Utilice los fórceps para pelar cuidadosamente la piel de la cavidad peritoneal, utilice la pierna para localizar el WAT subcutáneo posterior que debe permanecer asociado con la piel.Ancle la piel extendida y excediendo completamente el depósito triangular inguinal WAT de la base del extremo trasero ventralmente a través de la ingle. Para la identificación y aislamiento visceral del depósito WAT, utilice fórceps para levantar la delgada pared de cavidad peritoneal en la base del esternón y hacer una incisión de un milímetro en el tejido de la tienda. Inserte una hoja de las tijeras de iris en el corte y haga una incisión vertical descendente de cuatro a cinco centímetros desde la parte superior de la cavidad peritoneal hasta el recto.Haga dos incisiones horizontales de un centímetro en la parte superior e inferior de la incisión vertical que se extienden lateralmente desde la línea media y utilice los fórceps para pelar el peritoneo para exponer el contenido de la cavidad abdominal. A continuación, ancle el peritoneo extendido a la bandeja de disección para cosechar los depósitos WAT contenidos dentro de la cavidad peritoneal. Para la identificación y aislamiento de WAT gonadal visceral, localice las gónadas y use fórceps para levantar el WAT gonadal asociado, luego use tijeras de iris para extirpar cuidadosamente el WAT de las gónadas.Para extirpar el depósito perirenal, localice el riñón y use fórceps para levantar el tejido renal. Tire del riñón a la línea media para ver una clara división entre los depósitos perirenales y retroperitoneales e inscite el WAT directamente asociado con los riñones. Luego retire las glándulas suprarrenales ubicadas por encima de los riñones de la WAT.Para la identificación retroperitoneal WAT y el aislamiento, levante el riñón a la línea media de nuevo y utilice tijeras de iris para diseccionar cuidadosamente el WAT retroperitoneal de la pared peritoneal posterior. Para aislar el WAT popliteal, coloque la rótula contra la sartén de disección teniendo cuidado de que la fosa popliteal en la parte posterior de la rodilla esté mirando hacia arriba. Utilice las tijeras de iris para eliminar cuidadosamente la piel de la base de la extremidad posterior al pie.Utilice las tijeras de iris para hacer un corte en el borde inferior de las cabezas mediales y laterales del músculo gastrocnemius, utilizar los fórceps para levantar el músculo para revelar el depósito popliteal triangular. Luego usa tijeras de iris para extirpar el depósito a lo largo de los bordes del tejido natural. Aquí se muestran las ubicaciones anatómicas brutas de los depósitos subcutáneos, marrones, viscerales y popliteales de ratón.Las características histológicas de los depósitos adiposos subcutáneos, marrones, viscerales, popliteales, constitutivos y regulados de médula adiposa, intramuscular e infrapatelar pueden evaluarse mediante protocolos estándar de tinción de Hematoxilina y Eosina. Los tejidos adiposos aislados mediante este protocolo se pueden utilizar para una amplia variedad de variables experimentales, incluyendo análisis histológicos, estudios moleculares y análisis de expresión de genes y proteínas. La estandarización en todo el campo de la identificación de diversos depósitos adiposos sin duda nos ayudará a profundizar en nuestra comprensión de sus características moleculares y metabólicas y sus contribuciones diferenciales a los estados patológicos locales y sistemáticos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este video, demostramos el procedimiento quirúrgico para aislar el tejido adiposo blanco subcutáneo y el tejido adiposo marrón interescapular de un ratón recién nacido.

Colección de depósito de tejido adiposo blanco y marrón de un cachorro de ratón: un procedimiento quirúrgico para recolectar el tejido adiposo blanco y el tejido adiposo marrón de un cachorro de ratón

Debido a la conexión drástico y negativo entre la obesidad y otras comorbilidades, la investigación sobre el papel adiposo desempeña en la enfermedad y la salud en general se justifica. Se presenta un protocolo para el aislamiento y la escisión de los depósitos de tejido adiposo que permitan el estudio de tejido adiposo usando in situ y métodos in vitro.

Localización, identificación y Escisión de depósitos adiposos murino

El tejido adiposo (AT) puede influir en la homeostasis de todo el cuerpo, por lo tanto, es importante comprender los mecanismos moleculares de la diferenciación y función de los adipocitos. Proporcionamos un protocolo para obtener nuevos conocimientos sobre estos procesos mediante el análisis de la homeostasis, la diferenciación y la exposición a la hipoxia de los adipocitos como modelo para la apoptosis inducida de los adipocitos.

Mecanismo de regulación de los números de adipocitos en los organismos adultos a través de diferenciación y apoptosis La homeostasis

El objetivo de este trabajo es presentar un procedimiento paso a paso para recoger diferentes tejidos adiposos blancos de ratones, procesar las muestras de grasa y extracto de RNA.

Colección de tejido adiposo ratón y procesamiento para el análisis de ARN

Este protocolo describe el enfoque técnico para aislar subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos murinos de tejido adiposo blanco intraabdominal (WAT) mediante clasificación celular activada por fluorescencia o separación inmunomagnética de perlas.

Aislamiento de subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos adiposos intraabdominales murinos

Aquí, describimos un método de limpieza simple, barato y rápido para resolver la estructura 3D del tejido adiposo blanco humano y de ratón utilizando una combinación de marcadores para visualizar vasculatura, núcleos, células inmunitarias, neuronas y proteínas de la capa de gotas de lípidos mediante imágenes fluorescentes.

Explorar la estructura del tejido adiposo mediante la limpieza de metilsalicilatos y las imágenes 3D

Este informe describe un protocolo para el aislamiento simultáneo de preadipocytes marrones y blancos primarios de ratones recién nacidos. Las células aisladas se pueden cultivar en cultivo e inducir a diferenciarse en adipocitos blancos y marrones completamente maduros. El método permite la caracterización genética, molecular y funcional de las células de grasa primarias en cultivo.

Aislamiento Y Diferenciación De Preadipocitos Blancos Y Marrones Primarios De Ratones Recién Nacidos

Este protocolo detalla un método para la disección de depósitos adiposos de ratón y el aislamiento y la digestión de las arterias respectivas para liberar y luego identificar la población de células endoteliales. Las células recién aisladas utilizadas en aplicaciones posteriores avanzarán en la comprensión de la biología celular vascular y los mecanismos de la disfunción vascular.

Aislamiento e identificación de células endoteliales vasculares de distintos depósitos adiposos para aplicaciones posteriores

Los preadipocitos se aíslan de la fracción vascular estromal del tejido adiposo marrón interescapular de ratones recién nacidos y se diferencian en células que acumulan gotas de lípidos, expresan marcadores moleculares y muestran la morfología mitocondrial de los adipocitos marrones maduros. Estas células se analizan posteriormente mediante inmunofluorescencia y microscopía electrónica de transmisión.

Diferenciación e imagen de adipocitos marrones de la fracción vascular estromal de tejido adiposo interescapular de ratones recién nacidos

Aquí, proporcionamos un procedimiento práctico para diseccionar y realizar análisis histológicos y de expresión génica del tejido adiposo marrón supraclavicular murino.

Disección, procesamiento histológico y análisis de expresión génica del tejido adiposo marrón supraclavicular murino

El tamaño y la fragilidad de los adipocitos maduros han limitado las técnicas y herramientas disponibles para su estudio y aislamiento. En este trabajo se describe un protocolo para el aislamiento de adipocitos murinos maduros, que puede adaptarse fácilmente a diferentes depósitos de adiposo y dietas de ratones.

Aislamiento y cultivo de adipocitos murinos primarios de ratones delgados y obesos

Aprenda a diseccionar diversos depósitos de tejido adiposo en ratones, incluyendo BAT interescapular, WAT subcutáneo, visceral y poplíteo. Este protocolo estandarizado permite análisis histológicos y de expresión génica.

Identificación y disección de diversos depósitos de adipose de ratón

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