Name: Cultivo y medición de huesos largos del feto y del recién nacido murino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Aprende a cultivar huesos largos de fetos y recién nacidos murinos en condiciones ex vivo para estudiar el desarrollo óseo y cartilaginoso. Esta técnica permite el análisis de efectos genéticos locales mediante imagen en vivo.

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Nos gustaría agradecer a Alexandra Joyner su apoyo cuando se estableció este protocolo, Edwina McGlinn y Yi-Cheng Chang para compartir el ácido retinoico. El Instituto Australiano de Medicina Regenerativa está respaldado por subvenciones del gobierno del estado de Victoria y el gobierno australiano.

Todos los experimentos deben llevarse a cabo siguiendo las pautas gubernamentales e institucionales locales de manejo ético de los animales de laboratorio.
1. preparaciones previas al día de la cultura ósea
<ol><li>Configurar los apareamientos del ratón cronometrados para obtener fetos y cachorros de día embrionario 14,5 (e 14.5) y en adelante. Nota: La cultura de los huesos largos se puede aplicar con éxito a diferentes cepas de ratón; en el presente Protocolo, se utilizan ratones salvajes de tipo salvaje de Swiss Webster.</li>
	<li>Preparar el medio de disección (adaptado de Houston et al.15): diluir α-medio esencial mínimo (α-MEM) o el medio de águila modificada de Dulbecco (dmem) 1/13 en solución salina con tampón de fosfato (PBS) y 2 mg/ml de albúmina bovina (BSA) y filtro esterilizados a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm, 33 mm de diámetro. Almacene alícuts a-20 ° c.</li>
	<li>El día antes de la extracción de los fetos, preparar el medio de cultivo óseo libre de suero compuesto de DMEM que contiene 0,2% de BSA, 0,5 mM L-glutamina, 40 U/mL de penicilina/estreptomicina, 0,05 mg/mL de ácido ascórbico, y 1 mM betaglycerofosfato. Filtro esterilizar a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm, 33 mm de diámetro y almacenar a 4 ° c durante un máximo de 1 mes.</li>
	<li>En el día de la cultura y antes del sacrificio del ratón, Prepare placas de 24-Well y platos de 60 mm con medio de disección y manténguelos fríos. Precalentar el medio de cultivo óseo en un baño de agua de 37 ° c. Pulverizar 80% (v/v) de etanol sobre las herramientas (pinzas y tijeras pequeñas) que se utilizarán para la manipulación del feto. Transfiera un endoscopio binocular a un gabinete de bioseguridad de clase II.</li>
</ol>2. la cultura del feto y la tibia recién nacida y el fémur
<ol><li>Cull el ratón embarazada a través de la luxación cervical en la etapa gestacional deseada (que van de la E 14.5 a la E 18.5). Si se utilizan crías recién nacidos, quítelos de la madre uno por uno y cúrelos por decapitación.</li>
	<li>Coloque el ratón sobre su espalda y esterilice la región abdominal rociando el 80% (v/v) de etanol en su superficie.</li>
	<li>Corta la piel y el músculo abdominal con pequeñas tijeras para acceder a los cuernos uterinos.</li>
	<li>Extraer el útero de la cavidad abdominal con la ayuda de pinzas y pequeñas tijeras, quitando el mesometrium y cortando la base de los cuernos. Colocar el útero en una placa de Petri de 60 mm con medio de disección helada y mantener el plato de cultivo en hielo durante todo el procedimiento.</li>
	<li>Transfiera la placa de Petri con el útero al gabinete de bioseguridad y trabaje allí a partir de ahora.</li>
	<li>Separe los fetos individuales con tijeras cortando entre los sacos.</li>
	<li>Transfiera el saco individual bajo un estereomicroscopio de disección en un plato limpio de 60 mm con medio de disección y ábralos con pinzas para separar los fetos de las en y limpiarlos de las membranas. Nota: Trabaje con un embrión a la vez, manteniendo el resto en hielo.</li>
	<li>Decapar los fetos y transferir el cuerpo a un nuevo plato limpio de 60 mm con una Piera estéril de corte de 1 mL.</li>
	<li>Retire la piel de los fetos o cachorros con pinzas a partir de la parte posterior y pelar hacia fuera hasta los dedos de los pies.</li>
	<li>Separe las extremidades posteriores del cuerpo cortando con las pinzas cercanas a la espina dorsal y transfiéralas a un plato limpio con medio de disección helada.</li>
	<li>Separe la tibia del fémur con pinzas al introducirlas cuidadosamente entre el cartílago superficial del fémur distal y la tibia proximal.</li>
	<li>Retire los huesos de la cadera del fémur proximal y el hueso del calcáneo y el peroné de la tibia.</li>
	<li>Retire con cuidado el tejido blando del fémur y la tibia por cercenó y tirando de él. Nota: Es importante eliminar tanto tejido blando como sea posible, teniendo especial cuidado en la eliminación del tejido que conecta los dos polos del cartílago, pero evitando dañar el cartílago, el pericondrio, y los huesos.</li>
	<li>Colocar los cuatro huesos (tibias y femurs izquierdo y derecho) en el primer pozo de la placa de 24-Well con una pipas estéril de 1 mL de plástico. Alternativamente, para comparar el efecto de diferentes tratamientos en extremidades izquierdas y derecha, coloque extremidades contralateral en diferentes pozos. Nota: Se debe tener cuidado adicional cuando los huesos se transfieren a los pozos, ya que pueden adherirse fácilmente a la pipas.</li>
	<li>Proceda de la misma manera con tantos fetos como sea necesario. Nota: Cambiar el plato con el medio de disección tan pronto como se oscurezca, ya que es importante ver claramente los huesos diseccionados.</li>
	<li>
Cuando todos los huesos deseados se transfieran a los pozos, retire el medio de disección con una estéril de 1 mL de plástico y tenga cuidado adicional de no aspirar los huesos.
	<ol>
<li>Dependiendo del propósito del experimento, se pueden tomar imágenes de los huesos antes de quitar el medio de disección, como el punto de tiempo cero del experimento. Tome fotografías con un microscopio conectado a una cámara digital y anote la exposición y la escala utilizada. Para garantizar mediciones fáciles y fiables, tome fotografías con buen contraste para distinguir la parte mineralizada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir 1 mL de medio de cultivo a cada pozo. Si algún tratamiento está destinado a los huesos (doxiciclina, tamoxifeno, factores de crecimiento, etc.), se debe añadir ahora.</li>
	<li>Para observar el efecto de la inhibición del crecimiento en las condiciones de cultivo, tratar la tibias izquierda con ácido retinoico (RA, 500 nM), mientras que incubando la tibias derecha con un volumen equivalente de vehículo (dimetilsulfóxido [DMSO], concentración final 0,1%) como un control.</li>
	<li>Deje que los huesos crezcan durante dos días o más en una incubadora de cultivos celulares bajo condiciones de cultivo celular estándar (a 37 ° c en una incubadora de 5% de CO2 ).</li>
	<li>Para evaluar la proliferación, añadir 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) o 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) al medio en una concentración final de 10 μM 1 − 2 h antes de la fijación. Nota: La concentración de stock de EdU es de 20 mM. PRECAUCIÓN: EdU y BrdU son análogos de timidina y pueden ser tóxicos y mutagénicos.</li>
	<li>Descongelar el 4% de paraformaldehído (PFA) y fijar los huesos por inmersión en PFA en tubos individuales de 2 mL. PRECAUCIÓN: La PFA es tóxica y se designa como un probable carcinógeno humano. Evite respirar el polvo y los vapores de paraformaldehído. EdU y BrdU son análogos de timidina y pueden ser tóxicos y mutagénicos.</li>
	<li>Después de una breve fijación de 10 min en PFA a temperatura ambiente, transfiera los huesos a PBS para la adquisición de imágenes en el punto de tiempo final. A continuación, coloque los huesos de nuevo en PFA para la fijación durante la noche a 4 ° c.</li>
	<li>Después de que los huesos de fijación se pueden procesar para aplicaciones descendentes deseadas.</li>
</ol>3. medición y análisis de la longitud completa del hueso y de la región mineralizada
<ol><li>Utilice un software de edición de imágenes para medir la longitud de los huesos, teniendo en cuenta la escala de la imagen. Mida tanto la longitud total del hueso como la región mineralizada. Comience las mediciones desde las primeras células oscuras en un extremo hasta las últimas en el otro extremo. Nota: La región mineralizada se caracteriza por el color más oscuro y se distingue fácilmente del cartílago.</li>
	<li>Para calcular la tasa de crecimiento, definida como el aumento promedio de la longitud por día, divida la diferencia entre la longitud final del hueso y la inicial por el número de días en la cultura.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los métodos de cultivo de hueso ex vivo se han utilizado durante algún tiempo para evaluar la biología del crecimiento óseo28, pero rara vez se han aplicado a los huesos largos murinos. Con el desarrollo de técnicas de imagen, el cultivo óseo ex vivo ofrece una forma atractiva de estudiar el crecimiento óseo en tiempo real en un entorno muy parecido a las condiciones in vivo. En este escenario, es importante definir las condiciones en las que el crecimiento de los huesos largos es comparable a su ...

El crecimiento de órganos tiene que estar estrechamente afinado para prevenir la aparición de trastornos del crecimiento, e implica la regulación de múltiples tipos celulares, vías moleculares y diafonía entre diferentes partes del cuerpo. Las técnicas de imagen son esenciales para abordar los cambios que ocurren a lo largo del tiempo en un embrión en crecimiento, tanto en condiciones normales, como después de que se induce una perturbación en el sistema. Los embriones con desarrollo intrauterino, como los modelos de roedores ampliamente utilizados, presentan un desafío adicional para la imagen en vivo y el tratamiento farmacológico, que puede superarse parcialmente mediante el uso de técnicas de cultivo ex vivo. Para recapitular con éxito los procesos in vivo y obtener resultados significativos, resulta crucial encontrar las condiciones de cultivo correctas para cada órgano o tejido.
La mayoría de los huesos del esqueleto de mamíferos crecen a través de la osificación endocondral, donde el cartílago embrionario (compuesto de células denominadas condrocitos) impulsa el crecimiento longitudinal y se sustituye gradualmente por el hueso. Este proceso ocurre en las placas de crecimiento, situadas al final de los huesos largos, donde se pueden distinguir tres zonas: descansando, proliferativa e hipertrófica1,2. Primero, los condrocitos de los progenitoras redondos en la transición de la zona de reposo en los condrocitos ciclistas columnar en la zona proliferativa. Durante la siguiente etapa de diferenciación, estos condrocitos se vuelven hipertróficos y empiezan a secretar colágeno tipo X. Los condrocitos hipertróficos orquestan los siguientes pasos de osificación: segretan moléculas clave de señalización, como el factor de crecimiento del tejido conjuntivo, proteínas morfolgenéticas óseas y erizo indio, y dirigen la mineralización de la matriz, reclutan los vasos sanguíneos a la parte central del hueso, y, sobre la apoptosis, permiten osteoblastos (células que forman hueso) para invadir la matriz para formar el centro de osificación primaria3,4. La matriz mineralizada facilita la penetración de los vasos sanguíneos a través de los cuales los osteoblastos migran para reemplazar este cartílago degradado por una matriz ósea5. La mayoría de los osteoblastos invaden la matriz del cartílago del pericondrio, una capa fibrosa que envuelve el cartílago6. Alternativamente, una proporción de condrocitos hipertróficos son capaces de sobrevivir y transdiferenciar a osteoblastos7,8,9. La longitud final del hueso se debe al crecimiento acumulado del cartílago transitorio, cuya tasa de crecimiento a su vez depende del número y tamaño de los condrocitos hipertróficos, y su producción matricial10. Además, se demostró recientemente que la duración de la última fase de la hipertrofia se correlaciona con la longitud final del hueso11. Por lo tanto, se requiere una regulación estricta de la proliferación y diferenciación de estas células para asegurar el tamaño adecuado de los huesos.
A pesar de los sustanciales conocimientos adquiridos a lo largo de los años en la organización y desarrollo de las placas de crecimiento, la mayoría de estas conclusiones se basan en la observación de secciones histológicas fijas. La sección de tejido proporciona información valiosa sobre este proceso, pero se puede montar con artefactos técnicos, por lo que no se puede utilizar siempre de forma fiable para estimar los cambios morfológicos o de tamaño entre diferentes etapas. Además, a medida que el crecimiento óseo es un proceso dinámico, las imágenes estáticas bidimensionales (2D) ofrecen una visión limitada del movimiento de las células en la placa de crecimiento, mientras que la toma de imágenes de lapso de tiempo en el tejido vivo podría ofrecer información valiosa sobre el comportamiento de la condrocitos en la placa de crecimiento.
Todas estas limitaciones se pueden resolver potencialmente utilizando cultivos óseos ex vivo. Mientras que los protocolos de cultivo óseo se han desarrollado hace algún tiempo, se aplicaron limitadamente a los huesos largos murinos. La mayoría de los estudios utilizan huesos de polluelo debido a las ventajas técnicas ofrecidas por el Chick Model12,13. Los cultivos organotíticos (interfaz aire/líquido) se aplicaron a las fémures embrionarias de polluelo, que se mantuvieron en cultivo durante 10 días14. Las sofisticadas herramientas genéticas disponibles en ratón hacen que este modelo sea muy atractivo para ser utilizado en cultivos de hueso ex vivo. Los estudios que utilizaron ratones para mirar el crecimiento óseo trabajaron principalmente con huesos metatarsos15, probablemente debido a su pequeño tamaño y mayor número obtenido por embrión16. Aunque tradicionalmente se consideran huesos largos, el metatarsi entra en la senescencia (caracterizado por una reducción de la proliferación y la involución de la placa de crecimiento17) antes que otros huesos largos in vivo, y por lo tanto su continuo crecimiento ex vivo no realmente recapitular el proceso in vivo. Para los fines de este artículo, utilizaremos el término huesos largos para los huesos de las regiones proximal e intermedia de las extremidades. Varios estudios previos utilizaron huesos murinos largos, como la tibia, en cultivos ex vivo y observaron un crecimiento sustancial del cartílago, pero poca osificación18. También usamos culturas tibial recientemente, principalmente para estudiar la dinámica de condrocitos19. Otros estudios utilizaron cabezas femorales de ratones jóvenes20 o sólo la parte distal del fémur para la cultura21. Algunas obras más recientes combinan con éxito la cultura ex vivo de huesos llenos con imágenes de lapso de tiempo para adquirir películas tridimensionales (3D) de condrocitos en el tejido del ratón viviente22,23. Los autores lograron observar eventos previamente inadvertidas en la reordenación de los condrocitos a la zona proliferativa23 en un buen ejemplo de la posible aplicación de la cultura ósea ex vivo. La alternativa, es decir, el análisis de imágenes estáticas, requiere técnicas indirectas y complejas. Esto fue ejemplificado por un estudio reciente que valoró la importancia de los clones orientados transversalmente para el crecimiento del cartílago, donde se utilizaron el rastreo genético con cepas de ratones de reportero multicolor junto con el modelado matemático24. Por lo tanto, la cultura ex vivo podría ayudar a profundizar en los procesos dinámicos de una manera más rápida y directa.
Aquí, presentamos un método para la cultura de los huesos largos murinos, que se puede combinar con diferentes tratamientos moleculares y/o con imágenes en vivo de lapso de tiempo. Este protocolo adapta los métodos utilizados en los informes anteriores15,18,25, pero aborda algunos problemas adicionales y se centra en los huesos largos, como la tibia, en lugar de los huesos metatarsales. Por último, explora el potencial de usar comparaciones emparejadas estadísticamente poderosas mediante el cultivo de huesos izquierdos y derecho por separado en presencia de diferentes sustancias.

<table><tbody><tr><td>5-Etinil-2'-desoxiuridina</td><td>Santa Cruz</td><td>CAS 61135-33-9</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-2&prime;-deoxyuridina</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubos de centrífuga cónicos</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Plato de cultivo de órganos con pozo central tratado con TC, 20/Paquete, 500/Caja, Falcon estéril</td><td></td><td>353037</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td>CS4</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma</td><td>A92902</td><td></td></tr><tr><td>Unidad base para el visor</td><td>Zeiss</td><td>435425-9100-000</td><td></td></tr><tr><td>Betaglicerofosfato</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Visor binocular</td><td>Zeiss</td><td>STEMI-2000</td><td></td></tr><tr><td>Fracción de albúmina sérica bovina (BSA) v</td><td>Cámara Roche/Sigma</td><td>10735086001</td><td></td></tr><tr><td>DigiRetina 500</td> Kit de disección <td>Aunet</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cumper Robbins PFS00034</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 96%</td><td>Merk</td><td>159010</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont#5 Inox08</td><td>Fine Science Tools</td><td>T05811</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 150 CO2</td><td>incubadora Thermo Fisher</td><td>51026282</td><td></td></tr><tr><td>Medio Esencial Mínimo Eagle</td><td>Sigma</td><td>M2279</td><td></td></tr><tr><td>Multipocillo 24 pocillos</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído Sigma</td><td>158127</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de plástico 1 mL Estéril Envasada individualmente Thermo</td><td></td><td>273</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa 0,2 mmm</td><td>Ciencias de la Vida</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa Terumo 20 mL</td><td>Terumo</td><td>DVR-5174</td><td></td></tr><tr><td>Tretinoína (ácido retinoico)</td><td>Sigma</td><td>PHR1187-3X</td><td></td></tr><tr><td>Visor trinocular</td><td>Aunet AZS400T</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cultivo y medición de huesos largos del feto y del recién nacido murino

Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones

Los huesos largos son estructuras complejas y dinámicas, que surgen de la osificación endocondral a través de un cartílago intermedio. El acceso limitado a huesos humanos sanos hace particularmente valioso el uso de modelos de mamíferos, como ratones y ratas, para buscar en diferentes aspectos del crecimiento óseo y la homeostasis. Además, el desarrollo de herramientas genéticas sofisticadas en ratones permite estudios más complejos de crecimiento óseo largo y pide una expansión de las técnicas utilizadas para estudiar el crecimiento óseo. Aquí, presentamos un protocolo detallado para el cultivo de hueso murino ex vivo, que permite el estudio del hueso y el cartílago de una manera estrechamente controlada, mientras que la recapitulación de la mayor parte del proceso in vivo. El método descrito permite la cultura de una gama de huesos, incluyendo la tibia, el fémur y los huesos metatarsales, pero nos hemos centrado principalmente en la cultura tibial aquí. Además, se puede utilizar en combinación con otras técnicas, como el Time-lapse Live Imaging o tratamiento farmacológico.

El cultivo óseo se puede realizar a partir de diferentes etapas. En la figura 1A-D, se muestra una comparación entre la tibia cultivada y los recién extraídos en etapas equivalentes. La primera observación es que hasta dos días de cultivo el tamaño logrado es comparable al crecimiento óseo in vivo tanto para el cartílago como para el hueso mineralizado (figura 1A, B, D). Periodos de cultivo más l...

Aquí, presentamos un método para la cultura ex vivo de huesos largos de murino en las etapas del feto y del recién nacido, adecuado para analizar el desarrollo de hueso y cartílago y la la homeostasis en condiciones controladas, mientras que recapitular el proceso in vivo.

Cultivo y medición de huesos largos del feto y del recién nacido murino

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy ...

Este método adapta el protocolo de cultivo metatarsiano a huesos más grandes, permitiendo combinar la manipulación ósea directa con modelos genéticos complejos para abordar procesos relacionados con el desarrollo óseo. Esta técnica permite la manipulación y el análisis del crecimiento óseo que no son posibles in vivo, como imágenes en vivo o manipulación física y farmacológica directa. Este método de cultivo ex vivo permite el estudio específico de los efectos locales de la inserción genética en el hueso separándolo del efecto sistémico que el tratamiento tiene sobre el organismo.Comience esterilizando la región abdominal de un día gestacional embarazada 14.5 a 18.5 ratón con 80%etanol y usando tijeras pequeñas para abrir la piel y los músculos abdominales para acceder a los cuernos uterinos. Para extraer el útero de la cavidad abdominal, retire el mesometrio y corte la base de los cuernos. Luego, transfiera el útero a un plato de petri de 60 milímetros que contenga un medio de disección helada sobre hielo.En un gabinete de bioseguridad cortar entre los sacos con tijeras para separar los fetos individuales, y transferir un saco individual en un nuevo plato de 60 milímetros con medi

culturing-and-measuring-fetal-and-newborn-murine-long-bones

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este protocolo describe un procedimiento para la toma de muestras en serie de médula ósea femoral (BM) sin requerir el sacrificio de ratones. Este procedimiento facilita los estudios longitudinales de la composición de la BM de los ratones a lo largo del tiempo y proporciona acceso en serie a las células dentro de la BM para estudios ex vivo y de trasplante.

Femoral Aspiración de médula ósea en ratones vivos

Aquí presentamos un protocolo para la disección de huesos largos de extremidades traseras (fémures y tibias) del ratón de laboratorio. Describimos además una técnica rápida para el aislamiento de la médula ósea de estos huesos que utiliza la centrifugación para la extracción de la médula ósea del espacio de la médula ósea.

Murino Hind Limb largo Bone La disección y el aislamiento de médula ósea

Presentamos un protocolo para diseccionar y cultivar huesos metatarsianos murinos embrionarios de día 15 (E15). Este modelo ex vivo altamente fisiológico de osificación endocondral proporciona condiciones más cercanas a la situación in vivo que las células en cultivo monocapa o 3D y es una herramienta vital para investigar el crecimiento y desarrollo óseo.

Cultura de murinos embrionarias Metatarsianos: Un modelo fisiológico de osificación endocondral

Este manuscrito describe un protocolo para aislar y la cultura osteoclastos en vitro de médula ósea de ratón y para estudiar el papel de lo mamíferos/mecanicista Diana de la rapamicina 1 complejo en la formación de osteoclastos.

Una base de RANKL osteoclasto cultura ensayo de médula ósea de ratón para investigar el papel de mTORC1 en la formación de osteoclastos

En este artículo se presentan métodos para aislar y diferenciar las células estromales de médula ósea y células madre hematopoyéticas de los huesos largos de ratón. Dos protocolos diferentes presentan rendimiento diferentes poblaciones celulares adecuadas para la expansión y diferenciación a osteoclastos, osteoblastos y adipocitos.

Aislamiento, cultivo y diferenciación de células estromales de médula ósea y progenitores de los osteoclastos de los ratones

El cultivo ex vivo de explantes óseos puede ser una herramienta valiosa para el estudio de la fisiología ósea y la evaluación potencial de fármacos en la remodelación ósea y enfermedades óseas. El protocolo presentado describe la preparación y el cultivo de calvarias aisladas de cráneos de ratones recién nacidos, así como sus aplicaciones.

Medición de la remodelación ósea y recreación del microambiente tumor-óseo utilizando la cocultura calvaria y la histomorfometría

El presente protocolo describe el desarrollo de una plataforma de prueba reproducible para cuellos femorales murinos en una configuración de flexión en voladizo. Se utilizaron guías personalizadas impresas en 3D para fijar de manera consistente y rígida los fémures en una alineación óptima.

Flexión en voladizo de cuellos femorales murinos

Este protocolo describe un método sencillo y no enzimático para aislar células de médula ósea de ratón neonatal de 7-9 días de edad y generar macrófagos diferenciados utilizando un sobrenadante de células L929 como fuente de factor estimulante de colonias de granulocitos (M-CSF). Los macrófagos derivados de la médula ósea se analizaron más a fondo para determinar los antígenos de superficie F4/80, CD206, CD11b y la competencia funcional.

Aislamiento de médula ósea de ratón neonatal y preparación de macrófagos derivados de la médula ósea

Este protocolo describe un modelo de ratón mejorado para las lesiones de la placa de crecimiento óseo en adolescentes. Utilizando ratones transgénicos con reporteros fluorescentes de tres linajes para los tipos de colágeno I, II y X, las matrices primarias asociadas con tres sustratos diferentes de la placa de crecimiento, la ubicación de la lesión es guiada por fluorescencia nativa bajo el microscopio.

Modelo murino transgénico tricolor para el estudio de la lesión del cartílago de crecimiento

El modelo de lesión de la médula ósea murina es una herramienta útil para estudiar la osteogénesis postnatal a través de la osificación intramembranosa. Este protocolo quirúrgico simplificado describe el procedimiento de ablación de la médula ósea para la evaluación posterior de la formación de hueso nuevo y las respuestas celulares después de una lesión.

Metodología mejorada para el estudio de la osteogénesis postnatal mediante osificación intramembranosa en un modelo de lesión de médula ósea murina

Aprende a cultivar huesos largos de fetos y recién nacidos murinos en condiciones ex vivo para estudiar el desarrollo óseo y cartilaginoso. Esta técnica permite el análisis de efectos genéticos locales mediante imagen en vivo.

Cultivo y medición de huesos largos del feto y del recién nacido murino

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