Name: Estudio de toxicidad de nanopartículas de óxido de zinc en el cultivo celular y en Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Aprenda a evaluar la nanotoxicidad de nanopartículas de óxido de zinc en fibroblastos pulmonares humanos MRC5 y Drosophila melanogaster mediante citometría de flujo y sonda DHE para detectar especies reactivas de oxígeno.

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El estudio fue apoyado por el número de subvención R706-000-043-490. El estudio no representa la opinión del patrocinador de la subvención.

1. Análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) en células vivas/fijas
<ol><li>Sonicate ZnO NP en suspensión durante 15 min.</li>
	<li>Preparar los NP de ZnO en varias concentraciones (por ejemplo, 0, 10, 25, 50,100 y 200 g/ml) utilizando 1 mg/ml de solución de stock ZnO NP para el tratamiento de células cultivadas.</li>
	<li>Semilla MRC5 fibroblastos pulmonares humanos (1 x 105 células/pozo) en una placa de cultivo de 6 pocillos con un día de antelación, y luego tratar las células con 2 ml de ZnO NP (en triplicados) durante 8 h, 16 h y 24 h.</li>
	<li>En cada punto de tiempo, recoger las células por centrifugación a 300 x g durante 5 min.</li>
	<li>Lave los gránulos celulares dos veces con solución salina tamponada de fosfato (PBS).</li>
	<li>Resuspender las células con 1x tampón de unión, que se compone de 0,1 M HEPES/hidróxido sódico (NaOH), cloruro de sodio de 1,4 M (NaCl) y 25 mM de cloruro de calcio (CaCl2), a una concentración de 1 x 105 células por 100 oL.</li>
	<li>Añadir 5 l de isotiocianato de fluoresceína (FITC) De la mancha V de la fluoresceína (FITC) y 5 l de mancha de ADN de yoduro de propidium (PI), e incubar las células durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT; 25 oC) en la oscuridad.</li>
	<li>Recargar las muestras con un búfer de unión adicional de 400 l de 1x antes de clasificar las celdas por citometría de flujo. Se analiza un mínimo de 10.000 celdas para cada muestra.</li>
	<li>Tabular el gráfico de barras utilizando la intensidad mediana obtenida.</li>
</ol>2. Exposición de los NP de ZnO a Drosophila
<ol><li>Añadir 1 ml de nanopartículas a diferentes concentraciones en viales, seguido de 9 ml de alimentos para moscas para realizar una concentración final de 0,1 mg/ml, 0,25 mg/ml o 0,5 MG/ml de ZnO NP.</li>
	<li>Mezcle bien las nanopartículas con los alimentos en los viales utilizando la pipeta.</li>
	<li>Deje que los alimentos con mosca que contengan ZnO NP se enfríen durante al menos 2-3 horas antes de su uso.</li>
	<li>Introducir moscas macho y hembra adultos en los viales durante 5 días, y les permiten aparearse y poner huevos (que aparecen como manchas blancas) en la superficie de la comida.</li>
	<li>Retire las moscas parentales, y permita que los óvulos se sometan a un desarrollo posterior, que consta de 4 etapas de desarrollo diferentes (fase embrionaria, larval, pupal y adulta).</li>
</ol>3. Disección de la mosca
<ol><li>Recoger larvas de estrella de finales de la3a de la pared de los viales para su análisis. Los huevos recién puestos normalmente se desarrollan en larvas de estrella de finales de 3a después de 72-120 h en RT.</li>
	<li>Limpie el plato de disección y llene el pozo con medio de disección/PBS.</li>
	<li>Disecciona las larvas (finales de la3a estrella) bajo el estereomicroscopio, usando un par de fórceps.</li>
	<li>Usa la punta de los fórceps para hacer un pequeño agujero y romper la capa de cutícula de las larvas. Tire con cuidado del intestino y colóquelo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga el medio Drosophila de Schneider, antes del paso de fijación utilizando 1 ml de 4% de paraformaldehído (PF).</li>
	<li>3.5Fijar el intestino en PF durante 10 minutos a RT, para experimentos posteriores, como inmunomancha.</li>
</ol>4. Detección ROS con tinción de dihidroetidio (DHE)
<ol><li>Tratar las larvas con varias concentraciones de NP ZnO como se describe en el paso 2.1.</li>
	<li>Después de la disección del intestino de las larvas de3a estrella como se describe en la sección 3, incubar el intestino en el medio Drosophila de Schneider en RT antes de realizar la tinción de tejido. Disolver 1 l de tinte DHE (a partir de la concentración de 30 mM) en 1 ml del medio de Schneider, haciendo una concentración de trabajo final de 10-30 m de tinte DHE.</li>
	<li>Incubar el intestino durante 5 minutos a RT en la oscuridad, y luego lavar tres veces usando el medio de Schneider por cada 5 minutos.</li>
	<li>Fije el intestino con 4% PF (paso opcional) y monte el intestino en diapositivas de vidrio, con medio de montaje anti-fade que contiene 4o,6-diamidino-2-fenilindo (DAPI). Captura imágenes bajo un microscopio confocal.</li>
</ol>5. Medición de la fluorescencia mediante el software ImageJ
<ol><li>Importe las imágenes de fluorescencia capturadas adquiridas mediante microscopía de fluorescencia o microscopía de escaneo láser confocal en el software ImageJ.</li>
	<li>Haga clic en el menú Analizar y seleccione Establecer medidas.</li>
	<li>Seleccione la medida de salida, como la intensidad integrada del área y el valor gris medio.</li>
	<li>Haga clic en Medir.</li>
	<li>Seleccione una región sin fluorescencia para establecer el fondo.</li>
	<li>Exporte los datos a la hoja de cálculo de Excel y determine la fluorescencia total de celdas (CTCF) corregida, utilizando el cálculo como se muestra a continuación. CTCF - Densidad Integrada - (área de la celda seleccionada X Fluorescencia media de las lecturas de fondo)</li>
	<li>Construir un gráfico de barras y realizar análisis estadísticos.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+100+nm+zinc+oxide+nanoparticles%3A+a+report+of+90-day+repeated+oral+administration+in+Sprague+Dawley+rats%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats.</a> International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).</li>
<li>Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial+activity+and+mechanism+of+action+of+zinc+oxide+nanoparticles+against+Campylobacter+jejuni%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).</li>
<li>Colvin, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+environmental+impact+of+engineered+nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The potential environmental impact of engineered nanomaterials.</a> Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).</li>
<li>De Angelis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+ZnO+and+TiO%282%29+nanoparticles%3A+physicochemical+characterisation+and+toxicological+effects+on+human+colon+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells.</a> Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).</li>
<li>Johnson, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+exposure+to+ZnO+nanoparticles+induces+autophagic+immune+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death.</a> Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).</li>
<li>Singh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoGenotoxicology%3A+the+DNA+damaging+potential+of+engineered+nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials.</a> Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).</li>
<li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+dissolved+zinc+ion+and+reactive+oxygen+species+in+cytotoxicity+of+ZnO+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles.</a> Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).</li>
<li>Wahab, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZnO+nanoparticles+induced+oxidative+stress+and+apoptosis+in+HepG2+and+MCF-7+cancer+cells+and+their+antibacterial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).</li>
<li>Namvar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+effects+of+biosynthesized+zinc+oxide+nanoparticles+on+murine+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Evidence-Based+Complementary+and+Alternative%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).</li>
<li>Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicities+of+nano+zinc+oxide+to+five+marine+organisms%3A+influences+of+aggregate+size+and+ion+solubility%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).</li>
<li>Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-specific+toxic+effects+of+differently+shaped+zinc+oxide+nanoparticles+to+zebrafish+embryos+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio).</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).</li>
<li>Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+ZnO+nanoparticles+exposure+induces+developmental+toxicity%2C+oxidative+stress+and+DNA+damage+in+embryo-larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).</li>
<li>Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+study+of+the+harmful+effects+of+ZnO+nanoparticles+using+Drosophila+melanogaster+as+an+in+vivo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hazardous+Materials%22%5BJournal%5D)">A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model.</a> Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).</li>
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<li>Ong, C., Yung, L. Y., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+as+a+model+organism+to+study+nanotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity.</a> Nanotoxicology. 9, 396-403 (2015).</li>
<li>Hoffmann, J. A., Reichhart, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+innate+immunity%3A+an+evolutionary+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective.</a> Nature Immunology. 3, 121-126 (2002).</li>
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<li>Adams, M. D., Sekelsky, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+sequence+to+phenotype%3A+reverse+genetics+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster.</a> Nature Reviews Genetics. 3, 189-198 (2002).</li>
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<li>Ong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+nanoparticles+disrupt+germline+stem+cell+maintenance+in+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Silver nanoparticles disrupt germline stem cell maintenance in the Drosophila testis.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li>
<li>Alaraby, M., Demir, E., Hernandez, A., Marcos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+potential+harmful+effects+of+CdSe+quantum+dots+by+using+Drosophila+melanogaster+as+in+vivo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Assessing potential harmful effects of CdSe quantum dots by using Drosophila melanogaster as in vivo model.</a> Science of the Total Environment. 530-531, 66-75 (2015).</li>
<li>Barik, B. K., Mishra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+as+a+potential+teratogen%3A+a+lesson+learnt+from+fruit+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles as a potential teratogen: a lesson learnt from fruit fly.</a> Nanotoxicology. , 1-27 (2018).</li>
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<li>Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Toxicity+of+Nanoparticles+to+Human+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).</li>
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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Con el fin de evaluar si ZnO NP puede inducir apoptosis en fibroblastos MRC5, utilizamos citometría de flujo para distinguir las células de la muerte de células necróticas o apoptoticas. En las células vivas normales, la fosfatidilserina (PS) se localiza en la membrana celular. Si se produce apoptosis, PS se traslada al prospecto extracelular de la membrana plasmática, lo que permite la unión de Annexin V etiquetado con fluoresceína (FITC Annexin V)29. Por otro lado, el yoduro de propidium rojo-fl...

La nanotecnología se refiere a la aplicación de materiales de tamaño nanométrico que se utilizan en todos los campos científicos, incluyendo la medicina, la ciencia de los materiales y la bioquímica. Por ejemplo, los NP ZnO que son conocidos por su dispersión ultravioleta, detección química y propiedades antimicrobianas, así como alta conductividad eléctrica, se utilizan en la producción de diversos productos de consumo como envases de alimentos, cosméticos, textiles, cauchos, baterías, catalizadores para el tratamiento de gas de cola de automóviles, y aplicaciones biomédicas1,2,3.
Sin embargo, las crecientes aplicaciones de los productos basados en ZnO NP, que conducen a una mayor exposición humana a los NP de ZnO, han suscitado preocupaciones sobre sus posibles efectos adversos sobre la salud humana. Varios estudios celulares in vitro han demostrado que los NP de ZnO pueden inducir estrés oxidativo, citotoxicidad relacionada con la autofagia, inflamación y genotoxicidad4,5,6,7,8 . En particular, se supone que la toxicidad de znO NP es causada por la disolución de Zn para liberar iones Zn2+, así como la reactividad superficial de ZnO, lo que resulta en los desequilibrios iónicos y metabólicos celulares que están relacionados con la homeostasis iónica deteriorada y una inhibición del transporte iónico4,7,9,10. Es importante destacar que los estudios han demostrado que la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) es uno de los principales mecanismos subyacentes a la toxicidad asociada a los NP de ZnO. Se ha demostrado que la insuficiente actividad antioxidante después del insulto ROS es responsable de provocar la citotoxicidad y el daño al ADN9. Los efectos tóxicos de znO NP también se han divulgado en modelos animales, incluyendo roedores1, pez cebra11,12, así como el invertebrado Drosophila13.
Drosophila sirve como un modelo animal alternativo bien establecido para el cribado de toxicidad de entidades químicas y nanomateriales (NMs)14,15. Es importante destacar que existen altos niveles de similitud genética y fisiológica entre el ser humano y Drosophila que justifican el uso de Drosophila como modelo in vivo para evaluar las respuestas biológicas a contaminantes ambientales como los NM 16. Además, hay muchas ventajas de usar Drosophila debido a su pequeño tamaño, corta vida útil, amenabilidad genética y mantenimiento fácil y rentable. Además, Drosophila ha sido ampliamente adoptada para el estudio de la genética, la biología molecular y del desarrollo, desde que su genoma completo fue completamente secuenciado hace años en 2000, por lo que es adecuado para una variedad de cribado de alto rendimiento y para abordar las cuestiones biológicas no resueltas17,18,19,20,21. En los últimos años, se han notificado varios estudios relacionados con la inmunotoxicidad utilizando diferentes tipos de NP en Drosophila 15,22,23,24. Este nuevo conocimiento fundamental obtenido de los estudios con Drosophila ha ayudado a proporcionar más información sobre nuestra comprensión de la nanotoxicología.
ROS es un conocido culpable de citotoxicidad y genotoxicidad causada por los NP, en particular, los NP a base de metal25. ROS son especies químicas que contienen oxígeno con propiedades reactivas más altas que el oxígeno molecular. Los radicales libres como el radical superóxido (O2-) e incluso, moléculas no radicales como el peróxido de hidrógeno (H2O2) pueden actuar como ROS. Bajo condición fisiológica normal, se requieren para mantener la homeostasis celular26,sin embargo, ROS excesiva debido a la sobreproducción o desregulación del sistema de defensa antioxidante puede causar estrés oxidativo, lo que conduce a daños a las proteínas, lípidos y ácido desoxirribonucleico (ADN)27. Por ejemplo, a medida que los niveles de ROS aumentan y el nivel de glutatión (GSH) disminuye de forma concomitante, se produce la interrupción de la síntesis de trifosfato de adenosina (ATP) y el nivel de lactato deshidrogenasa (LDH) aumenta en el medio, culminando en la muerte celular27.
Aquí, proporcionamos protocolos para realizar análisis celulares y genéticos utilizando células de mamíferos cultivadas y Drosophila para determinar los posibles efectos adversos de los NP de ZnO. En la Figura 1se muestra una descripción general del método utilizado para el estudio de toxicidad de los NP de ZnO.

<table><tbody><tr><td>15% 4-hidroxibenzoato de metilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cncCK6/TM3, Sb</td><td></td><td></td>un <td>regalo del Dr. Kerppola T</td></tr><tr><td>Harina de maíz, glucosa, levadura cervecera</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CyAn ADP con Summit Software</td><td>DAKO</td><td></td><td>https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf</td></tr><tr><td>Dihidroetidio (Hidroetidina)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D11347</td><td></td></tr><tr><td>FITC Annexin V Kit de detección de apoptosis I</td><td>BD biosciences</td><td>556547</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucolin</td><td>Supermercado</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>ImageJ NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MRC5 fibroblasto de pulmón humano</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>Schneider' s Drosophila</td><td>medio de montaje antidecoloración Thermo Fisher Scientific</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield con DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Wild-type Canton-S; Sod2N308 / CyO</td><td>NIG-FLY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanopartículas de óxido de zinc</td><td>Sigma Aldrich</td><td>721077</td><td>consulte la hoja 2</td></tr></tbody></table>

estudio de toxicidad de nanopartículas de óxido de zinc en el cultivo celular y en drosophila melanogaster

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

Las nanopartículas de óxido de zinc (ZnO NP) tienen una amplia gama de aplicaciones, pero el número de informes sobre la toxicidad asociada a ZnO NP ha crecido rápidamente en los últimos años. Sin embargo, los estudios que aclaran los mecanismos subyacentes para la toxicidad inducida por ZnO NP son escasos. Determinamos los perfiles de toxicidad de los NP de ZnO utilizando modelos experimentales in vitro e in vivo. Se observó una disminución significativa en la viabilidad celular en los fibroblastos pulmonares MRC5 expuestos a ZnO NP, lo que muestra que los NP de ZnO ejercen efectos citotóxicos. Del mismo modo, curiosamente, el intestino expuesto a los NP de ZnO exhibió un aumento dramático en los niveles reactivos de las especies de oxígeno (ROS) en la mosca de la fruta Drosophila. Se requieren estudios más detallados para establecer una evaluación del riesgo para el aumento del uso de LOS NP de ZnO por parte de los consumidores.

Las células expuestas a NP se procesaron con el kit de reactivos de tinción de células, seguido de la clasificación de celdas mediante citometría de flujo. Las células tratadas con ZnO NP (panel inferior y derecho) exhiben un porcentaje más alto de células apoptoticas tempranas (R3)/tardías (R6) que las celdas de control (R5, inferior, panel izquierdo). La muerte de la célula necrótica se denota por R4 (panel superior, derecho)(Figura 2). Los resultados del e...

Describimos un protocolo detallado para evaluar los perfiles toxicológicos de nanopartículas de óxido de zinc (ZnO NP) en particular, el tipo de muerte celular en fibroblastos pulmonares MRC5 humanos y la formación de ROS en la mosca de la fruta Drosophila.

Estudio de toxicidad de nanopartículas de óxido de zinc en el cultivo celular y en Drosophila melanogaster

Zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) have a wide range of applications, but the number of reports on ZnO NP-associated toxicity has grown rapidly in recent ...

Nuestros métodos describen una forma simple y repetida para estudiar la nanotoxicidad, como examinar los tipos de muerte celular y examinar la producción de especies reactivas de oxígeno. La clasificación celular activada por fluorescencia es un formato estricto que nos permite estudiar la subpoblación de células y los crecientes tipos de muerte celular. El método de estudio de la sonda DHE nos permite detectar y cuantificar especies reactivas de oxígeno seguidas de citometría de flujo, imágenes microscópicas de alto contenido y análisis de fluorescencia a base de acoplación.Para comenzar, coloque un tubo Eppendorf que contenga nanopartículas de óxido de zinc en la solución de material de nanopartículas de óxido de zinc en un sonicador durante 15 minutos. Preparar nanopartículas de óxido de zinc a diversas concentraciones utilizando un stock de nanopartículas de óxido de zinc de un miligramo por mililitro. Luego, en un gabinete de bioseguridad, la semilla de fibroblastos pulmonares humanos MRC5 sembra tres placas de cultivo de seis pozos a la concentración de una por 10 a las quintas células por pozo.Incubar las células a 37 grados centígrados. Después de un día, tratar las células

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Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

En este artículo, los embriones de pez cebra se utilizan para el cribado de toxicidad química. La toxicidad química se correlaciona con las lecturas del fenotipo. El protocolo de muestreo muestra un enfoque metodológico para realizar el cribado de toxicidad química.

Cribado de toxicidad química basada en embriones: evaluación de los efectos en el desarrollo de embriones de pez cebra

Se desarrolla un protocolo para examinar los efectos de un fármaco epigenético DZNep en el desarrollo, la fecundidad y la supervivencia de los mosquitos.  Aquí describimos los procedimientos para la exposición acuosa de DZNep a mosquitos inmaduros y una exposición sanguínea de DZNep a mosquitos adultos, además de medir la inhibición de la hidrolasa SAH.

Los ensayos toxicológicos para efectos de prueba de un epigenética de Drogas sobre el Desarrollo, Fecundidad y Sobrevivencia de los mosquitos de malaria

En este trabajo, proporcionamos un protocolo detallado para la exposición de especies en el género Drosophila a contaminantes con el objetivo de estudiar el impacto de la exposición en un rango de salidas fenotípicas en diferentes etapas de desarrollo y para más de una generación.

Protocolo experimental para el uso de Drosophila como sistema modelo de invertebrado para ensayos de toxicidad en el laboratorio

Se ha desarrollado un método cuantitativo para identificar y predecir la toxicidad de productos químicos, analizando automáticamente los perfiles fenotípicos de Caenorhabditis elegans. Este protocolo describe cómo tratar gusanos con productos químicos en una placa de 384 pozos, capturar videos y cuantificar fenotipos relacionados toxicológicos.

Un análisis de alto rendimiento para la predicción de toxicidad química por perfiles fenotípicos automatizado de Caenorhabditis elegans

Los embriones de pez cebra se utilizan para evaluar la toxicidad de los compuestos químicos. Se desarrollan externamente y son sensibles a los productos químicos, lo que permite la detección de cambios fenotípicos sutiles. El experimento sólo requiere una pequeña cantidad de compuesto, que se añade directamente a la placa que contiene embriones, haciendo que el sistema de prueba sea eficiente y rentable.

Evaluación rápida de la toxicidad de compuestos químicos mediante embriones de pez cebra

Los productos químicos disruptores endocrinos (EDC) representan un problema grave para los organismos y para los entornos naturales. Drosophila melanogaster representa un modelo ideal para estudiar los efectos de la EDC in vivo. Aquí, presentamos métodos para investigar la interrupción endocrina en Drosophila, abordando los efectos de la EDC sobre la fecundidad, fertilidad, tiempo de desarrollo, y la vida útil de la mosca.

Métodos para probar la interrupción endocrina en Drosophila melanogaster

Este protocolo presenta ensayos de citotoxicidad de uso común (ensayos Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red y MTT) adaptados para la evaluación de la citotoxicidad en líneas celulares de embrión de pez cebra (ZEM2S) e hígado (ZFL) en placas de 96 pocillos.

Ensayos de citotoxicidad con líneas celulares de pez cebra

Este protocolo describe un método eficiente y económico que utiliza medios líquidos para evaluar los efectos de los tóxicos químicos sobre la viabilidad de Drosophila melanogaster adulta.

Evaluación de la toxicidad química en adultos Drosophila melanogaster

El siguiente estudio evalúa el perfil toxicológico de un marco metal-orgánico seleccionado utilizando la detección eléctrica de impedancia de sustrato de celda (ECIS), una técnica de detección de alto rendimiento en tiempo real.

Detección eléctrica de sustratos de células para la evaluación en tiempo real de perfiles toxicológicos de estructuras metal-orgánicas

El protocolo presenta un método rentable y de alto rendimiento para evaluar la neurotoxicidad en la mosca de la fruta a través de la cuantificación de la disfunción locomotora como alternativa a los modelos tradicionales de mamíferos. Su objetivo es evaluar los efectos neurotóxicos de compuestos farmacéuticos, agentes ambientales o modificaciones genéticas utilizando un modelo sensible, reproducible y éticamente favorable.

Análisis conductual de la disfunción locomotora en Drosophila melanogaster como lectura de la neurotoxicidad

Aprenda a evaluar la nanotoxicidad de nanopartículas de óxido de zinc en fibroblastos pulmonares humanos MRC5 y Drosophila melanogaster mediante citometría de flujo y sonda DHE para detectar especies reactivas de oxígeno.

Estudio de toxicidad de nanopartículas de óxido de zinc en el cultivo celular y en Drosophila melanogaster

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