Name: Espectroscopía de absorbancia atómica para medir las agrupaciones intracelulares de zinc en células de mamífero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Aprende a medir agrupaciones intracelulares de zinc en células de mamífero mediante espectroscopía de absorbancia atómica con horno de grafito. Este protocolo accesible permite cuantificar metales traza con alta sensibilidad.

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Este trabajo fue apoyado por el Premio de académicos de diversidad de la Facultad de la escuela de medicina de la Universidad de Massachusetts a T.P.-B. N.N.-T. es apoyado por SEP-CONACYT, subvención 279879. J. g. N es apoyado por la Fundación Nacional de ciencia Grant DBI 0959476. Los autores están agradecidos al Dr. Daryl a. Bosco por proporcionar la línea celular N2A y a Daniella Cangussu por su apoyo técnico.

1. cultivo celular de mamíferos
<ol><li>Consideraciones generales
	<ol>
<li>Siga las técnicas asépticas para el cultivo celular de mamíferos previamente revisados38.</li>
		<li>Mantener todas las líneas celulares en una incubadora de 5% CO2 humidificada a 37 ° c. Las condiciones de cultivo celular varían para cada tipo de célula. Es importante mantener las condiciones de cultivo apropiadas para cada línea celular utilizada, ya que las variaciones de estos procedimientos conduciarán a fenotipos aberrantes y al fracaso del cultivo celular.</li>
		<li>Asegure el conocimiento con la línea celular de interés, y siga los protocolos proporcionados para cada tipo de célula seleccionada para los experimentos específicos (vea algunos ejemplos abajo).</li>
	</ol></li>
	<li>Procedimiento general para la tripsinización y el paso de las células adherentes
	<ol>
<li>Retire el medio de cultivo celular de la placa de cultivo por aspiración.</li>
		<li>Lavar las células suavemente utilizando PBS sin calcio y magnesio (5 mL por cada 10 cm2 área de superficie de cultivo). Agregue la solución de lavado al costado de la placa para evitar separar la monocapa celular; remolino la placa para maximizar la cobertura de la solución. Para las células epiteliales, es necesario incubar las células durante 10 a 15 min en la incubadora a 37 ° c en PBS para facilitar la disociación de las células en los siguientes pasos.</li>
		<li>Retire la solución de lavado por aspiración.</li>
		<li>Añadir suficiente reactivo de disociación (0,25% de tripsina) a la placa (aproximadamente 0,7 mL por 10 cm2). Gire suavemente la placa para obtener una cobertura completa de la monocapa celular.</li>
		<li>Incubar la cultura a temperatura ambiente durante 2 a 5 min. El tiempo de incubación real varía con la línea celular utilizada, en el caso de las células epiteliales se recomienda incubar durante 10 a 15 min en la incubadora a 37 ° c. Observe las células bajo el microscopio para el desprendimiento de células.</li>
		<li>Cuando la mayoría de las células se han desprendido, recuperar la suspensión celular en 5 mL del recubrimiento pre-calentado o medio de crecimiento (ver más abajo para algunos ejemplos). Disociar mecánicamente los grumos de las células pipeteando sobre la monocapa celular varias veces.</li>
		<li>Transfiera la suspensión de la célula a un tubo cónico de 15 mL y centrifugue a 1.000 x g durante 2 a 5 min. La velocidad de centrifugación y el tiempo varían en función del tipo de célula. Retire los medios por aspiración suave, teniendo cuidado de no tocar el pellet de la célula. Resuspenda el pellet de células en 5 a 10 mL del medio de crecimiento pre-calentado adecuado y extraiga una muestra para contar con un hemociómetro o un contador de células automático.</li>
		<li>Utilice el volumen adecuado de la suspensión celular para sembrar la densidad recomendada para cada línea celular específica (vea a continuación algunos ejemplos). Complementar con el volumen adecuado de medios de cultivo de acuerdo con el tamaño del plato de cultivo y colocar las células de nuevo en la incubadora.</li>
	</ol></li>
	<li>Myoblastos primarios derivado de las células satélite del ratón
	<ol>
<li>Antes de comenzar, Prepare placas recubiertas de colágeno para el crecimiento primario de myoblast. Una solución que contiene 0,02% de colágeno y 0,05 M de ácido acético en agua desionizada debe esterilizarse mediante filtración con un dispositivo de filtro estéril de 0,22 μm. Incubar las placas de cultivo con la solución de colágeno durante la noche a 37 ° c.</li>
		<li>Al día siguiente, aspirar la solución de colágeno, dejar secar las placas en el gabinete estéril y almacenar a 4 ° c hasta su uso. Nota: los volúmenes mínimos de colágeno son: para 35 mm = 1 mL; 60 mm = 2 mL; 10 cm = 5 mL.</li>
		<li>Semillas de mioblastos primarios a 1 x 104 células/cm2 en 55 cm2 placas de cultivo recubiertas de colágeno. Los medios de proliferación son el medio de cultivo de la mezcla de nutrientes F12 de Dulbecco (DMEM)/Ham, que contiene un 20% de suero bovino fetal (FBS), 25 ng/mL de factor de crecimiento fibroblástico básico recombinante (FGF) y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina. Nota: las células proliferantes y de stock deben mantenerse por debajo del 50% de la confluencia. El contacto celular induce el compromiso de las células a la diferenciación miogénica y perjudica las capacidades de crecimiento de la cultura.</li>
		<li>Para diferenciar las mioblastos primarias, permita que las células alcancen el 80% a 100% de confluencia, que normalmente ocurre después de 48 h de chapado. Luego, cambiar a medios de diferenciación (DMEM, 2% suero de caballo, 1% de insulina, transferrina, selenio un suplemento, y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina). Refresque los medios diariamente hasta la cosecha.</li>
	</ol></li>
	<li>Neuroblastoma murino (N2A)
	<ol>
<li>Placa N2A células a una densidad de 2 x 104 células/cm2 en medios de crecimiento, que contiene una mezcla de medio suero reducido/DMEM que contiene alta glucosa y L-glutamina (1:1, v:v), suplemento con 10% FBS y 100 U/ml de penicilina/estreptomicina. Mantener la cultura bursátil bajo 50% confluencia.</li>
		<li>Inducir la diferenciación de células N2A una vez confluencia alcanzó 25% a 40%. Cambio a los medios de diferenciación que contengan una mezcla de medio suero reducido/DMEM, 1% de FBS y 20 μM de ácido retinoico durante 7 a 10 días. Refresque los medios cada otro día hasta la cosecha celular. Nota: como las células N2A diferencian, algunas células se vuelven redondas, se separan fácilmente, y pueden someterse a la apoptosis. Tenga cuidado al aspirar y agregar el medio de cultivo a las placas.</li>
	</ol></li>
	<li>3T3 L1 murinos pre-adipocitos
	<ol>
<li>Mantener el ratón 3T3/L1 células en DMEM con alta glucosa, complementado con 10% FBS y 100 U/mL de penicilina/streptomicina. El proceso adipogénico depende de la confluencia de las células; por lo tanto, no deje que la cultura de la acción crezca más de 50% confluencia, como mayor confluencia perjudicará la capacidad de las células para diferenciar.</li>
		<li>Placas de las células a 2 x 104 células/cm2. A esta densidad, las células llegarán a la confluencia en 3 días.</li>
		<li>Inducir la diferenciación adipogénica dos días después de que las células alcancen el 100% de la confluencia. Los medios de inducción consisten en DMEM que contiene 10% de FBS, 10 μg/mL de insulina, 0,5 mM 3-isobutilo-1-metixantina, 1 μM de dexametasona y 10 μM de troglitazona.</li>
		<li>Reemplace los medios de inducción después de la incubación de 48 h a los medios de diferenciación (DMEM que contiene 10% de FBS y 5 μg/mL de insulina). Refresque los medios cada otro día hasta la cosecha. Muestras representativas de la diferenciación total se recogen normalmente entre 7 y 10 días después de la inducción adipogénica. Nota: a medida que la adipogénesis progresa, las células se vuelven redondas y tienden a desprenderse fácilmente. Tenga cuidado al aspirar y agregar el medio de cultivo a las placas.</li>
	</ol></li>
	<li>MCF10A celdas
	<ol>
<li>Placas MCF10A células en DMEM/F12 (1:1, v:v), complementadas con 5% de FBS, 100 U/mL de penicilina/estreptomicina, 0,5 μg/mL de hidrocortisona, 10 μg/mL de insulina y 20 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico (EGF). La densidad de siembra recomendada es de 1 x 105 células/cm2. En estas condiciones, las células alcanzarán un 100% de confluencia en un plazo de 4 días. Refresque los medios cada 2 a 3 días hasta la cosecha. Nota: las celdas MCF10A son difíciles de separar. Se recomienda incubar las células durante 10 a 15 min a 37 ° c en PBS libre de calcio con 0,5 mM EDTA antes de la tripsinización.</li>
	</ol></li>
	<li>Células de riñón canina Madin-Darby (MDCK)
	<ol>
<li>Células de placas MDCK en DMEM complementadas con 10% de FBS y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina. La densidad de siembra recomendada es de 1 x 105 células/cm2, donde las células alcanzarán un 100% de confluencia en 3 días. Refresque los medios cada 2 días hasta la cosecha. Nota: las células MDCK son difíciles de separar. Se recomienda incubar las células durante 5 a 10 min a 37 ° c en PBS libre de calcio y magnesio antes de la tripsinización. Para evitar la aglomeración de células, no agitar las placas golpeando o sacudiendo el matraz mientras espera a que las células se separen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. preparación de muestras de cultivo celular de mamíferos para AAS: fraccionamiento de células enteras y subcelulares
<ol><li>Cultivo de las células de interés en 55 cm2 placas. El uso de placas de cultivo más pequeñas puede producir muestras con niveles de metales bajo los límites de detección del GF-AAS.</li>
	<li>Extracto de células enteras<ol>
<li>Aspiran los medios de cultivo utilizando una trampa de vacío. Asegúrese de eliminar todos los rastros de los medios. Enjuague las células de los puntos de tiempo deseados o las condiciones de cultivo tres veces con PBS helada y libre de calcio y magnesio.</li>
		<li>Raspe inmediatamente las células de la placa utilizando un nuevo raspador de células plásticas en 1 mL de PBS libre de calcio y magnesio. Transferir la muestra a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y centrifugar durante 2 min a 2.000 x g y aspirar el sobrenadante. El protocolo se puede pausar aquí. Almacene muestras de pellets a-20 ° c o proceda al paso 2,4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fraccionamiento subcelular<ol>
<li>Aspiran los medios de cultivo utilizando una trampa de vacío. Asegúrese de eliminar todos los rastros de los medios. Enjuague las células de los puntos de tiempo deseados o las condiciones de cultivo tres veces con PBS helada y libre de calcio y magnesio. Raspe las células de la placa con 1 mL de PBS helada y libre de calcio y magnesio.</li>
		<li>Transfiera las muestras a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y manténgase en hielo. Centrifugar por 10 s a 10.000 x g. Continuar el aislamiento rápido de los núcleos si se desea el análisis de metales de fracciones citoplásmicas y nucleares. Este procedimiento minimizará la pérdida potencial de metales debido a la extracción de células39, 40.</li>
		<li>Retirar el sobrenadante aspirando y resuspender el pellet de células en 400 μL de PBS helado libre de calcio y magnesio, conteniendo 0,1% de Nonidet P-40 (NP-40), un detergente no iónico. Transfiera 100 μL a un nuevo tubo de microcentrífuga y Considéralo como toda la muestra de células. Esta alícuota representa el 25% de la muestra.</li>
		<li>Aísle los núcleos pipeteando la suspensión de la célula de 5 a 10 veces en el hielo con una punta de Micropipetas P1000. El aislamiento de los núcleos de las células epiteliales requiere una concentración de 0,5% NP-40. Logre la disociación celular pasando la suspensión celular a través de una aguja de 26 3/4 G 10 a 15 veces, seguida de 10 a 15 pasajes a través de una aguja de 30 1/2 G. Nota: Verifique la integridad de los núcleos mediante microscopía de luz utilizando un objetivo de 40x.</li>
		<li>Centrifugar la suspensión de lisado celular restante (300 μL) durante 10 s a 10.000 x g. El sobrenadante contendrá la fracción citosólica. Transfiera los 300 μL a un nuevo tubo de microcentrífuga.</li>
		<li>Enjuagar el pellet que contiene la fracción nuclear en 500 μL de PBS libre de calcio y magnesio, conteniendo 0,1% NP-40, luego centrifugar durante 10 s a 10.000 x g. Extraer el sobrenadante y resuspender el pellet que contiene los núcleos en 100 μL de la misma solución. Nota: el protocolo se puede pausar aquí. Las muestras se pueden almacenar a-20 ° c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lyse las células por tres ciclos de sonicación (30 s on/30 s apagado, a 50 kHz, 200 W) durante 5 min. cuantificar el contenido total de proteínas en la muestra por Bradford41.</li>
	<li>Realizar el control de calidad de la pureza de las fracciones por Western Blot utilizando anticuerpos específicos para la nuclear (histonas, remodeladores de cromatina, proteínas de matriz nuclear) o fracciones citosólicas (β-tubulina, β-actina) (figura 2). Nota: no utilice sonicadores con una punta metálica. Estos pueden contaminar la muestra con metales.</li>
</ol>3. análisis del contenido de Zn de fracciones celulares y subcelulares de cultivos celulares de mamíferos por espectroscopía de absorbancia atómica
<ol><li>Mineralizar las muestras de cultivo celular (fracciones celulares o nucleares enteras) por digestión ácida utilizando un volumen igual de concentrado de HNO3 de grado de metal (PRECAUCIÓN) para 1 h a 80 ° c, luego durante la noche a 20 ° c.</li>
	<li>Detenga la reacción añadiendo un 30% del volumen de reacción de H2O2. Lleve el volumen de la muestra a 500 μL con agua purificada de 18 MΩ. Nota: el manejo de HNO3 debe realizarse con gafas de seguridad químicas, un protector facial para protección contra salpicaduras, guantes y un respirador de vapor aprobado si no se dispone de una ventilación adecuada (campana extractora). El protocolo se puede pausar aquí. Las muestras se pueden almacenar a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Prepare soluciones estándar y muestras experimentales para mediciones de Zn por AAS equipadas con un horno de grafito.<ol>
<li>Utilice un 2% (v/v) de HNO3 solución en agua desionizada, procedente del mismo lote utilizado para la curva estándar como la solución en blanco para la calibración en todo. Utilice estándares de grado analítico diluidos en agua purificada de 18 MΩ.</li>
		<li>Prepare un estándar de 1.000 ppb de Zn a partir de una solución de stock de 1.000 ppm de Zn disponible comercialmente con una solución de HNO3 de 2% (v/v) en agua desionizada. Prepare soluciones estándar de trabajo a partir del estándar 100 ppb diluyendo a 5, 8, 10, 15, 20 y 25 ppb directamente con una solución de HNO3 de 2% (v/v) en agua desionizada. Prepare los estándares de Zn y el espacio en blanco con un modificador de matriz de 0,1% (1 g/L) mg (NO3)2 . Nota: el LOD de Zn es 0,01 ppb (μg/L). Al aumentar la concentración de las normas, se determinó que el límite de linealidad de Zn era de 20 ppb (figura 3).</li>
		<li>Mida el estándar y las muestras bajo las mismas condiciones optimizadas: caudal de introducción de 250 mL/min, temperatura de inyección de 20 ° c y temperatura de GF de 1.800 ° c. Nota: la temperatura del GF se incrementó a 2450 ° c para los pasos de limpieza, antes de la inyección de una nueva muestra o estándar.</li>
		<li>Optimizar la lámpara (C-HCL) a una corriente de 20 A, longitud de onda de 213,9 NM, y hendidura de 0,7 nm.</li>
		<li>Mida las muestras mineralizadas utilizando la curva estándar Zn para determinar el contenido metálico. A medida que se miden pequeños volúmenes, las muestras pueden evaporarse si las mediciones toman largos periodos de tiempo. Por lo tanto, se recomienda añadir agua a las muestras. Diluir las muestras con 18 MΩ de agua purificada tratada con 0,01% HNO3 (grado analítico) si los datos obtenidos están más allá del LOD. Nota: típicamente, las muestras se diluyen a un volumen de 500 μL, colocado en el muestreador automático del AAS para ser medido justo después de que se establezca la curva estándar. El volumen requerido debe ser determinado por el usuario y debe tener en cuenta los cálculos finales de las concentraciones. Se recomienda terminar las determinaciones de Zn por AAS de un experimento completo en un intento. Pausar las mediciones puede llevar a grandes variaciones experimentales e inconsistencias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Convierta las mediciones de ppb a la molaridad obtenida de Zn medida a través de AAS. Considere la masa de Zn (65,39 AMU). Divida la cantidad de ppb obtenida por AAS por 63.390.000. En las células, las concentraciones de Zn oscilan entre las unidades de pmol a μmol.<ol>
<li>Divida la concentración de Zn (pmol o μmol) por la masa inicial de proteína en la muestra determinada por Bradford (paso 2,4). Este cálculo representará la cantidad de metal (pmol o μmol Zn) contenida por mg de proteína de la muestra. Nota: es importante tener en cuenta los factores de dilución utilizados durante las determinaciones metálicas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La espectroscopía de absorbancia atómica es un método altamente sensible para la cuantificación de Zn en muestras biológicas de volumen pequeño/masa. La optimización descrita de la medición de Zn hace que la aplicación de este método sea simple y garantiza condiciones analíticas ideales. Aquí, utilizando GF-AAS, determinamos la concentración de Zn en células enteras, y en fracciones citosólicas y nucleares, de diferentes líneas celulares. Los resultados demuestran que esta técnica es comparable a la obtenida por sondas f...

La transición y los metales pesados, como Zn, Cu, Mn y fe, se encuentran de forma natural en el medio ambiente, tanto en nutrientes como en alimentos y contaminantes. Todos los organismos vivos requieren diferentes cantidades de estos micronutrientes; sin embargo, la exposición a niveles elevados es perjudicial para los organismos. La adquisición de metal es principalmente a través de la dieta, pero los metales también pueden ser inhalados o absorbidos a través de la piel1,2,3,4,5. Es importante señalar que la presencia de metales en las partículas atmosféricas está aumentando y se ha asociado en gran medida a los riesgos para la salud. Debido a las actividades antropogénicas, se han detectado niveles crecientes de metales pesados como AG, como, CD, CR, Hg, ni, fe y Pb en las partículas atmosféricas, el agua de lluvia y el suelo6,7. Estos metales tienen el potencial de competir con oligoelementos fisiológicos esenciales, particularmente Zn y fe, e inducen efectos tóxicos al inactivar las enzimas fundamentales para los procesos biológicos.
El oligoelemento Zn es redox neutro y se comporta como un ácido Lewis en las reacciones biológicas, lo que lo convierte en un cofactor fundamental necesario para la actividad de plegado y catalítico de proteínas en más del 10% de las proteínas de mamíferos8,9, 10; en consecuencia, es esencial para las diversas funciones fisiológicas8,11. Sin embargo, como muchos oligoelementos, hay un delicado equilibrio entre estos metales facilitando la función fisiológica normal y causando toxicidad. En los mamíferos, las deficiencias de Zn conducen a anemia, retraso del crecimiento, hipogonadismo, anomalías de la piel, diarrea, alopecia, trastornos del gusto, inflamación crónica, y las funciones inmunes y neurológicas deterioradas11,12, 13,14,15,16,17,18. En exceso, el Zn es citotóxico y perjudica la absorción de otros metales esenciales como el cobre19,20,21.
Además, algunos metales como Cu y fe tienen el potencial de participar en reacciones dañinas. La producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) a través de Fenton química puede interferir con el montaje de proteínas de racimo de azufre de hierro y alterar el metabolismo lipídico22,23,24. Para evitar este daño, las células utilizan chaperones de unión metálica y transportadores para prevenir efectos tóxicos. Sin lugar a dudas, la la homeostasis metálica debe controlarse estrechamente para garantizar que los tipos celulares específicos mantengan los niveles adecuados de metales. Por esta razón, hay una necesidad significativa de avanzar técnicas para la medición precisa de trazas de metales en muestras biológicas. En los organismos en desarrollo y maduros existe una necesidad biológica diferencial para oligoelementos a nivel celular, en diferentes etapas de desarrollo, y en condiciones normales y patológicas. Por lo tanto, la determinación precisa de los niveles de tejido y del metal sistémico es necesaria para entender la homeostasis del metal organismal.
La espectrometría de absorción atómica del horno de grafito (GF-AAS) es una técnica altamente sensible utilizada para pequeños volúmenes de muestras, por lo que es ideal para medir la transición y metales pesados presentes en muestras biológicas y medioambientales25,26 , 27 , 28. por otra parte, debido a la alta sensibilidad de la técnica, se ha demostrado que es adecuada para el estudio de las propiedades de transporte fino de na+/k+-ATPasa yH+/k-ATPasa gástrica ovocitos como un sistema modelo29. En GF-AAS, los elementos atomizados dentro de una muestra absorben una longitud de onda de la radiación emitida por una fuente de luz que contiene el metal de interés, con la radiación absorbida proporcional a la concentración del elemento. La excitación electrónica elemental tiene lugar tras la absorción de la radiación ultravioleta o visible en un proceso cuantizado único para cada elemento químico. En un solo proceso de electrones, la absorción de un fotones implica un electrón que se mueve desde un nivel de energía más bajo al nivel más alto dentro del átomo y GF-AAS determina la cantidad de fotómetros absorbidos por la muestra, que es proporcional al número de radiación que absorbe elementos atomizados en el tubo de grafito.
La selectividad de esta técnica se basa en la estructura electrónica de los átomos, en el que cada elemento tiene una línea espectral de absorción/emisión específica. En el caso de Zn, la longitud de onda de absorbancia es de 213,9 NM y se puede distinguir con precisión de otros metales. En general, GF-AAS se puede utilizar para cuantificar Zn con límites adecuados de detección (LOD) y alta sensibilidad y selectividad25. Los cambios en la longitud de onda absorbida se integran y se presentan como picos de absorción de energía en longitudes de onda específicas y aisladas. La concentración del Zn en una muestra determinada se calcula generalmente a partir de una curva estándar de concentraciones conocidas según la ley cerveza-Lambert, en la que la absorbancia es directamente proporcional a la concentración de Zn en la muestra. Sin embargo, aplicar la ecuación de Beer-Lambert a los análisis de GF-AAS también presenta algunas complicaciones. Por ejemplo, las variaciones en la atomización y/o concentraciones no homogéneas de las muestras pueden afectar las mediciones de metal.
La atomización metálica necesaria para el análisis elemental de trazas GF AAS consta de tres pasos fundamentales. El primer paso es la desolvación, donde se evada el disolvente líquido; dejando compuestos secos después de que el horno alcanza una temperatura de alrededor de 100 ° c. Luego, los compuestos se vaporizan calentándolos de 800 a 1.400 ° c (dependiendo del elemento a analizar) y convertirse en un gas. Finalmente, los compuestos en estado gaseoso se atomizan con temperaturas que oscilan entre 1.500 y 2.500 ° c. Como se discutió anteriormente, el aumento de las concentraciones de un metal de interés representará aumentos proporcionales en la absorción detectada por el GF-AAS, sin embargo, el horno reduce el rango dinámico de análisis, que es el rango de trabajo de las concentraciones que se pueden determinado por el instrumento. Por lo tanto, la técnica requiere bajas concentraciones y una cuidadosa determinación del rango dinámico del método mediante la determinación del LOD y el límite de linealidad (LOL) de la ley Beer-Lambert. El LOD es la cantidad mínima requerida para detectar una sustancia, definida como tres veces la desviación estándar de Zn en la matriz. El LOL es la concentración máxima que se puede detectar utilizando la ley de cerveza-Lambert.
En este trabajo, describimos un método estándar para analizar los niveles de Zn en extractos celulares enteros, fracciones citoplásmicas y nucleares, y en células cultivadas proliferantes y diferenciadoras (figura 1). Adaptamos el rápido aislamiento del Protocolo de núcleos a diferentes sistemas celulares para evitar la pérdida de metal durante la preparación de la muestra. Los modelos celulares utilizados fueron myoblastos primarios derivados de las células del satélite del ratón, células del neuroblastoma murino (N2A o Neuro2A), murino 3T3 L1 adipocitos, una línea de células epiteliales de mama no tumorigénica humana (MCF10A), y el riñón canino de Madin-Darby epitelial ( MDCK). Estas células se establecieron a partir de diferentes linajes y son buenos modelos para investigar variaciones específicas del linaje de los niveles de metal in vitro.
Las mioblastos primarias derivadas de las células satélite del ratón constituyen un modelo in vitro muy adecuado para investigar la diferenciación del músculo esquelético. La proliferación de estas células es rápida cuando se cultiva en condiciones séricas elevadas. La diferenciación en el linaje muscular se induce entonces por las condiciones séricas bajas30. El neuroblastoma murino (N2A) estableció la línea celular se derivó de la cresta neural del ratón. Estas células presentan morfología neuronal y de células madre amoeboides. Al estímulo de diferenciación, las células N2A presentan varias propiedades de las neuronas, como los neurofilamentos. N2A células se utilizan para investigar la enfermedad de Alzheimer, neurita outgrowth, y neurotoxicidad31,32,33. El 3T3-L1 murino pre-adipocitos establecido línea celular se utiliza comúnmente para investigar los cambios metabólicos y fisiológicos asociados con la adipogénesis. Estas células presentan una morfología de fibroblastos, pero una vez estimuladas para la diferenciación, presentan activación enzimática asociada con la síntesis de lípidos y la acumulación de triglicéridos. Esto se puede observar como cambios morfológicos para producir gotas de lípidos citoplásmicos34,35. MCF10A es una línea de células epiteliales mamarias no tumorales derivada de una mujer premenopáusica con enfermedad fibroquística mamaria36. Ha sido ampliamente utilizado para los estudios bioquímicos, moleculares, y celulares relacionados con la carcinogénesis mamaria como la proliferación, migración celular, y la invasión. La línea celular epitelial del riñón de Madin-Darby (MDCK) se ha utilizado extensivamente para investigar las propiedades y los eventos moleculares asociados con el establecimiento del fenotipo epitelial. Al llegar a la confluencia, estas células se polarizan y establecen adherencias de células celulares, características de los tejidos epiteliales de mamíferos37.
Para probar la capacidad de AAS para medir los niveles de Zn en células de mamíferos, analizamos fracciones enteras y subcelulares (citosol y núcleo) de estas cinco líneas celulares. Las mediciones de AAS mostraron diferentes concentraciones de Zn en estos tipos de células. Las concentraciones fueron menores en la proliferación y diferenciación de las mioblastos primarias (4 a 7 nmol/mg de proteína) y superiores en las cuatro líneas celulares establecidas (que oscilan entre 20 y 40 nmol/mg de proteína). Se detectó un pequeño aumento no significativo en los niveles de Zn en la diferenciación de las células mioblastos primarias y del neuroblastoma en comparación con las células proliferantes. El efecto opuesto se detectó en adipocitos diferenciados. Sin embargo, proliferando células 3T3-L1 mostraron concentraciones más altas del metal en comparación con las células diferenciadas. Es importante destacar que, en estas tres líneas celulares, el fraccionamiento subcelular demostró que Zn se distribuye de forma diferencial en el citosol y el núcleo de acuerdo con el estado metabólico de estas células. Por ejemplo, en mioblastos proliferantes, células N2A y preadipocitos 3T3-L1, la mayoría del metal se localiza en el núcleo. Tras la inducción de la diferenciación utilizando tratamientos celulares específicos, Zn localizada en el citosol en estos tres tipos de células. Curiosamente, ambas líneas celulares epiteliales mostraron niveles más altos de Zn durante la proliferación en comparación con al alcanzar la confluencia, en el que se formó una monocapa ajustada característica. En las células epiteliales proliferantes, la línea de células mamarias MCF10A tenía una distribución de Zn igual entre el citosol y el núcleo, mientras que en la línea celular derivada del riñón, la mayor parte del metal se encontraba en el núcleo. En estos dos tipos celulares, cuando las células alcanzaron la confluencia, Zn se encontraba predominantemente en el citosol. Estos resultados demuestran que GF-AAS es una técnica altamente sensible y precisa para realizar análisis elementales en muestras de bajo rendimiento. GF-AAS junto con fraccionamiento subcelular y puede ser adaptado para investigar los niveles de oligoelementos metálicos en diferentes líneas celulares y tejidos.

<table><tbody><tr><td>3-isobutil-1-metilxantina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1005706</td><td></td></tr><tr><td>Anti Brg1-anticuerpo (G7)</td><td>Santa Cruz biotechnologies</td><td>sc-17796</td><td></td></tr><tr><td>Anti b-tubulina-anticuerpo (BT7R)</td><td>Thermo Scientific</td><td>MA5-16308</td><td></td></tr><tr><td>Bradford</td><td>Biorad</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mix (DMEM/F12)</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Sano (DPBS)</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento epidemal (EGF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>factor de crecimiento fibroblástico-básico (FGF) (AA 10-155)</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>PHG0024</td><td></td></tr><tr><td>suero de caballo</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>16050122</td><td></td></tr><tr><td>hidrocortisona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno (H2O2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>95321</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>91077C</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-Transferrina-Selenio-A</td><td>ThermoFischer</td><td>51300044</td><td></td></tr><tr><td>Ácido nítrico (HNO3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>438073</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 (NP-40)</td><td>Thermo Scientific</td><td>85125</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM (medios séricos reducidos)</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>PureCol (Colágeno)</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5005</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Reiónico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PHR1187</td><td></td></tr><tr><td>Troglitazona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>648469-M</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), rojo</td> <td>fenolThermoFischer-Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>zinc (Zn) puro de un solo elemento estándar, 1.000 &micro; g/mL, 2% HNO3</td><td>Perkin Elmer</td><td>N9300168</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Establecido Líneas Celulares</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3T3-L1 Colección de</td><td>Cultivos Tipo Americano</td><td>CL-173</td><td></td></tr><tr><td>MCDK</td><td>Colección de Cultura de Tipo Americano</td><td>CCL-34</td><td></td></tr><tr><td>MCF10A</td><td>Colección de Cultura de Tipo Americano</td><td>CRL-10317</td><td></td></tr><tr><td>N2A</td><td>Americano Tipo Colección</td><td>de cultivos CCL-131</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Equipo</fuerte></td>espectrofotómetro de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>absorción atómica</td><td>PerkinElmer</td><td>Aanalyst 800</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor</td><td>Diagnode</td><td>UCD-200</td><td></td></tr></tbody></table>

espectroscopía de absorbancia atómica para medir las agrupaciones intracelulares de zinc en células de mamífero

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Los metales de transición son micronutrientes esenciales para los organismos, pero pueden ser tóxicos para las células a altas concentraciones al competir con los metales fisiológicos en las proteínas y generar estrés redox. Las afecciones patológicas que conducen a la depleción o acumulación de metales son agentes causales de diferentes enfermedades humanas. Algunos ejemplos incluyen anemia, Acrodermatitis enteropatica, y las enfermedades de Wilson y Menkes. Por lo tanto, es importante poder medir los niveles y el transporte de metales de transición en muestras biológicas con alta sensibilidad y precisión con el fin de facilitar la investigación explorando cómo estos elementos contribuyen a las funciones fisiológicas normales y Toxicidad. El zinc (Zn), por ejemplo, es un cofactor en muchas proteínas de mamíferos, participa en eventos de señalización, y es un mensajero secundario en las células. En exceso, Zn es tóxico y puede inhibir la absorción de otros metales, mientras que en el déficit, puede conducir a una variedad de condiciones potencialmente letales.

La espectroscopía de absorción atómica del horno de grafito (GF-AAS) proporciona un método altamente sensible y eficaz para determinar la concentración de Zn y otras concentraciones de metales de transición en muestras biológicas diversas. La atomización electrotérmica mediante GF-AAS cuantifica los metales mediante la atomización de pequeños volúmenes de muestras para el posterior análisis selectivo de la absorción mediante la longitud de onda de la excitación del elemento de interés. Dentro de los límites de la linealidad de la ley de la cerveza-Lambert, la absorbancia de la luz por el metal es directamente proporcional a la concentración del analito. En comparación con otros métodos de determinación del contenido de Zn, GF-AAS detecta tanto el Zn en las proteínas libres como los complejados y posiblemente en pequeñas moléculas intracelulares con alta sensibilidad en pequeños volúmenes de muestras. Por otra parte, GF-AAS es también más fácilmente accesible que la espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) o fluorescencia de rayos X basada en sincrotrón. En este método, se describe la preparación sistemática de muestras de diferentes líneas celulares cultivadas para análisis en un GF-AAS. Las variaciones en este oligoelemento se compararon tanto en los lisados celulares enteros como en las fracciones subcelulares de células proliferantes y diferenciadas como prueba de principio.

Probamos la capacidad del GF-AAS para detectar los niveles de los minutos de Zn en las células de mamíferos (figura 1). Así, cultivamos las mioblastos primarias derivadas de las células satélite del ratón, y las líneas celulares establecidas N2A (neuroblastoma derivado), 3T3 L1 (adipocitos), MCF10A (epitelio mamario) y células MDCK (epitelio renal del perro). En primer lugar, aislamos fracciones de células enteras, citosólicas y nucleares de todos estos tipos...

Las líneas celulares cultivadas primarias o establecidas se utilizan comúnmente para abordar las cuestiones biológicas y mecanicistas fundamentales como un enfoque inicial antes de usar modelos animales. Este protocolo describe cómo preparar extractos celulares enteros y fracciones subcelulares para estudios de zinc (Zn) y otros oligoelementos con espectroscopía de absorbancia atómica.

Espectroscopía de absorbancia atómica para medir las agrupaciones intracelulares de zinc en células de mamífero

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

El papel de los metales de transición en el desarrollo de mamíferos está en gran medida subestimado. La evidencia emergente muestra que la homeostasis metálica continúa cambiando de acuerdo con la etapa de desarrollo de las células y tejidos. Además, los destinos celulares específicos de los metales también son varietales en desarrollo, y por supuesto, es difícil identificar su ubicación.Hasta la fecha, se han desarrollado diferentes técnicas analíticas para cuantificar metales, pero la mayoría son caros o inaccesibles. La investigación intensiva se centra en mejorar las determinaciones de metales de una manera más accesible y eficiente. La espectroscopia de absorción atómica del horno de grafito, GF-AAS, tiene dos ventajas principales.Proporciona bajos límites de detección de zinc, lo que permite un análisis preciso del zinc traza. También es una técnica que no requiere grandes volúmenes de muestra, los microlitros de solución tienden a ser suficientes para llevar a cabo el análisis. La combinación de estas dos ventajas hace que GF-AAS sea ideal para analizar oligoelementos en muestras de bajo volumen.Varias condiciones patológicas humanas están relacionadas con despejas de metales. Algunos ejemplos son la anemia, la acrodermatitis enteropatica y las enfermedades de Wilson y Menkes. Por lo tanto, es importante desarrollar métodos eficientes y fiables para medir los niveles de metales de transición en muestras biológicas con alta sensibilidad y precisión.GF-AAS es un excelente ejemplo en una tecnología que facilita la determinación de cualquier metal dado en condiciones fisiológicas normales, y en casos patógenos. El método es muy versátil. Se puede aplicar a muchos sistemas y muchos elementos se pueden análisis utilizando GF-AAS.Los retos son establecer el límite de método de detección en la realidad, asegurándose de que las muestras estén dentro de este límite. Dado el hecho de que el volumen de muestras es bajo, no hay mucho espacio para las pruebas, por lo que el examen cuidadoso de los datos debe tener lugar desde el principio. Después del primer análisis de muestras, necesitamos establecer cuál es el factor de dilución necesario para llevar las muestras a los límites requeridos para la cuantificación.Asegúrese de que usted es capaz de fraccionar los núcleos correctamente antes de ir al AAS. Las manchas occidentales son siempre una buena validación antes del análisis espectroscópico. Mientras que GF-AAS requiere volúmenes bajos, las piscinas intracelulares ya están en volúmenes bajos.Eso da poco espacio para las pruebas. Las primeras mediciones deben realizarse y examinarse cuidadosamente, por lo que el tratamiento de la muestra puede minimizarse a un solo factor de dilución. Para empezar, cultivo de las células de interés en placas de 55 centímetros cuadrados.Utilice una trampa de vacío para aspirar los medios de cultivo. Asegúrese de eliminar todos los rastros de medios. Use PBS frío libre de calcio y magnesio para enjuagar las células de los puntos de tiempo deseados, o condiciones de cultivo, tres veces.Luego agregue un mililitro de PBS helado a la placa, y raspe las células de la placa. Transfiera las suspensiones celulares a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y manténgala en hielo. Centrifugar durante 10 segundos a 10.000 veces G, y retire el sobrenadante por aspiración.Si se desea un análisis metálico de fracciones citoprásmicas y nucleares, resuspender el pellet celular en 400 microlitros de PBS helado que contiene 0.1%NP-40, un detergente no iónico. Transfiera 100 microlitros a un nuevo tubo de microcentrífuga como muestra de celda entera, y guárdelo a menos 20 grados centígrados. Para aislar los núcleos, utilice una punta de micropipeta P1000 para pipetear la suspensión de celda de 400 microlitrados hacia arriba y hacia abajo de cinco a 10 veces en hielo.A continuación, extraiga cinco microlitros de la suspensión celular y transfiéralos a un portaobjetos de vidrio del microscopio. Coloque las cinco microlitros bajo un microscopio de luz utilizando un objetivo de 40 veces para verificar la integridad de los núcleos. Centrifugar la suspensión de izado de celda de microlitros restante durante 10 segundos a 10.000 veces G.Transfiera el sobrenadante que contiene la fracción citosólica a un nuevo tubo de microcentrífuga.A continuación, agregue 500 microlitros del PBS que contengan 0,1%NP-40 para enjuagar el pellet con la fracción nuclear, y centrifugar durante 10 segundos a 10.000 veces G.Retire el sobrenadante, y resuspendir el pellet que contiene los núcleos en 100 microlitros de la misma solución. Para alliceerar las células, utilice un Bioruptor para sonicar toda la célula y núcleos que contienen solución tres veces, cada uno durante cinco minutos. Proceder a realizar el control de calidad de la pureza de las fracciones por mancha occidental, utilizando anticuerpos específicos para las fracciones nucleares o citosólicas.En primer lugar, añadir un volumen igual de ácido nítrico concentrado de grado de traza metálica a toda la célula, fracciones citoplasmas y nucleares que contengan 100, 500 y 100 microlitros de suspensión celular en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros, y colóquelos en un bloque térmico a 80 grados centígrados para mineralizar el cultivo celular durante una hora. Después de eso, saque los tubos del bloque térmico y colóquelos en un estante para continuar la digestión ácida durante la noche a 20 grados centígrados. Detenga la reacción añadiendo el 30% del volumen de la muestra de peróxido de hidrógeno.Lleve el volumen de la muestra a 500 microlitros con 18 mega de agua purificada Ohm. A continuación, en un tubo Falcon de 15 mililitros diluye el óxido nítrico estándar de grado analítico en agua purificada a 18 mega ohmios para preparar una solución de ácido nítrico de dos por ciento de volumen como solución en blanco durante la calibración. A continuación, utilice la solución de ácido nítrico de dos volúmenes por ciento para diluir una solución de stock de zinc de 1.000 ppm disponible comercialmente con una concentración de 1.000 partes por mil millones.Prepare soluciones estándar de trabajo a partir de la solución estándar de 1.000 partes por millón de zinc, la solución de 1.000 partes por mil millones y luego diluya a 5, 8, 10, 15, 20 y 25 ppb directamente con una solución de ácido nítrico de 2% de volumen. Coloque un mililitro de 0.1%modificador de matriz de nitrato de magnesio en vasos de muestra de polipropileno, y luego cargue las tazas en el carrusel automuestreador. Programe el espectrómetro de absorción atómica para añadir automáticamente cinco microlitros del modificador de matriz a los estándares de zinc y al espacio en blanco.Establezca la misma condición optimizada en el espectrómetro de absorción atómica para las soluciones estándar y las muestras, con un caudal de introducción de 250 mililitros por minuto, una temperatura de inyección de 20 grados centígrados y una temperatura del horno de grafito que alcanza los 1.800 grados centígrados en cuatro procesos de paso. Todos los estándares y muestras de un solo experimento deben medirse al mismo tiempo para evitar errores debido a diferencias de calibración o evaporación. Optimice la lámpara C-HCL a una corriente de 20 amperios, longitud de onda de 213,9 nanómetros y ranura de 0,7 nanómetros.Pipetear las muestras en tazas de muestra de polipropileno y colocarlas en el carrusel del automuestreador. El límite inferior de detección de zinc es de 0,01 partes por mil millones. Al aumentar la concentración de las normas, se determina que el límite superior de detección de zinc es de 20 partes por mil millones.Después de obtener una curva estándar de zinc, mida las muestras mineralizadas para determinar el contenido de metal. Si los datos obtenidos están más allá del límite de detección, diluya las muestras con 18 mega Ohm de agua purificada tratadas con 0,1% de ácido nítrico de grado analítico. En este rápido aislamiento del protocolo de núcleos, una mancha occidental representativa de la diferenciación de los mioblastos primarios muestra la pureza de las fracciones subcelulares.La enzima remodeladora de cromatina Brg1 se utilizó para identificar la fracción nuclear, y la tubulina se utilizó para identificar la fracción citosólica. Esta figura muestra micrografías ligeras representativas para las monocapas proliferantes y diferenciadas o confluentes de cada tipo de célula, y el contenido de zinc correspondiente en extractos de células enteras, fracciones citosólicas y nucleares. Todas las líneas celulares analizadas en este estudio mostraron concentraciones de zinc en el rango nanomolar.Los miotubos primarios diferenciados exhibieron niveles más altos de zinc que las células proliferantes. Se detectó una distribución subcelular similar de zinc en la línea celular derivada del neuroblastoma N2A. Por otro lado, la línea celular 3T3-L1 establecida presentaba niveles más altos de zinc cuando los pre-adipocitos proliferaban que cuando fueron inducidos o diferenciados.Las células MCF10A mostraron niveles iguales de zinc entre las fracciones citosólicas y nucleares en las células proliferantes. Una vez que las células MCF10A alcanzan la confluencia, se detectó una disminución del 40% en los niveles de zinc de células enteras, y se encontró que el metal estaba más concentrado en la fracción citosólica. La espectrometría de absorción atómica del horno de grafito es una técnica altamente sensible para medir la transición y los metales pesados en muestras biológicas y ambientales.Se debe tener especial cuidado y limpieza en la preparación de fracciones subcelulares, ya que la contaminación mínima probablemente interferirá con el análisis, debido a la sensibilidad del equipo. Dados los bajos volúmenes y trazas de metales en cada experimento, es difícil pensar en una técnica mejor y más precisa para medir el zinc que el GF-AAS. No hay técnicas actuales que puedan proporcionar los límites de detección y bajo volumen requeridos a un costo relativamente bajo de GF-AAS.La espectrometría de absorción atómica del horno de grafito es precisa, sensible, rentable y accesible. Esta técnica analítica seguirá mejorando a medida que las tecnologías de detección elemental sigan avanzando. La aplicación futura para la detección de zinc y otros metales por GF-AAS incluirá órganos, tejidos obtenidos de modelos animales y biopsias de pacientes con enfermedad asociada con desequilibrios metálicos sistémicos.El ácido nítrico es un ácido extremadamente corrosivo capaz de causar quemaduras químicas graves muy rápidamente. Este producto químico también puede reaccionar violentamente con ciertos compuestos como polvos metálicos. Debido al peligro que supone el ácido nítrico, es importante tomar estrictas medidas de seguridad siempre que manipule ácido nítrico.Al manipular ácido nítrico, le recomendamos encarecidamente que use gafas químicas de seguridad, protector facial para la protección contra salpicaduras, guantes y respiración de vapor aprobada si la ventilación no es adecuada.

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